專利名稱：一種組織工程骨軟骨復(fù)合體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于軟骨組織修復(fù)和組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建組織工程骨軟 骨復(fù)合體的方法。具體而言，首先利用分層脫鈣技術(shù)，制備以松質(zhì)骨柱為主體、上層完全脫 鈣、下層僅表面脫鈣的組織工程骨軟骨支架，然后借助上層完全脫鈣松質(zhì)骨基質(zhì)框架結(jié)構(gòu)， 以纖維蛋白原凝膠或藻酸凝膠作為軟骨種子細(xì)胞的二級支架和分布載體，構(gòu)建組織工程骨 軟骨復(fù)合體。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨的損傷及病變是常見疾患，且難以自身修復(fù)。組織工程軟骨是最有希望 的修復(fù)方法。但目前關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究中存在以下問題亟待解決(1)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨 的同時(shí)往往還需修復(fù)軟骨下骨。臨床上單純關(guān)節(jié)軟骨的損傷比較少見，更多的是伴隨軟骨 下骨的病變，包括創(chuàng)傷引起的軟骨下骨的缺損，骨軟骨炎病變中軟骨下骨的壞死，軟骨退變 后軟骨下骨的硬化、脂肪變等。因此在多數(shù)情況下，修復(fù)軟骨的同時(shí)還需修復(fù)軟骨下骨。(2) 組織工程關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)品的固定問題未能有效解決。組織工程軟骨的即時(shí)固定非常重要，如 果不能很好的固定，在關(guān)節(jié)應(yīng)力(特別是剪力)的作用下，移植組織和早期修復(fù)組織與軟骨 下骨出現(xiàn)相對位移，造成再生組織與周圍正常軟骨、軟骨下骨交界區(qū)的應(yīng)力集中，導(dǎo)致再生 軟骨交界區(qū)整合不良，另外過度的剪切應(yīng)力也可能會影響修復(fù)組織的質(zhì)量。因此，需要即時(shí) 固定組織工程關(guān)節(jié)軟骨，保護(hù)組織工程關(guān)節(jié)軟骨免受有害應(yīng)力，防止其出現(xiàn)脫落、撕裂。(3) 現(xiàn)有的組織工程軟骨存在生物力學(xué)缺陷。大量研究表明，雖然以天然生物材料(如膠原、透 明質(zhì)酸、藻酸、纖維蛋白膠等)為支架的工程軟骨，修復(fù)效果優(yōu)于化學(xué)合成支架，但是多數(shù) 天然材料支架生物力學(xué)性能差，不能提供工程軟骨移植后的即時(shí)應(yīng)力支撐，造成移植組織 的有害應(yīng)力損害和周圍軟骨的異常應(yīng)力集中，影響修復(fù)效果，引起周圍軟骨的退變。這一點(diǎn) 在修復(fù)負(fù)重區(qū)軟骨缺損時(shí)尤為明顯，這也是交界區(qū)整合不良的主要原因之一。(4)組織工程 軟骨與軟骨下骨間的整合較差。上述這些問題都會導(dǎo)致再生組織與周圍軟骨和軟骨下骨的 交界區(qū)整合不良。隨著軟骨組織工程研究的深入，上述問題逐漸被人們重視。由于骨愈合的速度比 關(guān)節(jié)軟骨要容易得多，愈合的質(zhì)量也好，因此，如果能構(gòu)建一體化的工程骨軟骨，早期依靠 骨內(nèi)支架提供穩(wěn)定性，從而解決工程軟骨的固定問題，骨愈合后依靠軟骨下骨的牢固愈合， 提供并保持其上面再生軟骨的力學(xué)穩(wěn)定性，獲得更好的交界區(qū)整合，防止遠(yuǎn)期退變；而且結(jié) 合Mosaicplasty技術(shù)(關(guān)節(jié)骨軟骨移植技術(shù)，用取自自體或異體的多個(gè)骨軟骨塞，移植到 關(guān)節(jié)軟骨缺損或病變區(qū)，以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨)，則既有利于關(guān)節(jié)鏡下操作，又可以獲得更大面 積的修復(fù)。