專利名稱：：基于兩性離子的電荷反轉(zhuǎn)型殼聚糖衍生物及其在藥劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及高分子化學(xué)領(lǐng)域及藥用輔料領(lǐng)域。具體涉及氨基酸修飾的具有電荷反轉(zhuǎn)功能的殼聚糖衍生物，包括能形成兩親性聚合物的N-辛基-N'-琥珀?；?N"-賴氨?；鶜ぞ厶?，N-辛基-N'-檸槺?；?N"-賴氨酰基殼聚糖，N-辛基-N'-琥珀?；?N"-組氨酰基殼聚糖及其制備方法，以及水溶性的聚合物N-琥珀?；?N'-賴氨?；鶜ぞ厶牵琋-檸槺?；?N'-賴氨酰基殼聚糖，N-琥珀酰基-N'-組氨?；鶜ぞ厶茄苌锛捌渲苽浞椒?。本發(fā)明還涉及兩親性聚合物形成膠束材料對(duì)難溶性藥物的增溶作用，親水型聚合物對(duì)脂質(zhì)體、納米粒等載體的修飾作用。
背景技術(shù)：
：多數(shù)化療藥物或基因藥物的作用靶點(diǎn)位于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的胞漿、細(xì)胞器或細(xì)胞核，納米載體的作用是將這些藥物輸送到細(xì)胞內(nèi)部以發(fā)揮作用。納米載體主要通過(guò)內(nèi)吞的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，然后進(jìn)入到內(nèi)涵體內(nèi)。由于內(nèi)涵體內(nèi)呈現(xiàn)的弱酸性環(huán)境(pH4.5-6)以及各種酶易使載體及藥物發(fā)生降解或破壞(BarefordLM，SwaanPW.Endocyticmechanismsfortargeteddrugdelivery.AdvancedDrugDeliveryReviews2007，59:748-758.)。陽(yáng)離子納米載體的正電荷可以與細(xì)胞膜負(fù)電荷產(chǎn)生靜電作用，容易被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。另一方面，陽(yáng)離子聚合物能結(jié)合內(nèi)涵體中的質(zhì)子，發(fā)揮"質(zhì)子海綿作用"(protonspongeeffect)，使內(nèi)涵體中的pH值不降低，從而抑制溶酶體酶的活性，加速內(nèi)涵體膨脹破裂，使陽(yáng)離子載體能夠從中逃逸而進(jìn)入胞槳，保護(hù)進(jìn)入內(nèi)涵體的藥物，提高藥物的耙向性。然而，陽(yáng)離子納米載體攜帶正電荷導(dǎo)致其有較大的生理毒性以及較快的血漿清除率，很難在人體得到實(shí)際應(yīng)用(MaSF，NishikawabM，KatsumiH，etal.Cationiccharge-dependenthepaticdeliveryofamidatedserumalbumin.JournalofControlledRelease2005，102:583—594.FischeraD，LiY，AhlemeyerB，etal.Invitrocytotoxicitytestingofpolycations:influenceofpolymerstructureoncellviabilityandhemolysis.Biomaterials2003,24:1121-1131.)。應(yīng)用電荷反轉(zhuǎn)策略，即載體在生理?xiàng)l件下帶負(fù)電，而到達(dá)腫瘤細(xì)胞外(pH6-7)或者溶酶體(pH4.5-6)后帶正電可以降低陽(yáng)離子納米載體的生理毒性(XuP，VanKirkE，ZhanY，etal.TargetedCharge—ReversalNanoparticlesforNuclearDrugDelivery.AngewandteChemieInternationalEdition2007，46:4999-5002)。殼聚糖是可生物降解和生物相容的天然聚合物，結(jié)構(gòu)中含有2-NH2，3-0H和6-0H，可進(jìn)行兩親性結(jié)構(gòu)改造，從而在水中自發(fā)形成聚合物膠束。發(fā)明人在先期的授權(quán)專利CN03112981.l和CN200510095442.X中公開了一類N-長(zhǎng)鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖和一類N_長(zhǎng)鏈烷基-N-季胺化殼聚糖，均可形成膠束且對(duì)難溶性藥物具有增溶作用。此外，殼聚糖也是一類陽(yáng)離子聚電解質(zhì)，其pKa值約為6.4。在殼聚糖中引入含有羧基的官能團(tuán)可以將殼聚糖轉(zhuǎn)變成為兩性離子聚合物，使其有一個(gè)特定的等電點(diǎn)。