專利名稱：一類蛋白質(zhì)多肽的復(fù)合分子及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，提供了一類代謝半衰期延長、過敏源性降低的活性蛋白質(zhì)或多肽的串聯(lián)體。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)藥物已成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分。如促紅細(xì)胞生長素、粒細(xì)胞集落刺激因子、干擾素、白介素、胰島素以及各種疫苗等。目前已有50種以上重要的治療藥物上市，近1000種生物技術(shù)藥物正進(jìn)行臨床試驗(yàn)或接受各國藥監(jiān)部門審評。但是蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)會被快速清除，組織中大量存在的蛋白酶和腎小球?yàn)V過是藥物快速清除的生理途徑。為了維持一定的療效需要大劑量頻繁用藥，長期的反復(fù)注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。因此臨床上需要研制長效的蛋白質(zhì)藥物。減少蛋白質(zhì)藥物水解，同時降低腎小球的濾過作用，這是延長藥物半衰期的有效途徑。聚乙二醇修飾是制備長效蛋白的方法之一。聚乙二醇是經(jīng)環(huán)氧乙烷聚合而成的，由重復(fù)的氧乙烯基組成。不僅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、N、 二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有機(jī)溶劑，具有線性(相對分子量1000 100000)或支化(相對分子量為5000 60000)的鏈狀結(jié)構(gòu)，線性PEG分子式為H-(0-CH2-CH2) n-OH。普通的聚乙二醇兩端各有一個羥基，若一端以甲基封閉則得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，線性mPEG的分子式為CH3-(0-CH2_CH2)n-0H，在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究中應(yīng)用最多的是mPEG的衍生物。聚乙二醇是中性、無毒、具有良好的生物相溶性的高分子聚合物，是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的少數(shù)能作為體內(nèi)注射藥用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學(xué)體積，并且沒有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識別。聚乙二醇類修飾劑的藥物動力學(xué)性質(zhì)因它們的相對分子量和注射給藥方式而異，分子量越大，半衰期越長。經(jīng)過細(xì)胞色素P450系統(tǒng)的氧化作用，PEG分解成小分子的PEG，經(jīng)膽汁排泄。藥物經(jīng)過聚乙二醇修飾后，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、更長的半衰期；2、較少的酶降解作用；3、較少的免疫原性及抗原性；4、較小的毒性；5、用藥頻率減少；6、更好的溶解性等。修飾途徑對蛋白和多肽主要有氨基修飾(包括N端氨基的?；揎?、賴氨酸側(cè)鏈氨基的?；揎?、羧基修飾、巰基修飾等，其中主要是對N末端或賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行?；揎?。因?yàn)榈鞍谆蛟S多多肽結(jié)構(gòu)中存在多個氨基，所以控制和確定修飾位點(diǎn)及修飾程度一直是蛋白和多肽的聚乙二醇修飾中的難點(diǎn)，肽類化合物的合成中可以通過采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)策略來實(shí)現(xiàn)對氨基的定點(diǎn)修飾。蛋白藥物的PEG修飾已有許多成功的先例，1991年第一種用PEG修飾的蛋白藥物PEG-ADA被FDA批準(zhǔn)上市，近幾年上市的有PEG-干擾素、PEG-GSF、PEG-生長抑素。處于臨床前研究的PEG修飾的蛋白藥物有幾十種，處于臨床實(shí)驗(yàn)的有牛血紅蛋白、降鈣素、表皮生長因子、白介素-2、水蛭素(II期，BASF AG公司)、抗-TNF α抗體片段(III期，Pharmacia 公司)、超氧化物歧化酶、抗-PDGF抗體片段(II期，Celltech公司)等。