因此研究能同時(shí)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的一體化的組織工程——骨軟骨組織 工程，是軟骨組織工程研究發(fā)展的必然趨勢，也是目前研究的重點(diǎn)。目前的組織工程骨軟骨的支架一般由上、下兩層組成，上層為軟骨支架，下層為骨 支架。其雙層支架構(gòu)建方法主要是兩類，下層一般為適于骨組織工程的支架材料如生物玻 璃、硫酸鈣、羥基磷灰石、聚乳酸/羥基乙酸類或復(fù)合材料如聚醚醚酮/羥基磷灰石、膠原、羥基磷灰石等，上層軟骨支架材料一類是凝膠類，如藻酸鈣凝膠、纖維蛋白 膠、透明質(zhì)酸凝 膠等，或符合天然材料如膠原/殼聚糖等，利用滲透作用與下層支架進(jìn)行粘接，或利用冷凍 干燥法將上層軟骨支架材料成分固定在下層成骨支架上；另一類表層支架則為聚乳酸/羥 基乙酸類，通過溶媒熔接或縫合的方法與下層支架連接。還有一類是利用膠原、殼聚糖、羥 基磷灰石等材料，通過三維打印的方式合成梯度材料，形成所謂功能性界面。以上述天然凝膠樣材料為上層軟骨支架的復(fù)合骨軟骨支架存在以下問題①上層 材料力學(xué)性能差；②界面之間有力學(xué)缺陷，容易撕脫，抗剪力能力差；③凝膠類支架植入體 內(nèi)后吸水變形，重新變成了凝膠樣，軟骨層力學(xué)性能進(jìn)一步減弱；④操作相對復(fù)雜；⑤下層 羥基磷灰石降解慢，影響與周圍骨的愈合。上層為聚乳酸/羥基乙酸類物質(zhì)的復(fù)合支架，由于聚乳酸類等化學(xué)合成材料降解 易導(dǎo)致酸性產(chǎn)物堆積，引起關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，且其在生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)毒性有機(jī)物的殘留， 由于滑膜關(guān)節(jié)的代謝緩慢，因此此類材料可能并不適于用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架。利用復(fù)合材料三維打印形成的骨軟骨復(fù)合支架，形成的是梯度支架，即從軟骨層 逐漸過渡到成骨層，軟骨層可能含有一定的鈣離子，會影響軟骨形成，甚至導(dǎo)致軟骨鈣化， 而且上層準(zhǔn)確添加能形成軟骨的種子細(xì)胞也比較困難，即使形成材料的骨_軟骨界面，也 很難形成軟骨支架/軟骨種子細(xì)胞_骨支架/骨種子細(xì)胞的生物界面。理想的骨軟骨組織工程支架應(yīng)該滿足下列要求①一體化，骨與軟骨界面沒有明 顯力學(xué)缺陷；②力學(xué)仿生，上層構(gòu)建的工程軟骨其力學(xué)性能應(yīng)接近正常關(guān)節(jié)軟骨，下層則應(yīng) 與軟骨下骨的機(jī)械強(qiáng)度接近，有較強(qiáng)的支撐強(qiáng)度；③上下孔徑不一致，軟骨層孔徑小，乏氧， 利于成軟骨，下層孔徑大，利于血管長入；④上層能促進(jìn)軟骨生成，下層能促進(jìn)骨生成(骨 傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo))；⑤支架內(nèi)部，特別是軟骨支架內(nèi)，細(xì)胞分布均勻，能提供良好的營養(yǎng)，及時(shí) 帶走代謝產(chǎn)物；⑥材料易于獲得，制作簡便，便于臨床操作。近年來的大量研究證實(shí)，脫鈣骨基質(zhì)(DBM)是較好的軟骨組織工程的支架材料。 其優(yōu)越性在于①DBM是細(xì)胞外基質(zhì)，主要成分是I型膠原；②具有天然孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙大 小為100um-800um，交通性好，提供了足夠的內(nèi)表面積和空間，利于細(xì)胞吸附、增殖、分泌的 細(xì)胞外基質(zhì)沉積、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物交換，為組織工程的種子細(xì)胞提供較為良好的生長 環(huán)境并利于種子細(xì)胞的接種；③制備過程中除去了骨形成蛋白(BMP)之外的非膠原性蛋白 和有阻滯作用的脂類，抗原性顯著降低，BMP的純度也相應(yīng)提高；④具有良好的軟骨誘導(dǎo)活 性。