例如N-琥珀酰殼聚糖，具有不同琥珀酰基取代度的N-琥珀酰殼聚糖，等電點(diǎn)也不相同()趙劍豪，曾戎，劉宏偉等.N-琥珀酰殼聚糖的合成及其物理化學(xué)的性能.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008,29:77-80.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一類電荷反轉(zhuǎn)型殼聚糖衍生物，該類衍生物具備范圍于4.5-7內(nèi)的等電點(diǎn)，以分別響應(yīng)腫瘤細(xì)胞外和溶酶體內(nèi)的弱酸性環(huán)境并實(shí)現(xiàn)電荷從負(fù)電荷向正電荷的反轉(zhuǎn)。該類衍生物包括兩親性的殼聚糖衍生物和水溶性的殼聚糖。以殼聚糖為骨架，在其2_NH2接枝親水基琥珀?；徒M氨酸，以及疏水基長(zhǎng)鏈辛基；或者在其2_NH2接枝親水基賴氨酸和疏水鏈辛基，再在其2_NH2和賴氨酸的_NH2引入發(fā)揮電荷反轉(zhuǎn)作用的琥珀酰基或檸槺?；纬尚滦偷木哂须姾煞崔D(zhuǎn)能力的兩親性聚合物，可在水中自發(fā)形成聚合物膠束，達(dá)到對(duì)難溶性藥物增溶的效果。水溶性的殼聚糖衍生物可以通過(guò)向殼聚糖2-NH2中引入親水性的琥珀?；徒M氨酸獲得，或者在殼聚糖2-NH2接枝親水基賴氨酸琥珀?；驒帢滨；傻?。電荷反轉(zhuǎn)型殼聚糖衍生物由于在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)中表面攜帶負(fù)電荷，而到達(dá)腫瘤細(xì)胞外或者溶酶體內(nèi)以后響應(yīng)所處環(huán)境弱酸性條件而電荷反轉(zhuǎn)為正電荷，不僅可以降低陽(yáng)離子納米載體的體內(nèi)毒性，提高納米載體的長(zhǎng)循環(huán)能力，而且可以促進(jìn)納米載體被細(xì)胞攝取和從溶酶體逃逸，提高藥物遞送效率，降低藥物毒副作用的效果。本發(fā)明的殼聚糖衍生物還可以用作為其它聚合物膠束和脂質(zhì)體等納米粒表面的修飾劑，使其具有相同的功能。本發(fā)明的殼聚糖衍生物結(jié)構(gòu)式為I、II、III或IV:ICH2OH'o、，0NHRC，OHQN—gHCOMeCH2NHR=HorCOCH35<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>或IV的殼聚糖衍生物的粘均分子量為2k-70k，其中表示取代度的x、y、z、p分別是15%-65%、5%-40%、15%-65%、5%-40%。上述結(jié)構(gòu)式I或III的殼聚糖衍生物的取代度x、y、z、p分別優(yōu)選55%-65%、10%-15%、35%-45%、10%-20%。上述結(jié)構(gòu)式II或IV的殼聚糖衍生物的取代度x、y、z分別優(yōu)選55%-65%、25%-35%、20%-30%。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I、11、III或IV的殼聚糖衍生物的制備方法簡(jiǎn)述如下殼聚糖衍生物I的制備方法包括先制得N-辛基殼聚糖，再與N-琥珀酰組氨酸甲酯反應(yīng)，最后通過(guò)碳酸氫鈉水解制得N-辛基-N'-琥珀?；?N"-組氨酰基殼聚糖衍生物。殼聚糖衍生物II的制備方法包括先制得N-辛基殼聚糖，再與N，NE-Boc-L-lysine反應(yīng)，酸解脫除保護(hù)基得N_辛基-N'-賴氨?；鶜ぞ厶牵詈笈c檸槺酸酐與琥珀酸酐反應(yīng)，即得。殼聚糖衍生物III的制備方法包括殼聚糖先與N-琥珀酰組氨酸甲酯反應(yīng)，然后通過(guò)碳酸氫鈉水解制得N-琥珀?；?N'-組氨?；鶜ぞ厶茄苌铩ぞ厶茄苌颕V的制備方法包括先將殼聚糖與N，NE-Boc-L-lysine反應(yīng)，再通過(guò)甲酸酸解脫除保護(hù)基得N-辛基-N'-賴氨?；鶜ぞ厶?，最后與檸槺酸酐與琥珀酸酐反應(yīng)，即得。殼聚糖衍生物I的反應(yīng)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>ftH2N—CHC—OHSOCI2/MeOHrefluxftH2N-9HC-OCH3i.崎CHCb2.Succinicanhydride*f,H2、9HO-C十C"^"C-HON—(^HC-OMe^H2CH2OHCH2OH，NHCOCH33，EDC/NHSDMSONHCOCH3NH2VHQHN-G(C峻G-N-GHCOMeOd)CH21NNaHC030=9(9H2)2COOH殼聚糖衍生物III的反應(yīng)式為OOCH2《R=HorCOCH38BisBoO"L-LysineEDC/NHS0=9H(j:-NHBoc(9h2)4NHBocR=H,COCH3HCOOH/CH3OHYoR=H,COCH3NHC8H17t^HX=-CH2CH2tCH=C(CH3)-R=HorCOCH3,.