專利名稱：殼聚糖修飾的海藻酸鹽水凝膠三維多孔支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織構(gòu)建用三維多孔模板材料的制造，特別是一種殼聚糖修飾的海藻
酸鹽水凝膠三維多孔支架及其制備方法，具體為特異體外降解性的海藻酸鹽水凝膠三維多 孔支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程利用生命科學(xué)與工程科學(xué)的原理和方法，研究和開發(fā)具有修復(fù)或改善人 體組織或器官功能的新一代臨床應(yīng)用的取代物，用于替代組織或器官的一部分或全部功 能。組織工程的發(fā)展對生物材料提出了新的挑戰(zhàn)，以往生物材料的研究與開發(fā)多從材料的 化學(xué)、物理以及加工性能構(gòu)思，并沒有從所植入生物材料的細(xì)胞水平和分子水平進(jìn)行設(shè)計， 相關(guān)細(xì)胞在許多生物材料上能夠很好地生長，但組織在體內(nèi)的重建還涉及神經(jīng)引導(dǎo)、血管 再生等問題，細(xì)胞還受到宿主損傷部位及其周圍健康組織產(chǎn)生的信號分子的調(diào)控。因此，理 想的組織工程用生物材料應(yīng)和目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)的特異粘連因子以及生長因子受體產(chǎn)生特異 作用，使目標(biāo)細(xì)胞遷移至損傷部位，剌激其生長與分化，且隨著組織的修復(fù)能被細(xì)胞釋放的 相關(guān)酶成分完全降解。這有待于從分子水平設(shè)計和制備出剌激特異細(xì)胞反應(yīng)的、具有生物 活性的可吸收材料。另一方面，在體外構(gòu)建三維組織結(jié)構(gòu)物的經(jīng)典方法是將細(xì)胞種植于多 孔支架中進(jìn)行一定時間的體外培養(yǎng)。所形成的工程化組織通常由支架材料、細(xì)胞以及細(xì)胞 合成的細(xì)胞外基質(zhì)組成，即支架材料在細(xì)胞培養(yǎng)階段通常并不降解，將所構(gòu)建的三維組織 植入人體后，人工制備的支架材料具有產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)的潛在危險性[(a)Kim M S，Ahn H H，Shin Y N，et al. Biomaterials，2008，28 :5137-5143 ; (b)Williams D F，Biomaterials， 2008， 29 :2941-2953]。 日本的0kano研究組開創(chuàng)性地用接枝有溫度響應(yīng)性聚合物如聚異丙基丙烯酰 胺(PIPAAm)的表面成分培養(yǎng)細(xì)胞，并通過降低溫度得到了完整的由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組 成的細(xì)胞片層，此二維細(xì)胞片層可直接用于組織重建，亦可通過多層疊加形成三維組織 結(jié)構(gòu)物，這種技術(shù)稱為細(xì)胞片層工程。通過分子設(shè)計和研究新的表面處理方法，接枝有 溫敏性PIPAAm類聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)表面的性能有了很大的提高[(a)Nishida K， Yamato M， 0kano T， N Engl JMed，2004，351 :1187-1196 ;(b)Yamato M， Akiyama Y， 0kano T， et al.Prog Polym Sci ;2007，32 :1123-1133 ; (c)Idota N， Tsukahara T， 0kano T， et al. Biomaterials， 2009， 30 :2095-2101]。目前，細(xì)胞片層技術(shù)已應(yīng)用于多種組織的修復(fù) 與重建，包括角膜前上皮、食管上皮、泌尿道上皮、牙周韌帶、心肌和肝臟等[Matsuda N， Shimizu T， 0kano T， et al. Adv Mater， 2007， 19 :3089-3099]。在蛋白質(zhì)類水凝膠或纖維 素類水凝膠表面黏附和擴(kuò)增后形成的細(xì)胞片層亦可通過蛋白酶或纖維素酶的酶解過程從 培養(yǎng)板表面剝離下來[(a)Nagai N， Yunoki S， Satoh Y， et al. JBiosci Bioeng， 2004， 98 : 493-496 ; (b)Sakai S，0gushi Y，Kawakami K，Acta Biomaterialia，2009，5 :554-559]。