DBM中含有的BMP，有較強(qiáng)的軟骨誘導(dǎo)活性，在關(guān)節(jié)特定的微環(huán)境條件下，可促進(jìn)軟骨 祖細(xì)胞聚集及向軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長和特異性細(xì)胞外基質(zhì)合成。⑤降 解時(shí)間合理DBM在體內(nèi)4周時(shí)部分降解，8-12周時(shí)完全降解，軟骨形成需6-8周時(shí)間，此 時(shí)DBM已趨于大部或全部吸收，與軟骨形成幾乎同步，不影響新的軟骨組織形成；⑥力學(xué)強(qiáng) 度合適松質(zhì)骨以最合理、最節(jié)約的材料，獲得最大的力學(xué)支撐。因此DBM這種天然交聯(lián)的 I型膠原，較之合成的膠原、透明質(zhì)酸或者藻酸等生物材料，有更好的力學(xué)支撐強(qiáng)度，而力學(xué) 支撐強(qiáng)度對關(guān)節(jié)軟骨組織工程材料是非常重要的性能指標(biāo)。應(yīng)用脫鈣骨基質(zhì)作為軟骨組織工程支架的研究和專利較多，但都是僅用于軟骨組 織工程，植入體內(nèi)仍然存在前述的固定問題。因此，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種新的思路，即通過 松質(zhì)骨分層脫鈣技術(shù)，制備出完全一體化的組織工程骨軟骨支架。所述組織工程骨軟骨支架已經(jīng)可以直接用于關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)或者關(guān)節(jié)軟骨及骨下骨的同時(shí)修復(fù)，但是為了進(jìn)一步減少加載了種子細(xì)胞后的組織工程骨軟骨支架內(nèi)的無細(xì) 胞生長空間，更加有利于軟骨修復(fù)，本發(fā)明人在此基礎(chǔ)上以纖維蛋白原凝膠或藻酸凝膠作 為軟骨種子細(xì)胞的二級支架和分布載體，進(jìn)一步構(gòu)建了組織工程骨軟骨復(fù)合體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織工程骨軟骨復(fù)合體及其制備方法。具體而言，以 通過分層脫鈣制備的組織工程骨軟骨支架為主體支架，以纖維蛋白原凝膠或藻酸凝膠作為 軟骨種子細(xì)胞的二級支架和分布載體，進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體。一個(gè)方面，一種制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的方法，該方法包括1)以動物骨或者深低溫冷凍人骨為原料制備松質(zhì)骨柱；2)將步驟1)制得的松質(zhì)骨柱進(jìn)行分層脫鈣，得到上層完全脫鈣，下層僅表面脫鈣 的組織工程骨軟骨支架，以該支架作為制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的主體支架；3)將培養(yǎng)擴(kuò)增后的軟骨種子細(xì)胞收集后稀釋于纖維蛋白原溶液或藻酸鈉溶液 中；4)將步驟3)得到的含軟骨種子細(xì)胞的纖維蛋白原溶液或藻酸鈉溶液置于培養(yǎng)皿 或培養(yǎng)板中；5)將主體支架倒立，讓支架上層(即完全脫鈣部分)且僅讓上層沉浸于上述培養(yǎng) 皿或培養(yǎng)板內(nèi)的溶液中，支架下層(即僅表面脫鈣部分)曝露于溶液外；6)調(diào)整溶液量，添加0. lml 2% (w/v)凝血酶溶液或CaCl2溶液，使上述溶液形成 凝膠，凝膠的表面與主體支架上、下層的界面基本重合；7)培養(yǎng)板放入4°C冰箱10分鐘，取出培養(yǎng)板，吸出孔中多余液體，切除支架外多余 凝膠，即獲得所述的組織工程骨軟骨復(fù)合體。