、(H2)4NH2NH一C一X一COOHOHC一NH一C一X-COOH5殼聚糖衍生物IV的反應(yīng)式為NHRR=H,COCHCH2OH(OH-oH78.c9更為詳細(xì)更為優(yōu)選的制備方法如下殼聚糖衍生物I的制備方法如下a.取殼聚糖懸浮無(wú)水甲醇中，加入辛醛，反應(yīng)12h。加入KBH4，室溫還原24h，過(guò)濾，用水、甲醇、乙醚洗滌，烘干，得^辛基殼聚糖。b.取N-辛基殼聚糖，懸浮于二甲基亞砜(也可以使用N，N'-二甲基甲酰胺，甲醇，水或者任意兩者的混合溶液)中攪拌24h，隨后加入N-琥珀酰組氨酸，1_(3-二甲氨基丙基)_3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫反應(yīng)24h，過(guò)濾用水、丙酮洗滌，得N-辛基-N'-組胺酸甲酯殼聚糖。c.取N-辛基-N'-組胺酸甲酯殼聚糖懸浮于化110)3(也可以使用化011，LiOH，K2C03)溶液，2h后停止反應(yīng)，透析48h，凍干，得N-辛基-N'-組胺?；?N"-琥珀酰基殼聚糖(1)。殼聚糖衍生物II的制備方法包括a.取N-辛基殼聚糖，懸浮于匿SO(也可以使用N，N'-二甲基甲酰胺，甲醇，水或者任意兩者的混合溶液)中攪拌24h，隨后加入N，NE-BoC-L-lysine，1_(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫反應(yīng)24h，過(guò)濾用水、丙酮洗滌，得N-辛基-N'-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖。b.取N-辛基-N'-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖懸浮于甲醇中常溫下攪拌lh，隨后加10HCOOH/CH3OHNH2NHCOCH3，(H2)4NHRX=-CH2CHr,-CH=C(CH3)-R=HorCOCH3H(^—NH-C-X-COOHNH一C一X一COOHNH,4cH.13,oN2BH一HHN-CIC-CYN叉OI入等體積的甲酸(也可以使用三氟醋酸，乙酸以及1N稀鹽酸)冰浴下反應(yīng)8h，透析48h，凍干得N-辛基-N'-賴氨酰殼聚糖c.取N-辛基-N'-賴氨酰殼聚糖懸浮于匿SO(也可以使用N，N'-二甲基甲酰胺，甲醇，水或者任意兩者的混合溶液)中常溫下攪拌lh，隨后加入丁二酸酐或者檸槺酸酐，常溫下反應(yīng)24h，透析48h，凍干得N-辛基-N'-琥珀?；?N"-賴氨?；鶜ぞ厶?，或N_辛基-N'-檸槺?；?N"-賴氨?；鶜ぞ厶茄苌?II)。殼聚糖衍生物III的制備方法如下a.取殼聚糖懸浮于匿SO(也可以使用N，N'_二甲基甲酰胺，甲醇，水或者任意兩者的混合溶液)中攪拌24h，隨后加入N-琥珀酰組氨酸，1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫反應(yīng)24h，過(guò)濾用水、丙酮洗滌，得N-組胺酸甲酯殼聚糖。b.取N-組胺酸甲酯殼聚糖懸浮于NaHC03(也可以使用NaOH，LiOH，K2C03)溶液，2h后停止反應(yīng)，透析48h，凍干，得N-組胺酰基-N'-琥珀?；鶜ぞ厶?III)。殼聚糖衍生物IV的制備方法包括a.取殼聚糖懸浮于匿SO(也可以使用N，N'_二甲基甲酰胺，甲醇，水或者任意兩者的混合溶液)中攪拌24h，隨后加入N，NE-BoC-L-lySine，1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫反應(yīng)24h，過(guò)濾用水、丙酮洗滌，得N-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖。b.取得N-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖懸浮于甲醇中常溫下攪拌lh，隨后加入等體積的甲酸(也可以使用三氟醋酸，乙酸以及IN稀鹽酸)，冰浴下反應(yīng)8h，透析48h，凍干得N-賴氨酰殼聚糖c.取N-賴氨酰殼聚糖懸浮于匿SO(也可以使用N，N'-二甲基甲酰胺，甲醇，水或者任意兩者的混合溶液)中常溫下攪拌lh，隨后加入丁二酸酐或者檸槺酸酐，常溫下反應(yīng)24h，透析48h，凍干得N-琥珀酰基-N'-賴氨?；鶜ぞ厶?，或N-檸槺?；?N'-賴氨?；鶜ぞ厶茄苌?IV)。本發(fā)明的殼聚糖衍生物為白色至黃色粉末，易溶于水。