專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種含CpG 0DN和poly I:C佐劑的噴 鼻型流感疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道傳播疾病，接種流感疫苗是預(yù)防流感 的有效手段。 傳統(tǒng)的流感病毒疫苗包括流感全病毒滅活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亞單位 疫苗，這些流感疫苗均采用肌肉注射方式。在俄羅斯和美國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)流感減毒活疫苗，該 疫苗采用冷適應(yīng)的流感重組株經(jīng)鼻腔噴霧給藥，但該疫苗未被批準(zhǔn)用于3歲以下嬰幼兒使 用。 CpG ODN(oligodeoxynucleotides, 0DN)是一種含有非甲基化CpG 二核苷酸序 列的單鏈寡核苷酸，CpG ()I)N可以被免疫細(xì)胞上To:l.l樣受體-9(Toll-like rec印tor 9， TLR-9)所識(shí)別，并增強(qiáng)免疫反應(yīng)。美國(guó)Dynavax公司以CpG ODN為佐劑的重組乙肝疫苗在 三期臨床研究中顯示了優(yōu)于普通乙肝疫苗的免疫效果，接種兩針后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到95%， 而普通乙肝疫苗接種三針陽(yáng)轉(zhuǎn)率為81%。Poly I:C,即聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-po:l.ycytidy:l.ic acid,poly ]::C)
是-一種合成的雙鏈RNA，Poly I:C可被免疫細(xì)胞上的Toll樣受體-3 (Toll-like rec印tor
3， TLR-3)所識(shí)別，并增強(qiáng)免疫反應(yīng)。目前以Polyl :C主要作為免疫剌激劑、腫瘤治療藥物
使用，使用Poly I:C作為佐劑的狂犬病疫苗和流感疫苗尚處于臨床前研究階段。 傳統(tǒng)的流感病毒疫苗為流感病毒滅活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人劑量
含每型血凝素15微克，兒童劑量含每型血凝素7. 5微克，由于傳統(tǒng)疫苗使用肌肉注射方式
進(jìn)行接種，而利用本專(zhuān)利制備的含CpG ODN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗采用噴
鼻給藥方式，接種方式更方便,并可以降低抗原用量，增加疫苗供應(yīng)能力。 以CpG ODN和Po :1.yI: C兩種佐劑制備噴鼻型流感疫苗目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)流感疫苗的缺陷，提供了一種免疫效果好、可以降低流感病毒
抗原用量，方便使用的噴鼻型流感疫苗,且可以應(yīng)付流感大流行之下。 本發(fā)明的技術(shù)方案及步驟 (1)將H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿 囊腔增殖流感病毒； (2)收獲流感病毒,用截留分子量100 75()kD的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮； (3)將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于充分平衡的S印harose 4FF柱，收集第
一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒；
(4)經(jīng)脫氧膽酸鈉裂解的流感病毒樣品，上樣于S印harose 6FF柱，純化獲得流感 病毒疫苗原液； (5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合； (6)按照每劑含HIN1流感病毒血凝素和:H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血
凝素1 10微克、CpG 0DN佐劑50 1000微克、poly I :C佐劑100 2000微克的配比，
分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG 0DN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗。 其中流感病毒濃縮過(guò)程中使用的超濾膜截留分子量可以為300 750kD ;疫苗含
每型流感病毒血凝素可以為2 7. 5微克/劑，CpG ()DN佐劑可以為100 500微克/劑、
polyl:C佐劑可以為200 1000微克/齊U，疫苗不含有硫柳汞。 實(shí)施例1 1)增殖流感病毒 將H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34t:培養(yǎng)72小時(shí)； 將雞胚置于4。C冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml ，于2-8"C滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)4()0()g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量100kD的超濾膜濃縮 至150毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于().()lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱體積1850ml),收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度().5% (g/ral)振搖下裂解6()分鐘，裂解 液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素10微克、含CpG ODN佐劑50微克、含Polyl :C佐劑100微 克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗。 實(shí)施例2 1)增殖流感病毒 將H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34t:培養(yǎng)72小時(shí)； 2)收獲流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置于4。C冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml ，于2-8"C滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)4()0()g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量300kD的超濾膜濃縮 至148毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于().()lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱體積1850ml),收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度().5% (g/ral)振搖下裂解6()分鐘，裂解 液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素7. 5微克、含CpG ODN佐劑100微克、含Polyl :C佐劑200
微克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I: C佐劑的噴鼻型流
感病毒疫苗。 實(shí)施例3 1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養(yǎng)72小時(shí)； 2)收獲流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置于4t:冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8"C滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)4000g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量75()k:[)的超濾膜濃縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱體積185(Ml)，收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度O. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ml 。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐劑250微克、含Polyl :C佐劑500微 克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實(shí)施例4 1)增殖流感病毒 將II1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養(yǎng)72小時(shí)； 2)收獲流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置于4t:冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8"C滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)棚g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量30()k:[)的超濾膜濃縮 至155毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱體積185(Ml)，收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度O. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK5()/1()()柱，柱體積183()ni:l.)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素2微克、含CpG ODN佐劑500微克、含Polyl: C佐劑1000微