在 磁場作用下，磁性陽離子脂質(zhì)體吸附于細(xì)胞培養(yǎng)板表面可形成特異磁場響應(yīng)性修飾層，種 植于此培養(yǎng)表面的成纖維細(xì)胞經(jīng)黏附、鋪展和增殖后很快形成細(xì)胞片層，而撤離磁場后該二維細(xì)胞片層很容易剝離下來；用磁性陽離子脂質(zhì)體標(biāo)記成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞后，在磁場 力作用下可直接在親水性表面形成兩種細(xì)胞混合的細(xì)胞片層，此類技術(shù)稱為磁場力細(xì)胞片 層技術(shù)[(a)Ito A，Ino K，Kobayashi T，et al. Biomaterials， 2005， 26 :6185—6193 ; (b) Ito A，Jitsunobu H，Kawabe Y，et al.J Biosci Bioeng，2007，104 :371-378]。
如前所述，細(xì)胞片層技術(shù)獲得了長足的進(jìn)步，在多種組織的修復(fù)與重建中表現(xiàn)出 潛在的應(yīng)用前景。但通過細(xì)胞片層技術(shù)只能構(gòu)建二維或厚度為微米級的三維工程化組織， 同時構(gòu)建過程中并不能為相關(guān)細(xì)胞提供所需的三維生長微環(huán)境[(a)0hashi K， Yokoyama T， Yamato M， etal. Nature Med，2007，13 :880-885 ;(b)Zhang S， Gelain F， Zhao X， Semin Cancer Biol， 2005， 15 :413-420]。毫米級的單純由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的大塊三維組 織的構(gòu)建還需要進(jìn)一步探索其他方法與技術(shù)，這將面臨很多困難與挑戰(zhàn)，如模板材料降解 后所構(gòu)建工程化組織的強(qiáng)度和形狀保持能力、細(xì)胞的存活與功能保持、代謝等。Matsusaki 研究組將二硫鍵引入到化學(xué)交聯(lián)聚Y-谷氨酸水凝膠中，將其作為模板材料在體外構(gòu)建了 單純由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的三維工程化組織[Matsusakia M， Yoshida H， Akashi M， Biomaterials， 2007， 28 :2729-2737]。但對于由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的聚Y-谷氨酸的研究大 部分還處在實驗室階段，作為生物材料使用時其純度還有待進(jìn)一步提高[Bajaj I B，Lele S S，Singhal R S，Biores Tech，2009，100 :826-832]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖修飾的海藻酸鹽水凝膠三維多孔支架及其制 備方法。采用更加容易獲得，并且具有良好生物相容性的海藻酸鈉作為原材料，以胱胺或胱 胺酸二甲酯作為交聯(lián)劑，在水溶性碳二亞胺的活化作用下使海藻酸鈉發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)， 從而得到穩(wěn)定的海藻酸鹽共價交聯(lián)水凝膠。水凝膠經(jīng)冷凍干燥后可得到多孔結(jié)構(gòu)的三維 支架。通過表面改性和修飾過程將活性物質(zhì)引入到材料表面，提高了此類海藻酸鹽水凝膠 的力學(xué)強(qiáng)度和細(xì)胞親和性。將細(xì)胞種植于多孔支架中，在體外培養(yǎng)一定時間后可形成三維 的細(xì)胞/支架結(jié)構(gòu)物。細(xì)胞培養(yǎng)后期向培養(yǎng)液加入適宜濃度的半胱胺酸J-乙?；腚装?酸、谷胱甘肽等還原劑成分時，海藻酸鹽水凝膠交聯(lián)橋上的二硫鍵斷開，即發(fā)生二硫鍵-巰 基轉(zhuǎn)化反應(yīng)，從而使水凝膠解體，而解體后的水凝膠降解產(chǎn)物可溶解于細(xì)胞培養(yǎng)液中，得到 完全由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的二維細(xì)胞片層或三維組織結(jié)構(gòu)物。