殼聚糖衍生物具有一個(gè)等電點(diǎn)，其值于4.5至7.0之間，當(dāng)此類殼聚糖衍生物處于高于等電點(diǎn)的pH環(huán)境中攜帶負(fù)電荷，而當(dāng)其處于低于等電點(diǎn)的pH環(huán)境中攜帶正電荷。本發(fā)明的兩親性殼聚糖衍生物均可以在溶液中形成聚合物膠束，其粒徑在100-150nm之間。本發(fā)明的殼聚糖衍生物對(duì)難溶性藥物具有增溶作用，例如對(duì)于紫杉醇，聚合物膠束的最大載藥量為18.8%。藥物與殼聚糖衍生物的重量比優(yōu)選l:210，此時(shí)增溶效果較好。本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，其含有治療有效量的藥物和本發(fā)明的殼聚糖衍生物。所述藥物優(yōu)選難溶性藥物，難溶性藥物優(yōu)選喜樹堿類(如喜樹堿、10-羥基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、SN-38等)、紫杉醇、多西紫杉醇、藤黃酸、環(huán)孢素A、足葉乙苷、替尼泊甙、依托泊甙、長(zhǎng)春酰胺、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、冬凌草素、藤黃酸、三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、燈盞花素、銀杏內(nèi)酯、水飛薊素或靛玉紅，本發(fā)明的殼聚糖衍生物對(duì)上述藥物均有很好的增溶作用。最優(yōu)選的藥物是紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素或喜樹堿。該組合物通過(guò)添加其它藥用輔料可制備成各種藥物制劑。藥物與本發(fā)明的殼聚糖衍生物的重量比優(yōu)選為1:210。本發(fā)明的殼聚糖衍生物(1，II，III，IV)還可用作其它聚合物膠束或脂質(zhì)體等微粒表面的修飾劑，使其具有電荷反轉(zhuǎn)功能。作為修飾劑時(shí)，本發(fā)明的殼聚糖衍生物與膠束材料或脂質(zhì)體載體的重量比優(yōu)選l:550。本發(fā)明用可生物降解的天然來(lái)源的殼聚糖作為原料，進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，使其形成同時(shí)具有酸性基團(tuán)與堿性基團(tuán)的兩性聚合物，具有電荷反轉(zhuǎn)能力，即在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)中表面攜帶負(fù)電荷，而到達(dá)腫瘤細(xì)胞外或者溶酶體內(nèi)以后響應(yīng)所處環(huán)境弱酸性條件而電荷反轉(zhuǎn)為正電荷。殼聚糖衍生物不僅可以在水中自發(fā)形成靶向型膠束，適合用于藥物、與藥物組配或作為藥物載體，尤其是適宜用作靜脈注射抗腫瘤藥物的優(yōu)良載體，還適合用作為其它聚合物膠束、脂質(zhì)體等納米粒表面的修飾劑，使其具有電荷反轉(zhuǎn)功能。圖！是電荷修飾前后阿霉素脂質(zhì)體在pH7.4與pH6.5時(shí)MCF-7乳腺癌細(xì)胞攝取試驗(yàn)具體實(shí)施例方式殼聚糖脫乙酰度90%以上，粘均分子量200kD-5kD;透析袋的截留分子量為10000(麗C010000-1000)。實(shí)施例11.N-辛基殼聚糖的制備(N0C)500mL三頸瓶中加入4g殼聚糖，向三頸瓶中加入105mL無(wú)水甲醇，升溫至30°C，保溫?cái)嚢?h。加入10.6mL辛醛，室溫反應(yīng)12h，緩慢加入5gKBH4，室溫還原反應(yīng)24h，調(diào)反應(yīng)液pH至7，過(guò)濾，用水洗2次，甲醇洗4次，乙醚洗2次，烘干，得黃色粉末4.6g(辛基取代度25%)。2.N-琥珀?；M氨酸甲酯的制備L-組氨酸15.5g(0.lmol)懸浮于320ml無(wú)水甲醇中，冰浴冷卻至(TC5。C后，緩慢滴入10.9ml(0.15mol)二氯亞砜。滴加完畢，升溫至68°C，回流反應(yīng)16h。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液濃縮，得白色固體即為組氨酸甲酯鹽酸鹽(23.2g，96%)。3.N-辛基-N'-組胺酸甲酯殼聚糖(NONMH)的制備取lgN-辛基殼聚糖(NOC)于50ml二甲基亞砜中室溫下溶脹12h。加入lg(O.Ollmol)N-琥珀?；M氨酸甲酯和1.92g(0.017mol)NHS，冰浴冷卻至(TC。將3.3g(0.017mol)EDOHCl溶于10ml甲醇中，緩慢滴入反應(yīng)體系。室溫下繼續(xù)反應(yīng)24h。將反應(yīng)液傾入250ml丙酮中，過(guò)濾，濾餅依次用水，水_丙酮混合液，丙酮洗去未反應(yīng)的N-琥珀?