經(jīng)聚乙二醇共價修飾后，蛋白質(zhì)藥物的相對分子質(zhì)量有所增加，減少了藥物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的穩(wěn)定性，降低免疫原性，這些改變均有利于延長藥物在體內(nèi)的半衰期，從而，蛋白質(zhì)藥物的藥代動力學(xué)和藥效性質(zhì)得到明顯改善。例如，PEG修飾的干擾素α與未修飾的干擾素α相比，半衰期延長10 20倍；超氧化物歧化酶PEG修飾前半衰期為5分鐘，PEG修飾后半衰期延長至 4. 2h [Veronese FM 等，2005]。白蛋白修飾也是制備長效蛋白或者多肽的有效方法之一。近年來，采用人血白蛋白對蛋白和多肽進(jìn)行修飾也取得了一些進(jìn)展。中國專利局收錄了其中一些研究成果。采用白蛋白修飾的干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素等的研究獲得了一些有益的成果。制備活性蛋白和多肽的串聯(lián)體或者其它各種形式的串聯(lián)體也是增加藥物半衰期的方法之一。蛋白質(zhì)和多肽藥物的串聯(lián)體一般通過基因工程手段制備。在基因表達(dá)過程中把編碼蛋白和多肽單體的基因串聯(lián)起來，間隔以編碼甘氨酸和絲氨酸的堿基，表達(dá)出來的蛋白或多肽串聯(lián)體往往含有不同長短的甘氨酸和絲氨酸接頭。如文獻(xiàn)報道的人胸腺素α 1串聯(lián)體(薛曉暢等，2001)。這種方式的弊端是可能形成新的抗原提呈位點(diǎn)，引起免疫反應(yīng)；另外，對于接頭的長短選擇有較大限制，長接頭將給基因表達(dá)帶來麻煩，不如PEG選擇方便。綜上所述，圍繞蛋白質(zhì)和多肽分子制備新型的修飾分子對于推動蛋白多肽藥物的深入開發(fā)具有很好的應(yīng)用前景。為了更好地挖掘該領(lǐng)域的技術(shù)深度，拓展品種空間，本發(fā)明提供了一類不同于現(xiàn)有技術(shù)的新的修飾藥物。

發(fā)明內(nèi)容
一、本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)和要解決的問題當(dāng)前，蛋白質(zhì)和多肽藥物的長效化、減少過敏、增加水溶性等方面仍然是本領(lǐng)域值得深入研究的目標(biāo)。為了達(dá)到長效，就應(yīng)該從減少藥物在腎小球的濾過和減少蛋白酶降解入手。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)，如聚乙二醇化的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(商品名 Neulasta)、聚乙二醇化的重組人干擾素(商品名配樂能)、聚乙二醇化的門冬酰胺酶(商品名Oncaspar)等產(chǎn)品都是通過用聚乙二醇修飾的方式來延長藥物半衰期或者減少過敏原性的。可見，增大分子質(zhì)量是延長藥物半衰期或者減少過敏原性的有效方式之一，這已經(jīng)成為一個規(guī)律。傳統(tǒng)的增加藥物半衰期的方式是采用單甲氧基聚乙二醇進(jìn)行修飾，或者基因工程法進(jìn)行白蛋白修飾，或者基因工程法制備蛋白或多肽的串聯(lián)體。在現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計采用聚乙二醇等高分子聚合物作為連接功能團(tuán)來制備活性蛋白和多肽串聯(lián)體，借此在同一個產(chǎn)物分子上同時體現(xiàn)聚乙二醇的修飾和蛋白串聯(lián)體的制備。本發(fā)明的這種設(shè)計能夠顯著增加目標(biāo)蛋白或多肽分子的單分子質(zhì)量，借以增加被修飾蛋白或多肽的半衰期并減少抗原性。
這種方案一方面可以使蛋白質(zhì)獲得高分子聚合物修飾后帶來的優(yōu)點(diǎn)(如增大分子量、減少過敏等)；同時，相對于基因工程方法制備串聯(lián)體來說，通過這種化學(xué)連接制備蛋白或多肽串聯(lián)體，具有工藝簡單、高分子聚合物柔性接頭不增加串聯(lián)體分子抗原性等優(yōu)