海藻酸鹽水凝膠多孔支 架作為模板材料應(yīng)用于組織工程時，可以將多孔支架的厚度、尺寸、形狀完全轉(zhuǎn)移到所獲得 的三維工程化組織中，從而可在體外構(gòu)建毫米級的大塊三維組織。由于交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)中的二 硫鍵可以在谷胱甘肽等還原劑的作用下以較快速率分解為巰基，因此此類化學(xué)交聯(lián)海藻酸 鹽水凝膠三維多孔支架具備特異的體外降解性能。 本發(fā)明制備方法簡單、原料來源豐富、價廉易得、水凝膠的各項理化性能、力學(xué)強(qiáng) 度、降解速率以及表面特性在很大范圍內(nèi)可控。通過表面改性和修飾過程將生物活性物質(zhì) 引入到材料表面，可以顯著提高三維多孔支架的力學(xué)強(qiáng)度和形狀保持能力，有效改善支架 材料的細(xì)胞親和性，但對其降解性能影響有限。 本發(fā)明提供的一種殼聚糖修飾的水凝膠三維多孔支架是以海藻酸鈉為原料，將海 藻酸鈉溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，海藻酸鈉中的羧基可以在水溶性碳二亞胺的活化作用下 與交聯(lián)劑胱胺或胱胺酸二甲酯中的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)水凝膠，預(yù)凍后冷凍干燥，用殼聚糖對得到的多孔支架進(jìn)行表面修飾。
海藻酸鈉單元水溶性碳二亞胺=i : 2(摩爾比)，海藻酸鈉單元交聯(lián)劑=
2 2.5 : 0.63 2.5(摩爾比)，殼聚糖對海藻酸鹽水凝膠多孔支架孔壁的修飾量約為 1 25ii g/cm2，殼聚糖的分子量選擇1 100k。 本發(fā)明提供的殼聚糖修飾的海藻酸鹽水凝膠三維多孔支架的制備方法經(jīng)過下述 的步驟 1)室溫和攪拌下，向海藻酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 5)中加入水溶性碳二亞 胺(EDC)，攪拌30min后再加入胱胺或胱氨酸二甲酯完全溶解，倒入塑料培養(yǎng)板中，室溫下 放置0. 1 10h形成水凝膠。海藻酸鈉的濃度35 45mg/mL。海藻酸鈉單元EDC=1 : 2，海藻酸鈉單元交聯(lián)劑=2 2. 5 : O. 63 2. 5，
均是摩爾比。 2)將上述水凝膠放入冰箱中預(yù)冷凍24小時，冷凍干燥2d，可得到多孔支架材料。
3)在殼聚糖溶液中浸泡1 10h，使殼聚糖成分吸附到多孔支架孔隙表面從而對 其進(jìn)行修飾。經(jīng)表面修飾的多孔支架在磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4)中浸泡24小時。
4)將表面處理后的多孔支架放入冰箱中再次預(yù)凍后冷凍干燥(方法同步驟2)，可 得到力學(xué)強(qiáng)度和細(xì)胞親和性均良好的多孔支架材料。 步驟2)與步驟4)中預(yù)冷凍溫度為-20 _80°C ，冷凍干燥溫度為0 20°C 。
步驟3)中的殼聚糖溶液濃度選擇1 10mg/mL。 本發(fā)明中，由于海藻酸鈉分子量較大，當(dāng)濃度過高時不易溶解，并且所制備三維多 孔支架的降解時間過長，不適于作為體外細(xì)胞培養(yǎng)模板材料使用。為了縮短降解時間，本發(fā) 明采用了濃度為35 45mg/mL的海藻酸鈉溶液制備水凝膠及其三維多孔支架，但在保持一 定降解速率的前提下支架材料的力學(xué)強(qiáng)度不足，特別是在水合作用下力學(xué)強(qiáng)度下降較快， 甚至影響到多孔材料的形狀保持能力。另一方面，海藻酸鹽水凝膠應(yīng)用于組織工程時，由于 分子鏈過于親水不能有效吸附蛋白成分、缺乏細(xì)胞結(jié)合位點、不能和細(xì)胞發(fā)生特異相互作 用?；谏鲜鲈?，同時考慮到海藻酸鹽為陰離子型聚電解質(zhì)，通過與細(xì)胞親和性良好的聚 陽離子物質(zhì)的靜電相互作用對化學(xué)交聯(lián)海藻酸鹽水凝膠及其多孔支架進(jìn)行了表面處理，以 同時提高力學(xué)強(qiáng)度和細(xì)胞親和性。 