；M氨酸甲酯，EDCHC1和NHS，干燥得1.3g黃色粉末N-辛基-N'-組胺酸甲酯殼聚糖(NO匪)。3.N-辛基-N'_組胺?；?N"-琥珀酰基殼聚糖(NONHS)的合成取0.5gN0NMH，懸浮于15mllmo1/1的碳酸氫鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)液用lmo1/1的HC1中和，用半透膜透析24h，透析液過(guò)濾，濾液凍干即得0.12g白色絮狀固體顯HS。N0NHS:FT-IR:3426,2952,2869，1726，1668，1658，1557，1422，1383，1315，1258，1232，1152，1114，1069，1032，868，660cm—1.力NMR(500MHz，D20):7.4-6.9(aromHis)，4.6—4.5(HaHis,H》，4.0—3.3(H3，H4，H5，H6)，3.03.2(H2，_NH_CH2_(CH2)6_CH3)，2.6_2.2(-NH-CO-CH^-COO-)，2.0(NH-CO-CH3)，1.4-0.9(_NH-CH2_6_CH3)，0.8(_NH-CH2_(CH2)6-CH3).根據(jù)元素分析數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出N-辛基殼聚糖中辛基取代度為27%;根據(jù)^NMR中H的積分面積可以計(jì)算出琥珀?；徒M氨酰基的取代度分別為39%和21%。實(shí)施例21.N-辛基-N'-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖(NONLB)用殼聚糖同辛醛進(jìn)行反應(yīng)，用KBH4還原，依照實(shí)施例1中NOC的制備方法制備得NOC。取lgN-辛基殼聚糖(NOC)于50ml二甲基亞砜中室溫下溶脹12h。加入3g(0.009mo1)N，NE-Boc-L-lysine和1.92g(0.017mol)NHS，冰浴冷卻至0°C。將3.3g(0.017mol)EDC'HCl溶于10ml甲醇中，緩慢滴入反應(yīng)體系。室溫下繼續(xù)反應(yīng)24h。將反應(yīng)液傾入250ml丙酮中，過(guò)濾，濾餅依次用水，水_丙酮混合液，丙酮洗滌，干燥得1.8g黃色粉末N-辛基-N'-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖。取lgNONLB懸浮于20ml甲醇中常溫?cái)嚢鑜h，冰浴下加入20ml甲酸，0-5t:反應(yīng)8h，用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，透析48h，凍干得0.42g白色固體。3.N-辛基-N'-琥珀?；?N"-賴氨酰基殼聚糖(NONLS)取0.lgNONL懸浮于10mlDMSO中常溫?cái)嚢鑜h，用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，加入0.05g丁二酸酐，反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢后透析48h，凍干得86mg白色固體。顯LS:FT-IR:3423,2956,2863，1729，1668，1549，1420，1381，1236，1158，1112，1066，1033cm—、丄HNMR(500MHz，D20):4.6-4.5(HaLys，H》，4.0-3.3(H3，H4，H5，H6)，3.2(_NH_Ca2_(CH2)10_CH3)，3.0(H2)2.9_2.2(HeLys，-NH-CO-CH^-COOH)，2.0(NH-CO-C仏)，1.7(HPLys)，1.6_1.0(_NH_CH2_(C仏)10_CH3，HyLys，HSLys)，0.8(_NH-CH2-(CH2)10-CH3)根據(jù)元素分析數(shù)據(jù)，根據(jù)元素分析數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出N-辛基-N'-琥珀?；?N"-賴氨?；鶜ぞ厶切粱〈葹?7%;根據(jù)^NMR中H的積分面積可以計(jì)算出琥珀酰基和賴氨?；娜〈确謩e60%為和41%。實(shí)施例31.N-辛基-N'-檸槺?；?N"-賴氨?；鶜ぞ厶?NONLC)用檸槺酸酐與NONL反應(yīng)，制備方法依照實(shí)施例2中的NONLS的制備。FT-IR:3423,2956,2863，1729，1668，1549，1420，1381，1236，1158，1112，1066，1033cm—1.