專利名稱：超聲霧化法制備載骨生長(zhǎng)因子微球技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種載骨生長(zhǎng)因子微球的制備方法。
背景技術(shù)：
載藥微球是隨著生物材料科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及藥物學(xué)的發(fā)展而逐漸興起的一種醫(yī)用 生物材料制品，是一種用可降解高分子材料為載體，包裹或吸附藥物而制成的球形或類球 形的微粒，懸浮于惰性親水性溶液中。注射用微球直徑一般在幾十微米左右，其本質(zhì)特征是 作為藥物的承載者進(jìn)入人體，藥物釋放的部位、速度、方式等具有可選擇性和可控制性，能 更好地發(fā)揮藥物的效力。作為載體材料，可降解高分子微球有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，比如良好的生 物相容性、親水性和生物可降解性。載藥微球中藥物的釋放具有可緩釋特性，能增長(zhǎng)藥物的 半衰期，延長(zhǎng)給藥時(shí)間；在同等劑量的情況下，提高了藥物的生物可用度。研究證明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)又名骨生長(zhǎng) 因子，能夠增加成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志酶——堿性磷酸酶和骨鈣蛋白等基因的表達(dá)，促進(jìn) 新骨形成及骨的層次化，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。2002年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了 OP-I (BMP-7)用于長(zhǎng)骨缺損的臨床治療以及膠原載體微粒攜帶重組人類BMP-2在前部腰椎 間融合中的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)BMP，尤其是BMP-2和BMP-7在臨床中的骨誘導(dǎo)作用給予了 很高的評(píng)價(jià)。然而，BMP應(yīng)用到臨床的困難主要是易在體內(nèi)擴(kuò)散稀釋，其生物利用度極低。 因此，需要合適的載體以使BMP得到緩慢釋放，而載藥微球是一個(gè)較佳的選擇，尤其是尺寸 均勻、有高的載藥率、能保持高的藥物活性的微球。在乳化法 /0/ ”、“8(8011(1)/0/^”等制備載骨生長(zhǎng)因子微球中，藥物的活性保持 不良致使釋放不完全是一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題。本發(fā)明目的，利用超聲霧化系統(tǒng)提供的輕柔、低流 速、低流量的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)明一種先進(jìn)的載骨生長(zhǎng)因子微球的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種載骨生長(zhǎng)因子微球的制備方法。本發(fā)明的采用“a(aggregate)/0/W”法和超聲霧化系統(tǒng)結(jié)合的方法制備微球。本發(fā)明的制備方法包括以下步驟將微球原料和骨生長(zhǎng)因子配成溶液，通過(guò)霧化器霧化產(chǎn)生微球液滴，揮發(fā)干燥得 到固態(tài)微球。其中，微球原料選自生物可降解高分子聚乳酸(PLA)或聚乙醇酸(PGA)或乳 酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，其分子量范圍為5 lOOKDa，溶劑選自二氯甲烷或三氯甲烷。骨生長(zhǎng)因子選自BMP-2、BMP-7或BMP-I等骨形態(tài)發(fā)生蛋白，其溶劑采用磷酸緩沖 鹽溶液(PBS)。具體制備方法(1).溶液的配制配制微球原料溶液的和骨生長(zhǎng)因子溶液；(2).加料把微球原料溶液(有機(jī)相)和骨生長(zhǎng)因子溶液(水相)通過(guò)注射器泵分別以恒定的流速加入超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化以恒定的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴；(4).溶劑的揮發(fā)用表面活性劑收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌，使二 氯甲烷或三氯甲烷揮發(fā)；(5).洗滌并冷凍干燥。步驟(1)配制后得到的原料溶液的濃度在2 15% (w/v)之間，骨生長(zhǎng)因子溶液 的濃度在5 25ug/ml之間。步驟(2)中原料溶液和因子溶液的流速分別為0. 2 0. 4mL/分鐘、1 3mL/分 鐘，霧化振動(dòng)頻率為25 60kHz，；步驟(3)中表面活性劑為低分子量的聚乙烯醇(PVA)，其在外水相的濃度范圍為 0. 1 1 % (w/v)。 步驟⑷中攪拌時(shí)間為3 4小時(shí)。本發(fā)明最優(yōu)選的制備方法在實(shí)施例中。本發(fā)明制備的緩釋微球粒徑均勻，平均粒徑大小為15. 5 31. 4微米，可根據(jù)需要 改變制備參數(shù)(主要是噴嘴型式和超聲霧化頻率)進(jìn)行控制。本發(fā)明制備的緩釋微球中，其骨生長(zhǎng)因子的釋放具有可調(diào)的緩釋周期，體外磷酸 鹽緩沖液(PBS)浸泡45天后的釋放量達(dá)78. 1 92. 4%。本發(fā)明中微球的制備方法簡(jiǎn)單，采用“a(aggregate)/0/W”法結(jié)合超聲霧化系統(tǒng)， 使藥物聚集物的形成和乳化成球同時(shí)進(jìn)行。