本發(fā)明選用的交聯(lián)劑為胱胺或胱胺酸二甲酯，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用胱氨酸二甲酯作 為交聯(lián)劑時，所得水凝膠強(qiáng)度很高，但不易降解；而使用胱胺作為交聯(lián)劑時，水凝膠雖然較 易降解，但是由于胱胺的交聯(lián)能力有限，其強(qiáng)度有待進(jìn)一步提高，本發(fā)明選擇用聚陽離子物 質(zhì)殼聚糖溶液修飾其表面來提高強(qiáng)度。支架未經(jīng)修飾時的溶脹率約為20 40g/g，經(jīng)修飾 后的溶脹率約為5 10g/g。 殼聚糖的分子量和溶液濃度均對表面修飾效果產(chǎn)生重要影響。殼聚糖溶液的濃 度過低時達(dá)不到修飾增強(qiáng)的目的，而當(dāng)濃度過高時水凝膠三維多孔材料的降解時間明顯延 長，因此本發(fā)明采用了濃度為1 10mg/mL的殼聚糖溶液，優(yōu)選2 7mg/mL。另一方面，當(dāng) 采用過低或過高分子量的殼聚糖作為聚陽離子物質(zhì)時，對海藻酸鹽水凝膠及其多孔支架的 表面修飾及增強(qiáng)效果有限，因此選用了 1 100k分子量的殼聚糖，其中3 50k分子量的 殼聚糖修飾效果較好。 本發(fā)明制備方法簡單、原料來源豐富、價廉易得、水凝膠的各項理化性能、力學(xué)強(qiáng)
5度、降解速率以及表面特性在很大范圍內(nèi)可控。通過表面改性和修飾過程將生物活性物質(zhì) 引入到材料表面，可以顯著提高三維多孔支架的力學(xué)強(qiáng)度和形狀保持能力，可以有效改善 支架材料的細(xì)胞親和性，但對其降解性能影響有限。
具體實施例方式
本發(fā)明所用的主要原料海藻酸鈉、EDC、胱胺或胱胺酸二甲酯、殼聚糖均為市售。
實施例1 : (1)稱取0. 40g海藻酸鈉溶解于10mL的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 5)中，在室溫條件 下攪拌至海藻酸鈉完全溶解。 (2)向溶液(1)中加入0. 87g的EDC，在4。C下攪拌30min。 (3)向溶液(2)中加入0. 28g胱胺作為交聯(lián)劑，經(jīng)攪拌充分溶解后，將反應(yīng)溶液倒 入塑料培養(yǎng)板中，并在室溫下放置3h形成水凝膠。 (4)將步驟(3)得到的水凝膠放入-50°C的冰箱中預(yù)凍24小時后冷凍干燥2d，可 得到多孔支架材料。這種未經(jīng)修飾的三維多孔支架在去離子水中的溶脹率約為35g/g，在 50mM濃度的半胱氨酸溶液中的降解時間約為15h。 (5)將步驟(4)得到的多孔支架在3mg/mL殼聚糖(分子量5k)溶液中浸泡4h，使 殼聚糖溶液吸入到多孔支架孔隙從而對其孔壁表面進(jìn)行修飾。 (6)將步驟(5)得到的濕態(tài)多孔支架再次冷凍干燥(方法同步驟4)，可得到力學(xué) 強(qiáng)度和細(xì)胞親和性均良好的多孔支架材料。經(jīng)修飾的三維多孔支架在去離子水中的溶脹率 約為7g/g，在50mM濃度的半胱氨酸溶液中的降解時間約為16h。
實施例2 : 原料、制備方法與實施例1基本相同。將實施例1中的步驟(3)調(diào)整為胱胺加入 量為0.56g，步驟(5)中的殼聚糖分子量調(diào)整為10k，其它步驟相同。該配比未經(jīng)修飾的三 維多孔支架溶脹率約為24g/g。經(jīng)殼聚糖溶液修飾后的三維多孔支架溶脹率為6g/g。
實施例3: 原料、制備方法與實施例1基本相同。將實施例1中的步驟(1)調(diào)整為海藻酸 鈉加入量為0. 45g，步驟(2)調(diào)整為EDC加入量為0. 96g。未修飾的三維多孔支架強(qiáng)度較 低，只能勉強(qiáng)維持其形狀，溶脹率約為29g/g。而修飾后的三維多孔支架壓縮強(qiáng)度可以達(dá)到 4. 5士1.3kPa，壓縮模量約為27. 4±6. lkPa，溶脹率為8g/g。
實施例4 : 原料、制備方法與實施例3基本相同。將實施例3中的步驟(3)調(diào)整為胱胺加入 量為0.56g，其它步驟相同。該配比未經(jīng)修飾的三維多孔支架溶脹率為24g/g。經(jīng)殼聚糖溶 液修飾后的三維多孔支架溶脹率約為5g/g。
實施例5 : 原料、制備方法與實施例1基本相同。將實施例1中的步驟(3)中的胱胺調(diào)整為 胱胺酸二甲酯，其加入量為0.04g，步驟(5)中用殼聚糖溶液修飾時間為8h。未修飾的三維 多孔支架能夠勉強(qiáng)維持其形狀，無法測量其壓縮強(qiáng)度，而經(jīng)殼聚糖溶液修飾后的三維多孔 支架壓縮強(qiáng)度可達(dá)到11. 2 ±1. 5kPa，壓縮模量可達(dá)到66. 2 ±8. 4kPa。
