專利名稱：人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶a合成酶的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及作為人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶A合成酶(ACS)抑制劑。
背景技術(shù)：
艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，能產(chǎn)生毒 素A和毒素B，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉、假膜性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌及其它嚴(yán)重疾病，統(tǒng)稱為CDAD。這種病 多發(fā)于在醫(yī)院里服用了抗生素的病人，在北美和歐洲已流行多年，病例年年增加，僅以美國 為例，CDAD的診斷病例在2001-2005的4年間增長了 1倍，2006年報(bào)道的病例高達(dá)300，000 例。近年來CDAD已經(jīng)蔓延到澳大利亞和亞洲的日本、中國臺灣等地，并且有向全世界范圍 內(nèi)擴(kuò)散的趨勢。目前，用于治療CDAD的藥物主要是兩種口服抗生素萬古霉素和甲硝唑。萬古霉 素已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)為CDAD的治療藥物，但是在其使用過程中存在嚴(yán)重副作用，對患者 的肝、腎功能等有較為嚴(yán)重的損害，而且價(jià)格昂貴。甲硝唑目前尚未獲得FDA批準(zhǔn)，但由于 其價(jià)格低廉，是目前最普遍采用的治療藥物。其它使用的抗生素包括慶大霉素、亞胺培南 (β -內(nèi)酰胺類抗生素)、紅霉素、克拉霉素和環(huán)丙沙星等。但是這些抗生素的使用已經(jīng)導(dǎo)致 了嚴(yán)重的抗藥性問題，并且都會(huì)不同比例(15%到35%)的使已經(jīng)治愈的病人復(fù)發(fā)CDAD。這 些復(fù)發(fā)的病人再使用這些廣譜抗生素治療已經(jīng)沒有任何療效，如果沒有其他的治療手段， 將導(dǎo)致病人病情惡化甚至死亡。科學(xué)家們已經(jīng)普遍意識到這個(gè)問題，有針對性的開發(fā)新的治療藥物已經(jīng)迫在眉 睫，但是由于艱難梭菌極度厭氧，在該病原體的基因組序列于2006年被完全測定前，對它 的研究一度陷于困境。因此目前對艱難梭菌的研究大多數(shù)都集中在毒素A和毒素B的研究 領(lǐng)域中。開發(fā)藥物的方向也主要集中于如何降低甚至中和毒素A和毒素B的毒性。例如美 國健贊公司(Genzyme Corp)開發(fā)的tolevamer，已經(jīng)進(jìn)入三期臨床。但是這類藥物只能用 于減輕患者的癥狀，無法抑制或者殺死病原體，因此只能作為一種輔助的治療手段。要徹底 根治CDAD，必須有針對性的開發(fā)新藥物，提出新的治療思路。基因組序列的完全測定極大的方便了人們對它的研究，序列分析表明在艱難梭菌 中含有一種目前只在厭氧細(xì)菌中存在的乙酰輔酶A合成酶(ACS)。乙酰輔酶A是物質(zhì)和能 量代謝的重要物質(zhì)，在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。ACS催化乙酰輔酶A的合 成，是艱難梭菌乙酰輔酶A合成通路中的關(guān)鍵金屬酶。如果該酶的活性被抑制，將導(dǎo)致病原 體艱難梭菌不能正常進(jìn)行能源和物質(zhì)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致其生長被抑制甚至死亡。因此，對ACS 的活性抑制研究，可能找到殺死和抑制艱難梭菌的生長和疾病防治的潛在藥物，該酶可以 作為治療CDAD的一種潛在藥物靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種病原體艱難梭菌乙酰輔酶A合成酶(ACSed)的活性抑制齊IJ，作為抑制艱難梭菌的生長和疾病防治的用藥物。乙酰輔酶A合成酶的活性中心由Fe4S4和雙核鎳兩部分組成。研究發(fā)現(xiàn)該酶中的 鎳在螯合劑的作用下易被脫去，從而導(dǎo)致ACS的活性降低甚至被完全抑制。常用的螯合劑 有1，10_鄰菲咯啉(I)、2，2-聯(lián)吡啶(II)和8-羥基喹啉(III)。其中，8-羥基喹啉是已在
二期臨床上應(yīng)用的藥物，用于治療阿爾茲海默癥。這種螯合劑的結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 4</formula>本發(fā)明的螯合劑作為ACS抑制劑的驗(yàn)證步驟如下本發(fā)明以下操作均在厭氧手套箱中完成。首先配制一定濃度的檸檬酸鈦溶液，并 用鐵氰化鉀標(biāo)定其精確濃度。然后分別配制一定體積的ΙΟμΜ的甲基鈷鐵硫蛋白(CoFeSP) 和ImM的檸檬酸鈦混合溶液以及20μ MWACSm^P ImM的檸檬酸鈦混合溶液，結(jié)合半小時(shí)以 上。使用截流分光光譜儀(Stopped-flow)檢測ACSed的甲基轉(zhuǎn)移活性，作為空白對照。用無水乙醇分別配好IM濃度的螯合劑1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯(lián)吡啶和8-羥基 喹啉。取出一定體積無水乙醇以及同等體積的上述螯合劑分別加入到ΙΟμΜ的甲基鈷鐵 硫蛋白(CoFeSP)和ImM的檸檬酸鈦混合溶液中，結(jié)合一小時(shí)以上。使用截流分光光譜儀 (Stopped-flow)檢測ACSed的甲基轉(zhuǎn)移活性，發(fā)現(xiàn)在ImM的濃度下，1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯(lián) 吡啶和8-羥基喹啉均能有效抑制ACS。