因子在被包埋和釋放的過(guò)程中，由于存在可逆 的“聚集-解離”平衡，因子在其中具有儲(chǔ)藏式保存作用，使其保持良好的活性，釋放較為完 全，另外本發(fā)明制備得到的微球穩(wěn)定性好，安全性高，保質(zhì)期長(zhǎng)，緩釋周期可控，成本低廉， 適合大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例更加詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明，但不起到限制作用。實(shí)施例1、載BMP-2的PLA (5KDa)微球的制備步驟如下(1).溶液的配制配制2%的PLA的二氯甲烷溶液的和5ug/ml的BMP-2的PBS溶液。(2).加料把(1)配制的PLA溶液和BMP-2溶液通過(guò)注射器泵分別以0. 2mL/分 鐘、ImL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器。(3).霧化用60kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴。(4).溶劑的揮發(fā)用0. 的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪 拌4小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)。(5).洗滌并冷凍干燥。本例制備的載BMP-2的PLA微球具有均勻的粒徑，平均粒徑大小為15. 5微米，體 外PBS浸泡45天后BMP-2的釋放量達(dá)92. 4%。實(shí)施例2、載BMP-I的PLGA (20KDa)微球的制備步驟如下(1).溶液的配制配制15%的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml溶液，(2)把(1)配制的PLGA和BMP-I的溶液通過(guò)注射器泵分別以0. ImL/分鐘、ImL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器，(3).霧化用40kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴，(4).溶劑的揮發(fā)用0. 5%的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪 拌3小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)，(5).洗滌并冷凍干燥。本例制備的載BMP-I的PLGA微球平均粒徑大小為26. 8微米，體外PBS浸泡45天 后BMP-I的釋放量達(dá)85%。 實(shí)施例3、載BMP-7的PLGA (50KDa)微球的制備步驟如下(1).溶液的配制配制5%的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml的BMP-7的PBS溶液。(2).加料把(1)配制的PLGA溶液和BMP-7的溶液通過(guò)注射器泵分別以0.4mL/ 分鐘、3mL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器。(3).霧化用25kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴。(4).溶劑的揮發(fā)用0. 5%的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪 拌4小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)。(5).洗滌并冷凍干燥。本例制備的載BMP-7的PLGA微球的平均粒徑大小為31. 4微米，體外PBS浸泡45 天后BMP-2的釋放量達(dá)89. 2%。實(shí)施例4、載BMP-2的PGA (IOKDa)微球的制備步驟如下(1).溶液的配制配制10%的PGA的二氯甲烷溶液的和20ug/ml的BMP-2的PBS 溶液。(2).加料把(1)配制的PGA溶液和BMP-2的溶液通過(guò)注射器泵分別以0. 4mL/分 鐘、3mL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器。(3).霧化用40kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴。(4).溶劑的揮發(fā)用1 %的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌 3小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)。(5).洗滌并冷凍干燥。本例制備的緩釋微球具有均勻的粒徑，平均粒徑大小為23. 7微米，體外PBS浸泡 45天后BMP-2的釋放量達(dá)80. 3%。實(shí)施例5、載BMP-2的PLA (IOOKDa)微球的制備步驟如下(1).溶液的配制配制10%的PLA的三氯甲烷溶液的和25ug/ml的BMP-2的PBS 溶液。(2).加料把⑴配制的PLA溶液和BMP-2的溶液通過(guò)注射器泵分別以0. 3mL/分 鐘、2mL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器。(3).霧化用60kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴。(4).溶劑的揮發(fā)用0. 的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪 拌4小時(shí)，使三氯甲烷揮發(fā)。(5).洗滌并冷凍干燥。本例制備的載BMP-2的PLA(IOOKDa)微球具有均勻的粒徑，其平均粒徑大小為28. 4微米，體外PBS浸泡45天后BMP-2的釋放量達(dá)78. 1 %.