在本發(fā)明所述方法中，其中所述的動物骨優(yōu)選從市場采購的新鮮動物骨。本發(fā)明中，制備松質(zhì)骨柱的方法是在常規(guī)方法基礎(chǔ)上略作改進(jìn)，簡而言之為，取新 鮮動物骨或者深低溫冷凍人骨，剔除其上附著的肌肉及韌帶組織，鋸成2cm厚的骨片，然后 將骨片用高壓水槍三蒸水沖洗洗去骨髓，剪除骨皮質(zhì)，無水乙醇脫水，乙醚脫脂，風(fēng)干。然后 用0. 4-4cm直徑環(huán)鉆，將上述處理過的動物骨制成直徑為0. 4-4cm的松質(zhì)骨柱。本發(fā)明中，所述的分層脫鈣技術(shù)是指，將制備得到的松質(zhì)骨柱按所需比例劃分為 上、下兩部分，下面的部分用石蠟包埋，然后將該松質(zhì)骨柱整體置于EDTA溶液中脫鈣，然后 以二甲苯和梯度酒精去除石蠟，PBS緩沖液浸泡1周，再冷凍干燥。該技術(shù)中，經(jīng)脫鈣處理 后，上層完全脫鈣，下層由于在脫鈣過程中有石蠟包埋保護(hù)，因此僅表面脫鈣。其中所述所 需比例通常為1 1 1 2，優(yōu)選為1 2，即石蠟包埋的下層(即不完全脫鈣部分)的 長度占松質(zhì)骨柱全長的2/3，上面不包埋部分(即完全脫鈣部分)占松質(zhì)骨柱全長的1/3。本發(fā)明中，所述的軟骨種子細(xì)胞為軟骨細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的軟骨種子細(xì)胞以4X107ml稀釋于纖維蛋 白原溶液或藻酸鈉溶液。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的纖維蛋白原溶液或藻酸鈉溶液的濃度為 1. 2% (v/w)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的方法包括1)取新鮮牛股骨髁，剔除其上附著的肌肉及韌帶組織，鋸成2cm厚的骨片后，將骨 片用高壓水槍三蒸水沖洗洗去骨髓，剪除骨皮質(zhì)，無水乙醇脫水，乙醚脫脂，風(fēng)干。然后用 lcm直徑環(huán)鉆，將上述處理過的牛股骨髁制成直徑為1cm的松質(zhì)骨柱。將松質(zhì)骨柱下2/3 部分用石蠟包埋。將下2/3部分包埋石蠟后的松質(zhì)骨柱置于10% (w/v)EDTA溶液中脫鈣2 周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蠟，PBS緩沖液浸泡1周以上，再冷凍干燥，即得本發(fā)明 所述的組織工程骨軟骨支架。2)收集常規(guī)方法培養(yǎng)擴(kuò)增的兔2代軟骨細(xì)胞，以1. 2% (v/w)藻酸鈉溶液稀釋成 4X 107ml，取0. 5ml上述細(xì)胞懸液加入到48孔培養(yǎng)板的孔中。3)將步驟1)制得的分層組織工程骨軟骨支架倒立，讓支架上層(即支架上1/3完 全脫鈣部分)且僅讓上層沉浸于上述培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板內(nèi)的溶液中，支架下層(即支架的下 2/3僅表面脫鈣的部分)曝露于溶液外，液面距支架的脫鈣界面(即支架上、下層界面)5mm 處，加入0. lml 2% (w/v)CaCl2溶液，培養(yǎng)板放入4°C冰箱10分鐘，取出培養(yǎng)板，吸出孔中 多余液體，手術(shù)刀片切除支架外多余凝膠，即獲得本發(fā)明所述的組織工程骨軟骨復(fù)合體。另一個(gè)具體實(shí)施方案中，用1. 2% (w/v)纖維蛋白原溶液替代1. 2% (v/w)藻酸鈉 溶液，用0.1ml 2%凝血酶溶液替代2% ( 八)&(12溶液，其他步驟相同。另一方面，本發(fā)明提供了一種用上述方法制備的組織工程骨軟骨復(fù)合體，所述組 織工程骨軟骨復(fù)合體包括作為主體支架的組織工程骨軟骨支架，以及作為二級支架和分布 載體的凝膠類物質(zhì)。本發(fā)明所述的組織工程骨軟骨支架是通過對松質(zhì)骨分層脫鈣制備而成，是一種以 松質(zhì)骨為主體的組織工程支架。本發(fā)明所述組織工程骨軟骨支架由于采用了基于松質(zhì)骨的 分層脫鈣技術(shù)，因此該組織工程骨軟骨支架上層完全脫鈣，可作為工程軟骨支架或工程軟 骨支架的框架部分；下層表面脫鈣，可作為工程骨支架或骨形成材料，同時(shí)起到工程軟骨的 固定支點(diǎn)的作用。本發(fā)明所述的凝膠類物質(zhì)優(yōu)選為纖維蛋白原或藻酸鹽凝膠類物質(zhì)。