點(diǎn)ο二、修飾物的選擇(一)修飾劑方面1、修飾劑種類用作蛋白和多肽修飾的大分子可以來源于廣泛的生物材料，如聚烯醇類化合物、 聚醚類化合物、二乙烯基醚與馬來酸酐共聚物、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、氧化乙烯和甲醛共聚物、聚環(huán)氧化物、乙二酸和丙二酸共聚物，以及這些物質(zhì)的衍生物等等。在眾多可選修飾劑中，聚乙二醇是目前本領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的常用修飾劑。1991年P(guān)EG 修飾的腺苷脫氨酶面市后，已陸續(xù)有PEG修飾的門冬酰胺酶、干擾素-a-加和干擾素-a_2b 經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于臨床。因此，選用PEG修飾技術(shù)是本發(fā)明的優(yōu)選方案之一。聚乙二醇與蛋白質(zhì)或多肽分子間的連接是靠聚乙二醇末端的衍生基團(tuán)實(shí)現(xiàn)的。在聚乙二醇修飾藥物的實(shí)踐中，發(fā)生修飾反應(yīng)的端基不限于末端羥基，如醛基、羧基、氨基、對甲苯磺酸酯基等都可以引入到聚乙二醇的羥基末端。在聚乙二醇功能化的過程中，可以將聚乙二醇的末端羥基轉(zhuǎn)化為相同的功能基，也可以轉(zhuǎn)化為不同的功能基，前者叫做同端基遙爪聚乙二醇(homotelechelic PEG)，后者叫做異端基遙爪聚乙二醇(heterotelechelic PEG)。2、修飾劑的端基PEG末端的醇羥基化學(xué)性質(zhì)不活潑，為保證其與藥物活性基團(tuán)間有適宜的反應(yīng)速率，需引入上述基團(tuán)對醇羥基進(jìn)行活化，以利于與蛋白質(zhì)的和ε_氨基的反應(yīng)。 按PEG與蛋白質(zhì)氨基形成的連接鍵類型，活化PEG主要有(1)烷基化PEG (alkylating PEGs，通過烷基鍵連接)，如醛基化PEG(PEG aldehyde)、PEG-三氟乙基磺酸酯(2.2， 2-trifluoroethanesulfonyl, PEG-T)和環(huán)氧烷基化 PEG(PEG 印oxide)。醛基化 PEG 可通過氰基硼烷還原、與R-NH2形成khiff氏堿得到，適于活性中心含有帶正電荷的大分子藥物。但反應(yīng)速率較低，有時需反應(yīng)Mh，長時間的反應(yīng)有可能使不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)失活， PH對反應(yīng)的選擇性有重要影響，pH5左右時醛基化PEG只與a-NH2反應(yīng)。PEG-T是另一種可保持含有正電荷活性中心蛋白質(zhì)活性的PEG修飾劑，但反應(yīng)專屬性不強(qiáng)、定性困難， 環(huán)氧烷基化PEG的反應(yīng)速度也較慢，且其開環(huán)生成的羥基有可能與蛋白質(zhì)發(fā)生副反應(yīng)。 (2)?；疨EG(aCylating PEGs，通過酰胺鍵連接)，其中大多是羧酸化PEG與N-羥基琥珀亞胺(hydroxysuccimidc)所形成的活性酯(PEG-O-X-COOSu)，目前較常用的是PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(PEG-succhnimidyl succinate, PEG-SS)和PEG琥珀酰亞胺基碳酸酯(PEG-succinimidyl carbonate, PEG-SC)。研究表明，-COOSu 基團(tuán)與 PEG 連接的最后一個烷氧基長度對其與氨基或水的反應(yīng)活性有顯著影響，如PEG-0-CH2-CH2-CH2-C00SU 的水解半衰期為23h，而PEG-0-CH2-C00SU僅為0. 75h。此外，用氯甲酸酯活化的PEG與用琥珀酰亞胺活化的PEG相比，修飾反應(yīng)速率低，可控性強(qiáng)，修飾可具有一定的選擇性， 在水相-有機(jī)相體系中的反應(yīng)也較容易。另外，一些常用的活性端基如PEG乙烯基磺酸(PEG-Vinylsulphone)、PEG-碘乙酰胺基、PEG-馬來酰胺和PEG-正吡啶二硫化物 (PEG-Orthopyridyldisulfide)可修飾游離的半胱氨酸，PEG-酰胼(PEG-Hydrazide)可以修飾寡糖側(cè)鏈，PEG-異氰酸酯(PEG-Isocyanate)用來修飾羥基或氨基。其它可供選擇的活性端基還有馬來酰亞胺順丁烯二酰亞胺、硝基苯基碳酸酯、3-(2-吡啶二巰基)丙酸η-羥基琥珀酰亞胺酯、異氰酸、酰胼、琥珀酸、對甲苯磺酸等。3、修飾劑來源上述活性聚乙二醇有些已經(jīng)商品化，另外一些可按照明確的參考文獻(xiàn)進(jìn)行制備。 有了這些活性基團(tuán)的引入方法，制備同端基或者異端基聚乙二醇就很容易了。如可以采用袁明龍等報道的方法制備PEG-對甲苯磺酸酯(中國專利，申請?zhí)?8124012. 