權(quán)利要求
一種載骨生長(zhǎng)因子微球的制備方法，采用a/o/w法和超聲霧化系統(tǒng)結(jié)合的方法制備微球，其特征在于，將微球原料和骨生長(zhǎng)因子配成溶液，通過(guò)霧化器霧化產(chǎn)生微球液滴，揮發(fā)干燥得到固態(tài)微球，其中，微球原料選自聚乳酸、聚乙醇酸或乳酸-乙醇酸共聚物，其分子量范圍為5～100KDa，溶劑選自二氯甲烷或三氯甲烷，骨生長(zhǎng)因子選自BMP-2、BMP-7或BMP-1，溶劑為磷酸緩沖鹽溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟為(1).溶液的配制配制微球原料溶液和骨生長(zhǎng)因子溶液；(2).加料把微球原料溶液和骨生長(zhǎng)因子溶液通過(guò)注射器泵分別以恒定的流速加入 超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化以恒定的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴；(4).溶劑的揮發(fā)用表面活性劑收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌；(5).洗滌并冷凍干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中步驟(1)配制后得到的原料溶 液的濃度在2 15% (w/v)之間，骨生長(zhǎng)因子溶液的濃度在5 25ug/ml之間；步驟(2) 中原料溶液和因子溶液的流速分別為0. 2 0. 4mL/分鐘、1 3mL/分鐘，霧化振動(dòng)頻率為 25 60kHz ；步驟(3)中表面活性劑為低分子量的聚乙烯醇(PVA)，其在外水相的濃度范圍 為 0. 1 1 % (w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中步驟(4)中攪拌時(shí)間為3-4小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟為(1).溶液的配制配制2%的PLA的二氯甲烷溶液的和5ug/ml的BMP-2的PBS溶液；(2).加料把(1)配制的PLA溶液和BMP-2的溶液通過(guò)注射器泵分別以0.2mL/分鐘、 ImL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化用60kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴；(4).溶劑的揮發(fā)用0.的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌4 小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)；(5).洗滌并冷凍干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟為(1).溶液的配制配制15%的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml的BMP-2的PBS溶液(2)把(1)配制得到的PLGA和BMP-2的溶液通過(guò)注射器泵分別以0.1mL/分鐘、ImL/ 分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化用40kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴。(4).溶劑的揮發(fā)用0.5%的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌3 小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)。(5).洗滌并冷凍干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟為(1).溶液的配制配制5%的PLGA的二氯甲烷溶液和10ug/ml的BMP-7的PBS溶液；(2).加料把(1)配制的PLGA溶液和BMP-7的溶液通過(guò)注射器泵分別以0.4mL/分鐘、 3mL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化用25kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴；(4).溶劑的揮發(fā)用0.5%的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌4 小時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)；(5).洗滌并冷凍干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟為(1).溶液的配制配制10%的PGA的二氯甲烷溶液和20ug/ml的BMP-2的PBS溶液；(2).加料把(1)配制的PGA溶液和BMP-2的溶液通過(guò)注射器泵分別以0.4mL/分鐘、 3mL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化用40kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴；(4).溶劑的揮發(fā)用的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌3小 時(shí)，使二氯甲烷揮發(fā)；(5).洗滌并冷凍干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟為(1).溶液的配制配制10%的PLA的三氯甲烷溶液的和25ug/ml的BMP-2的PBS溶液；(2).加料把(1)配制的PLA溶液和BMP-2的溶液通過(guò)注射器泵分別以0.3mL/分鐘、 2mL/分鐘的流速加入超聲霧化發(fā)生器；(3).霧化用60kHz的霧化振動(dòng)頻率產(chǎn)生微液滴；(4).溶劑的揮發(fā)用0.1 %的PVA水溶液收集(3)所產(chǎn)生的微液滴，并繼續(xù)機(jī)械攪拌4 小時(shí)，使三氯甲烷揮發(fā)；(5).洗滌并冷凍干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，得到的微球平均粒徑大小為15.5 31. 4微米。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種超聲霧化法制備載骨生長(zhǎng)因子微球技術(shù)，該技術(shù)運(yùn)用“a(aggregate)/o/w”法結(jié)合超聲霧化系統(tǒng)，使藥物聚集物的形成和乳化成球同時(shí)進(jìn)行，采用生物可降解高分子聚乳酸或聚乙醇酸或乳酸-乙醇酸共聚物作為微球的起始原料，包埋BMP-2、BMP-7、BMP-1等骨形態(tài)發(fā)生蛋白，在制備過(guò)程中，主要通過(guò)控制噴嘴型式和超聲霧化頻率、原料的成份和濃度等參數(shù)，達(dá)到調(diào)控微球尺寸和釋放周期的目的。骨生長(zhǎng)因子在被包埋和釋放的過(guò)程中，由于存在可逆的“聚集-解離”平衡，因子在微球中具有儲(chǔ)藏式保存作用，使其保持良好的活性，釋放較為完全，體外磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡45天后的釋放量達(dá)78.1～92.4％。
文檔編號(hào)A61K9/16GK101816634SQ201010106159
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者佘振定, 王明波, 譚榮偉 申請(qǐng)人:佘振定