圖1圖示的是分層脫鈣組織工程骨軟骨支架樹脂包埋硬組織切片HE染色大體顯 微鏡下拍攝的圖片，如圖所示，支架的上1/3部分(即一指向部分)及支架下2/3部分(即 =>指向部分)的外周表面染淺紅色，表明該區(qū)域已完全脫鈣脫細(xì)胞；支架的下2/3部分 的中心區(qū)域染紫藍(lán)色，表明該區(qū)域未脫鈣。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.完全天然生物材料。目前同種異體冷凍干燥骨和纖維蛋白膠在臨床已經(jīng)廣泛應(yīng) 用，藻酸作為組織工程軟骨支架材料已經(jīng)臨床使用；2.上層脫鈣骨基質(zhì)均勻復(fù)合凝膠后形成一體化的結(jié)構(gòu)，DBM起到支架的力學(xué)支撐 框架結(jié)構(gòu)作用、與下層骨支架完全天然有機(jī)結(jié)合一體化作用、增加支架柔韌性和BMP載體 的作用，凝膠作為種子細(xì)胞的分布載體，可使軟骨種子細(xì)胞在工程軟骨層均勻分布，增加上 層軟骨支架的硬度，能獲得更接近于軟骨組織的力學(xué)性能，同時(shí)凝膠類物質(zhì)能較好的促進(jìn) 種子細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化；
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3.支架完全一體化，可構(gòu)建出完全一體化的組織工程骨軟骨；4.可根據(jù)需要，在上下兩層分別添加不同的種子細(xì)胞；5.凝膠封閉了上層DBM與下方脫細(xì)胞松質(zhì)骨支架交界區(qū)的空隙，這樣在交界區(qū)就 形成了兩種界面，即DBM/松質(zhì)骨界面、凝膠/松質(zhì)骨界面，有效的防止了下方血管長入造成 軟骨修復(fù)組織的骨化可能，同時(shí)提供軟骨種子細(xì)胞的乏氧環(huán)境。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅 用于說明本發(fā)明而絕不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科 技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一 專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通 常采用常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實(shí)施例實(shí)施例1用新鮮牛股骨髁為原料制備組織工程骨軟骨支架從市場采購新鮮牛股骨髁，剔除其上附著的肌肉及韌帶組織，鋸成2cm厚的骨片 后，將骨片用高壓水槍三蒸水沖洗洗去骨髓，剪除骨皮質(zhì)，無水乙醇脫水，乙醚脫脂，風(fēng)干。 然后用1cm直徑環(huán)鉆，將上述處理過的牛股骨髁制成直徑為1cm的松質(zhì)骨柱。將松質(zhì)骨柱 下2/3部分用石蠟包埋。將下2/3部分包埋石蠟后的松質(zhì)骨柱置于10% (w/v)EDTA溶液中 脫鈣2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蠟，PBS緩沖液浸泡1周以上，再冷凍干燥，即得 本發(fā)明所述的組織工程骨軟骨支架，將所述組織工程骨軟骨支架鈷6°消毒備用。