克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和polyl :C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實(shí)施例5 1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養(yǎng)72小時(shí)； 2)收獲流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置于4t:冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)4000g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量750kD的超濾膜濃縮至155毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5()/1(K)柱，柱體積1850ml)，收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml 。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度O. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK5()/1()()柱，柱體積183()ni:l.)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素1微克、含CpG ODN佐劑1000微克、含Polyl :C佐劑2000
微克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I: C佐劑的噴鼻型流
感病毒疫苗。 實(shí)施例6 1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養(yǎng)72小時(shí)； 2)收獲流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置于4t:冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)4000g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量300kD的超濾膜濃縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱體積1850ml),收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 25()ni:l-。4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度0. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ral。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含 HlNl和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐劑500微克、含Polyl :C佐劑500微 克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實(shí)施例7
1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養(yǎng)72小時(shí)； 2)收獲流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置于4t:冷庫(kù)過(guò)夜，收集尿囊液合并，得流感病毒收獲液12500毫升。流感 病毒收獲液加入甲醛溶液12. 5ml，于2-8t:滅活振搖滅活24小時(shí)。滅活的病毒液經(jīng)4000g 離心30分鐘，經(jīng)0. 8微米中空纖維系統(tǒng)澄清過(guò)濾后，采用截留分子量300kD的超濾膜濃縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱體積1850ml),收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒，共 25()ni:l-。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度0. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣于S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價(jià) 疫苗原液420ral。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據(jù)H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價(jià)疫苗原液的血凝素濃度測(cè)定值，按照每劑含 H:1N1和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ()DN佐劑100微克、含Poly:l: :C佐劑500微 克的配方配制半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實(shí)施例8 流感病毒疫苗的動(dòng)物免疫原性檢測(cè) 采用健康家兔作為動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)施例1 實(shí)施例7制備的噴鼻型流感病毒疫苗 與市售流感裂解疫苗進(jìn)行了免疫原性比較，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下 實(shí)施例1-實(shí)施例7制備的噴鼻流感疫苗對(duì)家兔采用噴鼻免疫接種方式，每組5只 家兔，每次噴鼻().2ral， 0、 14天各免疫一次,第二次免疫后7天采血分離血清，測(cè)定免前免后 血清中對(duì)H1N1型、H3N2型、B型流感病毒的血凝抑制抗體滴度，計(jì)算每只家兔(免后血凝抑 制抗體/免前血凝抑制抗體)的比值，并計(jì)算每組家兔(免后血凝抑制抗體/免前血凝抑 制抗體)比值的幾何平均數(shù)。 流感病毒裂解疫苗分為噴鼻和肌肉注射兩組，每組5只家兔，每次免疫0. 2ml，()、 14天各免疫一次，第二次免疫后7天采血分離血清，測(cè)定免前免后血清中對(duì)H1N1型、H3N2 型、B型流感病毒的血凝抑制抗體滴度，計(jì)算每只家兔(免后血凝抑制抗體/免前血凝抑制 抗體)的比值,并計(jì)算每組家兔(免后血凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)比值的幾何平 均數(shù)。 免疫結(jié)果如下表所示本發(fā)明制備的噴鼻型流感疫苗與現(xiàn)有流感病毒疫苗的比較
免疫組別(免后血凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)幾何平均數(shù)H1N1型H3N2型B型
流感病毒裂解疫 苗(注射)6.965.274.59
流感病毒裂解疫 苗(噴鼻)1.321.521.15
實(shí)施例1 (噴鼻)10.5686.96
實(shí)施例2 (噴鼻)13.9310.568
實(shí)施例3 (噴鼻)21.111613.92
實(shí)施例4 (噴鼻)12.1210.568
實(shí)施例5(噴鼻)9.199.19
實(shí)施例6 (噴鼻)21.1118.3816
實(shí)施例7 (噴鼻)〗2.1210.559.19 從上表可以看出，本發(fā)明制備的噴鼻型流感病毒疫苗經(jīng)噴鼻途徑免疫的免疫原性 均優(yōu)于市售流感疫苗經(jīng)注射途徑、噴鼻途徑免疫的免疫原性,說(shuō)明本發(fā)明制備的含CpG0DN 和Poly I: C佐劑噴鼻型流感疫苗適宜于預(yù)防流行性感冒。
權(quán)利要求
一種含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制備方法，其步驟是(1)將H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒種分別接種于1000枚10日齡健康雞胚尿囊腔增殖流感病毒；(2)收獲流感病毒，用截留分子量100～750kD的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮；(3)將超濾濃縮后的流感病毒樣品上樣于充分平衡的Sepharose 4 FF柱，收集第一個(gè)洗脫峰為純化的流感病毒；(4)經(jīng)脫氧膽酸鈉裂解的流感病毒樣品，上樣于Sepharose 6FF柱，純化獲得流感病毒疫苗原液；(5)將以上步驟分別得到的H1N1、H3N2、B型流感病毒疫苗原液混合；(6)按照每劑含H1N1流感病毒血凝素和H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血凝素1～10微克、CpG ODN佐劑50～1000微克、poly I:C佐劑100～2000微克的配比，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含CpG ()DN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制 備方法，其特征是所述流感病毒濃縮過(guò)程中使用的超濾膜截留分子量為300 750kD。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種含CpG 0DN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制 備方法，其特征是所述疫苗含每型流感病毒血凝素2 7. 5微克/劑，CpG 0DN佐劑100 250微克/齊U、 poly I :C佐齊[J 200 500微克/劑。
全文摘要
本發(fā)明一種含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其步驟為，采用雞胚培養(yǎng)增殖流感病毒，經(jīng)超濾濃縮、柱層析后獲得純化的流感病毒，經(jīng)裂解后獲得流感疫苗原液，將所需型別流感疫苗原液與CpG ODN佐劑、polyI:C佐劑配比后制備而成。本發(fā)明提供了一種可以降低流感病毒抗原用量，方便免疫接種的新型噴鼻型流感病毒疫苗制備方法，適宜于在全球大流感流行威脅下迅速提高流感疫苗供應(yīng)能力。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101745109SQ201010103470
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2010年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者代云波, 向左云, 張翊 申請(qǐng)人:云南沃森生物技術(shù)股份有限公司