力NMR(500MHz，D20):6.4—5.9(_CH=C(CH3)-)，4.6—4.5(HaLys，H》，4.0—3.3(H3，H4，H5，H6)，3.2(_NH_CH2_(CH2)10_CH3)，3.0(H2)2.5_2.2(HeLys)，2.0(NH_CO_CH3)，1.7(HPLys)，1.6-1.0(_NH-CH2_(C仏)10-CH3，HyLys，HSLys)，0.8(_NH-CH2_(CH2)10-CH3).13根據(jù)元素分析數(shù)據(jù)，根據(jù)元素分析數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出N-辛基-N'-琥珀?；?N"-賴氨?；鶜ぞ厶切粱〈葹?7%;根據(jù)^NMR中H的積分面積可以計(jì)算出檸槺?；唾嚢滨；娜〈确謩e為49%和41%。實(shí)施例41.N-組胺酸甲酯殼聚糖(NMH)的制備取lg殼聚糖(NOC)于50ml二甲基亞砜中室溫下溶脹12h。加入lg(0.011mol)N-琥珀酰基組氨酸甲酯和1.92g(0.017mol)NHS，冰浴冷卻至0°C。將3.3g(0.017mol)EDCHCl溶于10ml甲醇中，緩慢滴入反應(yīng)體系。室溫下繼續(xù)反應(yīng)24h。將反應(yīng)液傾入250ml丙酮中，過(guò)濾，濾餅依次用水，水-丙酮混合液，丙酮洗去未反應(yīng)的N-琥珀酰基組氨酸甲酯，EDOHCl和NHS，干燥得1.6g黃色粉末N-組胺酸甲酯殼聚糖(NMH)。2.N-組胺?；?N-琥珀?；鶜ぞ厶?NHSuc)的制備取O.5gNMH，懸浮于15mllmol/1的碳酸氫鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)液用lmol/1的HC1中和，用半透膜透析24h，透析液過(guò)濾，濾液凍干即得0.34g白色絮狀固體NHSuc。NHSuc:FT-IR:3426,2952，1726，1658，1557，1422，1383，1315，1258，1232，1152，1032，868,660cm—1.力NMR(500MHz，D20):7.4-6.9(aromHis)，4.6—4.5(HaHis,H》，4.0—3.3(H3，H4，H5，H6)，3.03.2(H2，_NH_CH2_(CH2)6_CH3)，2.6_2.2(-NH-CO-CH^-COO-)，2.0(NH-CO-CH3).根據(jù)^NMR中H的積分面積可以計(jì)算出琥珀酰基和組氨?；娜〈确謩e為63%和44%。實(shí)施例51.N-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖(NLB)取lg殼聚糖于50ml二甲基亞砜中室溫下溶脹12h。加入3g(0.009mol)N，NE-Boc-L-lysine和1.92g(0.017mol)NHS，冰浴冷卻至0°C。將3.3g(0.017mol)EDCHCl溶于10ml甲醇中，緩慢滴入反應(yīng)體系。室溫下繼續(xù)反應(yīng)24h。將反應(yīng)液傾入250ml丙酮中，過(guò)濾，濾餅依次用水，水_丙酮混合液，丙酮洗滌，干燥得2.2g黃色粉末N-叔丁氧羰基賴氨酰殼聚糖。2.N'-賴氨酰殼聚糖(NL)取lgNLB懸浮于20ml甲醇中常溫?cái)嚢鑜h，冰浴下加入20ml甲酸，0_5°C反應(yīng)8h，用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，透析48h，凍干得0.65g白色固體。3.N-琥珀?；?N'-賴氨酰基殼聚糖(NLS)取0.lgNL懸浮于10mlDMSO中常溫?cái)嚢鑜h，用lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，加入0.05g丁二酸酐，反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢后透析48h，凍干得106mg白色固體。NLS:FT-IR:3423,2956,2863，1729，1668，1549，1420，1381，1236，1158，1112，1066，1033cm—1.力NMR(500MHz,D20):4.6—4.5(HaLys，H》，4.0—3.3(H3，H4，H5，H6)，3.0(H2)，2.9-2.2(HeLys，-NH-C0-CH2-C^-C00H)，2.0(NH_C0-CH3)，1.7(HPLys)，1.6-1.O(HyLys，HSLys)根據(jù)^NMR中H的積分面積可以計(jì)算出琥珀?；唾嚢滨；娜〈确謩e為86%和44%。實(shí)施例62.N-檸槺?；?N'-賴氨?；鶜ぞ厶?NLC)用檸槺酸酐與NL反應(yīng)，制備方法依照實(shí)施例5中的NONLS的制備。FT-IR:3423,2956，1729，1668，1549，1420，1381，1236，1158，1112，1066，1033cm—1.