實(shí)施例2HE染色鑒定組織工程骨軟骨支架的脫鈣效果將實(shí)施例1中制得的組織工程骨軟骨支架分別進(jìn)行樹脂包埋，硬組織切片，HE染 色后，置于大體顯微鏡下拍照觀察，如圖1所示。結(jié)果顯示支架的上層(即支架的上1/3 部分)支架的下層(即支架的下2/3石蠟包埋部分)的外周染淺紅色，支架的下層(即支 架的下2/3石蠟包埋部分)的中央?yún)^(qū)域染紫藍(lán)色，上、下層之間的界面非常清晰。由此可見，通過本發(fā)明所述的分層脫鈣處理，制得的組織工程骨軟骨支架的上層 (即上1/3部分)脫鈣、脫細(xì)胞完全，支架的下層(即下1/3石蠟包埋部分)僅表面脫鈣，中 心區(qū)域未脫鈣。實(shí)施例3藻酸鈉凝膠為二級支架構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體收集常規(guī)方法培養(yǎng)擴(kuò)增的兔2代軟骨細(xì)胞，以1.2% (v/w)藻酸鈉溶液稀釋成 4X 107ml，取0. 5ml上述細(xì)胞懸液加入到48孔培養(yǎng)板的孔中，將實(shí)施例1制備的分層組織 工程骨軟骨支架倒立，讓支架上層(即支架完全脫鈣部分)且僅讓上層沉浸于上述培養(yǎng)皿 或培養(yǎng)板內(nèi)的溶液中，支架下層(即支架的僅表面脫鈣的部分)曝露于溶液外，液面距支架 的脫鈣界面(即支架上、下層界面)5mm處，加入0. lml 2% (w/v)CaCl2溶液，培養(yǎng)板放入 4°C冰箱10分鐘，取出培養(yǎng)板，吸出孔中多余液體，手術(shù)刀片切除支架外多余凝膠，即獲得 本發(fā)明所述的組織工程骨軟骨復(fù)合體。實(shí)施例4纖維蛋白原凝膠為二級支架構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體收集常規(guī)方法培養(yǎng)擴(kuò)增的兔2代軟骨細(xì)胞，以1. 2% (w/v)纖維蛋白原溶液稀釋 成4X 107ml，取0. 5ml上述細(xì)胞懸液加入到48孔培養(yǎng)板的孔中，將實(shí)施例1制備的分層組 織工程骨軟骨支架倒立，讓支架上層(即支架完全脫鈣部分)且僅讓上層沉浸于上述培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板內(nèi)的溶液中，支架下層(即支架的僅表面脫鈣的部分)曝露于溶液外，液面距支 架的脫鈣界面(即支架上、下層界面)5mm處，加入0. lml 2% (w/v)凝血酶溶液，培養(yǎng)板放 入4°C冰箱10分鐘，取出培養(yǎng)板，吸出孔中多余液體，手術(shù)刀片切除支架外多余凝膠，即獲 得本發(fā)明所述的組織工程骨軟骨復(fù)合體。
權(quán)利要求
一種組織工程骨軟骨復(fù)合體，其中包括作為主體支架的組織工程骨軟骨支架，以及作為二級支架和分布載體的凝膠類物質(zhì)，其特征在于所述的組織工程骨軟骨支架是通過對松質(zhì)骨柱分層脫鈣制備而成，上層完全脫鈣，是工程軟骨支架或工程軟骨支架的框架部分，下層表面脫鈣，是工程骨支架或骨形成材料，同時(shí)起工程軟骨的固定支點(diǎn)的作用；所述的凝膠類物質(zhì)為纖維蛋白原凝膠或藻酸鹽凝膠。
2.一種制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的方法，該方法包括1)以動物骨或者深低溫冷凍人骨為原料制備松質(zhì)骨柱；2)將步驟1)制得的松質(zhì)骨柱進(jìn)行分層脫鈣，得到上層完全脫鈣，下層僅表面脫鈣的組 織工程骨軟骨支架，以該支架作為制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的主體支架；3)將培養(yǎng)擴(kuò)增后的軟骨種子細(xì)胞收集后稀釋于纖維蛋白原溶液或藻酸鈉溶液中；4)將步驟3)得到的含軟骨種子細(xì)胞的纖維蛋白原溶液或藻酸鈉溶液置于培養(yǎng)皿或培 養(yǎng)板中；5)將主體支架倒立，讓支架上層(即完全脫鈣部分)且僅讓上層沉浸于上述培養(yǎng)皿或 培養(yǎng)板內(nèi)的溶液中，支架下層(即僅表面脫鈣部分)曝露于溶液外；6)調(diào)整溶液量，添加0.lml 2% (w/v)凝血酶溶液或&(12溶液，使上述溶液形成凝膠， 凝膠的表面與主體支架上、下層的界面基本重合；7)將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板放入4°C冰箱10分鐘，取出培養(yǎng)板，吸出孔中多余液體，切除支架 外多余凝膠，即獲得所述的組織工程骨軟骨復(fù)合體。