d的甲基轉(zhuǎn)移活性，抑制率均接近100%，而同等體積 的無水乙醇沒有抑制作用。本發(fā)明使用的甲基鈷鐵硫蛋白提取自產(chǎn)乙酸菌Clostridium thermoaceticum ； ACScd通過基因重組得到。本發(fā)明用的檸檬酸鈦溶液為檸檬酸鈦的tris緩沖溶液(pH為8.0)，其作用是將甲 基鈷鐵硫蛋白和ACS。d還原為活性狀態(tài)，其還原能力非常適合本實(shí)驗(yàn)操作，而且對反應(yīng)無抑 制影響。具體配制方法為(1)稱取一定量的檸檬酸鈉配制成0. 5M的溶液；(2)配制一定量 的IM Tris緩沖溶液(pH為8. 0) ； (3)配制50mM鐵氰化鉀溶液；(4)稱取0. 02 0. 05g三 氯化鈦加3mL 0.5M的檸檬酸鈉溶液充分溶解后，加入等量的IM Tris緩沖溶液混合均勻， 用50mM鐵氰化鉀溶液標(biāo)定其濃度。本發(fā)明使用了截流分光光譜儀監(jiān)測抑制實(shí)驗(yàn)。這是因?yàn)榻亓鞴庾V儀可以監(jiān)測毫秒 級別的反應(yīng)，這是目前條件下其它實(shí)驗(yàn)手段很少能夠?qū)崿F(xiàn)的。


圖1為抑制劑抑制ACS。d的甲基轉(zhuǎn)移活性圖示
具體實(shí)施例方式以8-羥基喹啉為例，其具體操作過程如下首先配制檸檬酸鈦溶液，并用鐵氰化鉀標(biāo)定其精確濃度為15. 8mM。稱取145mg 8-羥基喹啉，用ImL無水乙醇溶解。提取的甲基鈷鐵硫蛋白(CoFeSP)其濃度為40 μ Μ, ACScd為198 μ Μ。配制1.211^反應(yīng)溶液六，其中含有2(^11 ACS。d、ImM檸檬酸鈦、以及50mM tris緩 沖溶液(pH = 8. 0)，結(jié)合半小時(shí)后加入IyL IM 8-羥基喹啉結(jié)合1小時(shí)以上；配制1. 2mL 反應(yīng)溶液B，其中含有10 μ M CoFeSPUmM檸檬酸鈦以及50mM tris緩沖溶液(pH = 8. 0)。用2. 5mL的一次性注射器將反應(yīng)液A和B分別轉(zhuǎn)移到截流分光光譜儀中，監(jiān)測兩 者混合后在390nm處吸收值隨時(shí)間的變化曲線，該曲線即反映ACS。d的甲基轉(zhuǎn)移活性。我 們發(fā)現(xiàn)在ImM的濃度下，8-羥基喹啉能有效抑制ACS。d的甲基轉(zhuǎn)移活性，抑制率接近100% (如圖1所示)。1，10-鄰菲咯啉⑴、2，2-聯(lián)吡啶的實(shí)驗(yàn)步驟和8-羥基喹啉的實(shí)驗(yàn)步驟一致，結(jié)果表明，其抑制率也接近100%。本發(fā)明中使用的試劑和生物材料來源如下鐵氰化鉀、檸檬酸鈉、無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司Tris 購自上海生工公司(Sangon，Shanghai, China)三氯化鈦、1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯(lián)吡啶和8-羥基喹啉均購自sigma-aldrich公司。
權(quán)利要求
人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶A合成酶的抑制劑，其特征在于為下述三種螯合劑中的至少一種1，10-鄰菲咯啉式(I)、2，2-聯(lián)吡啶式(II)和8-羥基喹啉(III)，其結(jié)構(gòu)式如下F2010100230522C00011.tif
2.人類病原體艱難梭菌中乙酰輔酶A合成酶抑制劑驗(yàn)證方法，其特征在于具體步驟為(1)配制一定濃度的檸檬酸鈦，并用鐵氰化鉀標(biāo)定其精確濃度；(2)將步驟(1)所得檸檬酸鈦分別加入到ΙΟμΜ的甲基鈷鐵硫蛋白和20μΜ的ACSed 中，結(jié)合半小時(shí)以上；(3)將步驟(2)20μ MWACScit^P ImM的檸檬酸鈦混合溶液中加入抑制劑，結(jié)合一小時(shí) 以上；(4)將步驟(2)中所得甲基鈷鐵硫蛋白與步驟(3)中所得混合溶液快速混合，用截流光 譜儀檢測抑制反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，步驟(1)中所述檸檬酸鈦為檸檬酸鈦的 tris緩沖溶液，ρΗ為8. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，步驟(2)所述甲基鈷鐵硫蛋白提取自產(chǎn)乙酸 菌 Clostridium thermoaceticum0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，步驟(2)中所述ACS。d是乙酰輔酶A合成酶， 通過基因重組得到。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為以乙酰輔酶A合成酶(ACS)為靶點(diǎn)的人類病原體clostridium difficile抑制劑。本發(fā)明利用快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)了具有高度抑制活性的乙酰輔酶A合成酶抑制劑，包括1，10-鄰菲咯啉、2，2-聯(lián)吡啶和8-羥基喹啉，其中已有臨床應(yīng)用的藥物8-羥基喹啉在較低濃度時(shí)幾乎可以100％抑制乙酰輔酶A的甲基轉(zhuǎn)移活性。本發(fā)明方法是目前唯一報(bào)道的人類病原體clostridium difficile乙酰輔酶A合成酶的高效抑制劑。本發(fā)明在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重大應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號A61P31/04GK101797251SQ20101002305
公開日2010年8月11日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者朱小飛, 譚相石 申請人:復(fù)旦大學(xué)