力NMR(500MHz，D20):6.4—5.9(-Q]=C(CH3)-)，4.6—4.5(HaLys，H》，4.0—3.3(H3，H4，H5，H6)，3.0(H2)，2.9-2.2(HeLys)，2.0(NH-CO_CH3)，1.7(HPLys)，1.6—1.O(HyLys，HSLys)根據(jù)^NMR中H的積分面積可以計(jì)算出檸槺酰基和賴氨?；娜〈确謩e為61%和44%。實(shí)施例7殼聚糖衍生物等電點(diǎn)的測(cè)定分別稱取殼聚糖衍生物材料(實(shí)施例1-6中所制備)10mg，置于5mlpH為3.5，4.0，4.5，5.0，5.2，5.5，5.8，6.0，6.2，6.5，7.0，7.4，8.2的水溶液中，攪拌30min。利用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定各溶液在560nm處的吸光度，吸光度最小處即為材料的等電點(diǎn)。結(jié)果見表1:表l不同殼聚糖衍生物的等電點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例8兩親性殼聚糖衍生物增溶紫杉醇將30mg殼聚糖衍生物(實(shí)施例1-3中所制備)溶解在3mL蒸餾水中，同時(shí)將10mg紫杉醇溶解在0.4mL無(wú)水乙醇中，攪拌條件下將紫杉醇溶液加入載體溶液中，蒸餾水透析12h，0.8iim微孔濾膜過(guò)濾，得到紫杉醇聚合物膠束溶液。用HPLC法測(cè)定膠束的載藥量。結(jié)果見表2。將實(shí)施例1，2中所制備的兩親性殼聚糖衍生物及其紫杉醇凍干品16mg，溶于5mL純水，室溫超聲30min。將所得膠束溶液經(jīng)過(guò)0.45iim微孔濾膜以后后用Zetasizer3000HSinst進(jìn)ent(MalvernInstruments,Malvern，UK)在633線25°C，He-Ne激光測(cè)定粒徑以及電位。結(jié)果見表2。表2:不同兩親性殼聚糖衍生物載藥膠束的載藥量，粒徑(nm)與Zeta電位(mV)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例9兩親性殼聚糖衍生物膠束增溶阿霉素將20mg殼聚糖衍生物N0NHS(實(shí)施例1中所制備)溶解在3mL蒸餾水中，同時(shí)將10mg阿霉素溶解在0.5mL無(wú)水甲醇中，加入適量三乙胺進(jìn)行攪拌，將阿霉素溶液加入載體溶液中，蒸餾水透析12h，0.45iim微孔濾膜過(guò)濾，得到阿霉素聚合物膠束溶液。用HPLC法測(cè)定載藥量為8.3%.平均粒徑為145nm左右。實(shí)施例10電荷反轉(zhuǎn)材料修飾的阿霉素脂質(zhì)體將卵磷脂和膽固醇按照2:l(摩爾比)溶于溶于有機(jī)溶劑(氯仿甲醇為2:1)，5(TC減壓下旋轉(zhuǎn)蒸除去溶劑，形成磷脂薄膜250mmol/L硫酸銨溶液適量，渦旋振蕩，水浴超聲。所得脂質(zhì)體裝于透析袋中，置盛有PBS(pH7.4)100mL的燒杯中，室溫下透析5次，每次lh。得空白脂質(zhì)體。按照2.5%的藥脂比(重量比)加入阿霉素，6(TC水浴孵育lh，振蕩lh，即得阿霉素脂質(zhì)體。將不同的殼聚糖衍生物材料(實(shí)施例1-6中所制備)分別和卵磷脂按照1:20(重量比)的比例共孵2h后。倒入阿霉素脂質(zhì)體溶液中，室溫下振蕩2h，室溫孵育24h，即得殼聚糖衍生物修飾的阿霉素脂質(zhì)體。將所得脂質(zhì)體溶液經(jīng)過(guò)0.22iim微孔濾膜以后用Zetasizer3000HSinstrument(Malvernlnst進(jìn)ents，Malvern，UK)在633線25。C，He-Ne激光測(cè)定粒徑以及電位。結(jié)果見表3。表3:不同殼聚糖衍生物修飾脂質(zhì)體的粒徑(nm)與Zeta電位(mV)脂質(zhì)體阿霉素脂質(zhì)體NONHS修飾脂質(zhì)體NONLS修飾脂質(zhì)體NONLC修飾脂質(zhì)體粒徑138.1154.9165.1152.7電位-3.8-29.9-22.9-21.5實(shí)施例11親水性殼聚糖衍生物修飾陽(yáng)離子納米粒N-三甲基殼聚糖納米粒取N-三甲基殼聚糖10mg溶于2ml2%的醋酸溶液中，用4NNaOH溶液調(diào)pH至5;同時(shí)將11.6mg三聚磷酸鈉溶于5.8ml，配成2mg/ml的三聚磷酸鈉水溶液。將0.5ml2mg/ml的三聚磷酸鈉水溶液逐滴加入三甲基殼聚糖溶液中，常溫下攪拌20min即得。