權(quán)利要求
一種殼聚糖修飾的水凝膠三維多孔支架，其特征在于它是以海藻酸鈉為原料，將海藻酸鈉溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，海藻酸鈉中的羧基可以在水溶性碳二亞胺的活化作用下與交聯(lián)劑胱胺或胱胺酸二甲酯中的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)水凝膠，預(yù)凍后冷凍干燥得到多孔支架，再用殼聚糖對得到的多孔支架進(jìn)行表面修飾。
2. —種權(quán)利要求1所述的海藻酸鹽水凝膠三維多孔支架，其特征在于交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)中的 二硫鍵可以在半胱氨酸等還原劑的作用下以較快速率分解為巰基，因此此類化學(xué)交聯(lián)海藻 酸鹽水凝膠三維多孔支架具備特異的體外降解性能。
3. 按照權(quán)利要求1所述的殼聚糖修飾的水凝膠三維多孔支架，其特征在于所述的殼聚 糖的分子量為1 100k。
4. 一種權(quán)利要求1所述的殼聚糖修飾的海藻酸鹽水凝膠三維多孔支架的制備方法，其 特征在于它是經(jīng)過下述的步驟1) 在室溫和攪拌下，海藻酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 5)中加入水溶性碳二亞胺，攪 拌30min后再加入胱胺或胱氨酸二甲酯完全溶解，倒入塑料培養(yǎng)板中，室溫下放置0. 1 10h形成水凝膠；海藻酸鈉的濃度35 45mg/mL ;2) 將上述水凝膠放入冰箱中預(yù)冷凍24小時，冷凍干燥2d得到多孔支架材料；3) 在殼聚糖溶液中浸泡，然后在磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4)中浸泡24小時；4) 放入冰箱中再次預(yù)凍后冷凍干燥，方法同步驟2)，得到最終產(chǎn)品。
5. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的海藻酸鈉單元水溶性碳二亞胺= 1 : 2(摩爾比)，海藻酸鈉單元交聯(lián)劑=2 2. 5 : 0.63 2. 5(摩爾比)，殼聚糖對海 藻酸鹽水凝膠多孔支架孔壁的修飾量約為1 25ii g/cm2。
6. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟2)與步驟4)中所述的預(yù)冷凍溫度 為-20 -80°C ，冷凍干燥溫度為0 20°C 。
7. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的殼聚糖溶液濃度為1 10mg/mL。
8. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的浸泡時間為1 10h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖修飾的具有特異體外降解性的海藻酸鹽水凝膠三維多孔支架及其制備方法。它是以海藻酸鈉為原料，將海藻酸鈉溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，海藻酸鈉中的羧基在水溶性碳二亞胺的活化作用下與交聯(lián)劑胱胺或胱胺酸二甲酯中的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)，從而形成化學(xué)交聯(lián)水凝膠。通過冷凍干燥可得到水凝膠的多孔支架材料，再用殼聚糖對多孔支架進(jìn)行表面修飾。在適宜濃度的半胱胺酸等還原劑溶液中，水凝膠交聯(lián)橋中的二硫鍵通過二硫鍵-巰基轉(zhuǎn)化反應(yīng)發(fā)生降解，從而使多孔支架解體而溶解消失。因此可將此類多孔支架作為體外細(xì)胞培養(yǎng)模板材料使用。本發(fā)明研究的水凝膠多孔支架制備簡單、原料來源豐富、價廉易得，支架材料的各項理化性能、力學(xué)強(qiáng)度、降解速率以及表面特性在很大范圍內(nèi)可控。
文檔編號A61L27/20GK101773683SQ20101011633
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者尹玉姬, 趙燕燕, 高思齊 申請人:天津大學(xué)