3.權(quán)利要求2所述的制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的方法，其中所述的制備松質(zhì)骨柱的 方法為取動物骨或者深低溫冷凍人骨，剔除其上附著的肌肉及韌帶組織，鋸成2cm厚的骨 片，然后將骨片用高壓水槍三蒸水沖洗洗去骨髓，剪除骨皮質(zhì)，無水乙醇脫水，乙醚脫脂，風(fēng) 干后，用環(huán)鉆動物骨制成直徑為4mm的松質(zhì)骨柱。
4.權(quán)利要求2或3所述的制備組織工程骨軟骨復(fù)合體的方法，其中所述的動物骨為新 鮮的牛骨股骨踝。
5.權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的制備組織工程骨軟骨支架的方法，其中所述的分層 脫鈣為將制備得到的松質(zhì)骨柱按所需比例劃分為上、下兩部分，下面的部分用石蠟包埋， 然后將該松質(zhì)骨柱整體置于EDTA溶液中脫鈣，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蠟，PBS緩 沖液浸泡1周，再冷凍干燥。
6.權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的制備組織工程骨軟骨支架的方法，其中所述的所需 比例為1 1 1 2，優(yōu)選為1 2。
7.權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的制備組織工程骨軟骨支架的方法，其中所述的軟骨 種子細(xì)胞為軟骨細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞。
8.權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的制備組織工程骨軟骨支架的方法，其中所述的軟骨 種子細(xì)胞以4X 107/ml稀釋于纖維蛋白原溶液或藻酸鈉溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于軟骨組織修復(fù)和組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種組織工程骨軟骨復(fù)合體及其制備方法。具體而言，將異體或異種松質(zhì)骨，去骨髓、脫脂、和分層脫鈣，得到上層完全脫鈣、下層僅表面脫鈣的組織工程骨軟骨支架。以該支架為主體支架，再加入纖維蛋白原或藻酸等凝膠類物質(zhì)作為二級支架和分布載體，從而得到本發(fā)明所述的組織工程骨軟骨復(fù)合體。與現(xiàn)有組織工程骨軟骨相比，本發(fā)明所述的軟骨復(fù)合體具有完全天然生物材料、完全一體化、不需要分層疊加及界面結(jié)合技術(shù)、具有良好的抗壓、抗拉伸和抗剪切性能，細(xì)胞加載均勻而精確、可有效促進(jìn)種子細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化、操作簡單、便于關(guān)節(jié)鏡下微創(chuàng)手術(shù)操作等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61L27/36GK101816806SQ20101010748
公開日2010年9月1日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者余方圓, 劉海容, 馬遠(yuǎn)征, 黃利虹 申請人:余方圓