將所得的三甲基殼聚糖溶液高速離心10-15min(1000g)2次，棄去上清液并將沉16淀重新分散于0.5mlpH為7.4的PBS溶液中；同時(shí)將10mg親水性殼聚糖衍生物(實(shí)施例4-6中所制備)溶于0.5mlpH為7.4的PBS溶液中，分別傾入三甲基殼聚糖納米粒溶液中，室溫?cái)嚢?0min，并將所得的納米粒溶液過(guò)0.80iim微孔濾膜以后用Zetasizer3000HSinst進(jìn)ent(MalvernInstruments,Malvern，UK)在633線25°C，He-Ne激光測(cè)定粒徑以及電位。結(jié)果見表4。表4:不同水溶性殼聚糖衍生物修飾三甲基殼聚糖納米粒的粒徑(nm)與Zeta電位(mV)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例12腫瘤細(xì)胞攝取作用將MCF-7乳腺癌細(xì)胞按1X105接種于蓋玻片，爬片48h后用實(shí)施例10制備的用電荷反轉(zhuǎn)材料(NONLC)修飾的阿霉素脂質(zhì)體(濃度為6ug/ml)進(jìn)行2小時(shí)的孵育，熒光顯微鏡(OlympusCX-31)下觀測(cè)。當(dāng)pH7.4時(shí)，電荷反轉(zhuǎn)材料修飾的阿霉素脂質(zhì)體與未修飾的脂質(zhì)體相比，沒有明顯的區(qū)別，但當(dāng)P朋.5時(shí)，電荷反轉(zhuǎn)材料修飾的阿霉素脂質(zhì)體與未修的脂質(zhì)體相比具有顯著的增強(qiáng)攝取效果，見圖1。權(quán)利要求通式I、II、III或IV的殼聚糖衍生物其中I、II、III或IV的殼聚糖衍生物的粘均分子量為2k-70k，x、y、z、p分別是15％-65％、5％-40％、15％-65％、5％-40％。FSA00000021951700011.tif2.權(quán)利要求1的殼聚糖衍生物，其中I或HI的殼聚糖衍生物的x、y、z、p分別是55%-65%、10%-15%、35%_45%、10%-20%。3.權(quán)利要求l的殼聚糖衍生物，其中1I或IV的殼聚糖衍生物的x、y、z分別是55%-65%、25%-35%、20%-30%。4.一種藥物組合物，其中含有藥物和權(quán)利要求1的殼聚糖衍生物。5.權(quán)利要求4的組合物，其中藥物選自喜樹堿、紫杉醇、多西紫杉醇、藤黃酸、環(huán)孢素A、足葉乙苷、替尼泊甙、依托泊甙、長(zhǎng)春酰胺、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、冬凌草素、藤黃酸、三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、燈盞花素、銀杏內(nèi)酯、水飛薊素或靛玉紅。6.權(quán)利要求5的組合物，其中藥物選自紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素或喜樹堿。7.權(quán)利要求4的組合物，其中藥物與殼聚糖衍生物的重量比為1:210。8.權(quán)利要求1的殼聚糖衍生物用作藥物增溶劑的用途。9.權(quán)利要求1的殼聚糖衍生物用作聚合物膠束或脂質(zhì)體微粒表面修飾劑的用途。10.權(quán)利要求4的組合物，其劑型是聚合物膠束或脂質(zhì)體，其中殼聚糖衍生物與膠束材料或脂質(zhì)體載體的重量比為1:550。全文摘要本發(fā)明涉及高分子化學(xué)領(lǐng)域及藥用輔料領(lǐng)域。具體涉及基于兩性離子的電荷反轉(zhuǎn)型殼聚糖衍生物及其在藥劑中的應(yīng)用，其特征是以殼聚糖為骨架，在其2-NH2接枝親水基琥珀酰基和組氨酸，以及疏水基長(zhǎng)鏈辛基；或者在其2-NH2接枝親水基賴氨酸和疏水鏈辛基，再在其2-NH2和賴氨酸的-NH2引入發(fā)揮電荷反轉(zhuǎn)作用的琥珀?；驒幟术；?。本發(fā)明的殼聚糖衍生物不僅對(duì)難溶性藥物增溶的效果，而且電荷反轉(zhuǎn)型殼聚糖衍生物由于在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)中表面攜帶負(fù)電荷，到達(dá)腫瘤細(xì)胞外或者溶酶體內(nèi)以后響應(yīng)所處環(huán)境弱酸性條件而電荷反轉(zhuǎn)為正電荷，因此可以促進(jìn)納米載體被細(xì)胞攝取和從溶酶體逃逸，提高藥物遞送效率，降低藥物毒副作用的效果。文檔編號(hào)A61K31/4745GK101775082SQ20101010683公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年2月9日優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日發(fā)明者丁崧,平其能,張燦,莫然,鞠曹云申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)