7)，可以采用 Zalipsky 報道的方法制備 PEG-NH2 (Zalipsky S, GiIon C, Zilkha A.Eur Polym J. 1983， 19 :177)，可以采用Kern等人報道的方法制備聚乙二醇酯(Kern W，Iwabuchi S，Sato H， Bohmer V. Makromol Chem, 1979，180 :2539)，可以采用 Gecheler 等報道的方法制備聚乙二醇羧酸(Geckeler K,Bayer E. Polym Bull, 1979,1 :691)，而聚乙二醇末端羥基的醛基化可以通過 Harris 等人報道的方法實(shí)現(xiàn)(Harris J Μ, Hundley NH，，Shannon TG, Struch EC. J Org Chem, 1982,47 :4789 ；Harris JM, J Macromol Sci. Reb Macromol Chem Phys C25, 1985,325 ；Harris JM,Yalpani Μ,Van Alstine JM,Struch EC Case MG,Paley MS,Brooks DE. J Polym Sci,PolymChem Ed，1984，22 :341)；異端基遙爪聚乙二醇的制備一般以同端基遙爪聚乙二醇為原料，如hlipsky和Barany的報道提供了一種制備異端基遙爪聚乙二醇的方法(Zalipsky S, BaranyG. polymerPrepr986, 27 1) ；Yukio 等也報道了一種不同的制備異端基要抓聚乙二醇方法，他們用含有指定功能基的引發(fā)劑來引發(fā)環(huán)氧乙烷聚合，首先在PEG的α末端引入氨基和醛基，引入氨基時用乙氰作為引發(fā)劑，由于氰基的吸電子效應(yīng)， 乙氰表現(xiàn)出極強(qiáng)的酸性，因此它很容易用于丁基鋰、萘化鉀等烷基金屬金屬化。當(dāng)用具有縮醛部分的醇鉀鹽(3，3_ 二氧乙基丙醇鉀)作為引發(fā)劑來引發(fā)環(huán)氧乙烷聚合，可以定量地得到α末端帶有縮醛部分的PEG，然后用弱酸處理，縮醛轉(zhuǎn)化為醛基。α-氨基或者α醛基聚乙二醇制備后，用醇鉀鹽處理，得到醇鹽，再用親核試劑經(jīng)過各種方式的變體很容易得到異端基遙爪聚乙二醇(Yukio N, KazumoriK, Vasao K. Polym Pr印r，1997，38 :529)。同端基或者異端基遙爪聚乙二醇可以通過但不限于上述方法獲得，這已經(jīng)是現(xiàn)有技術(shù)手段能夠?qū)崿F(xiàn)的。在本發(fā)明中采用同端基遙爪聚乙二醇時，制備的復(fù)合分子中PEG的兩個活性端往往分別連接在兩個生物活性基團(tuán)相同或者相似的位點(diǎn)上。而異端基遙爪聚乙二醇在本發(fā)明中也有獨(dú)特的用處，它可以使復(fù)合分子中的連接功能團(tuán)上的兩個不同的連接基團(tuán)分別連接在兩個活性功能團(tuán)的不同位點(diǎn)上，同樣能夠達(dá)到本發(fā)明中制備活性功能團(tuán)串聯(lián)體的目的。4、修飾劑分子大小的選擇修飾劑的分子量是影響修飾產(chǎn)物生物活性和其它藥學(xué)和藥理學(xué)特性的因素之一。 修飾產(chǎn)物的大小會影響目標(biāo)復(fù)合分子的藥代動力學(xué)特性，主要是影響腎小球?yàn)V過和蛋白酶降解。腎小球?yàn)V過膜的通透性很高，內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、和上皮細(xì)胞共同的阻礙作用形成了濾過器，是具有大小和電賀選擇性的分子篩(S^hacryl S-200)。只對血漿中的有形成分和大分子幾乎沒有通透性。對于大分子，隨體積的增加，濾過速度急劇下降。水和直徑小于 3. Onm的中性物質(zhì)可以自由通過。就分子量而言，菊粉為5500，是自由通透的上限。分子量達(dá)到70000道爾頓時，幾乎沒有濾過發(fā)生。較大的物質(zhì)，如血漿白蛋白分子量為66000道爾頓，直徑3. Onm，被濾出的極少，在腎小球?yàn)V液內(nèi)的濃度僅有血漿濃度的0. 02%。由于裂孔帶由負(fù)電荷，與相同體積和重量的陽離子比較，陰離子較不易通透。因此，從腎小球?yàn)V過角度出發(fā)，分子量小于70000道爾頓的分枝或線型修飾劑均有可能改變被修飾物在腎小球的濾過率。而修飾物分子量的增大顯然可以更加充分地減少蛋白酶對蛋白質(zhì)和多肽的降解， 從而增加半衰期。但在另一方面，當(dāng)修飾劑分子量增大時，修飾產(chǎn)物的活性一般是呈下降趨勢，如已經(jīng)上市的聚乙二醇化干擾素α - 和α -2b，后者采用12000道爾頓的修飾劑，而前者修飾劑分子量為40000 ；PEG修飾后后者的比活性保留修飾前的30%，而前者修飾后活性只保留了修飾前的3%左右。從本發(fā)明的目的上來說，不同分子量大小的修飾劑均能達(dá)到制備本發(fā)明目標(biāo)物質(zhì) (即采用高分子修飾劑來制備蛋白質(zhì)或者多肽分子的串聯(lián)物)的目的，因此修飾劑分子量大小不是限制本發(fā)明的因素。盡管如此，本發(fā)明就不同的蛋白質(zhì)或者多肽分子的修飾，對修飾劑的分子量大小做了綜合考慮。對于一些相對于人體而言是強(qiáng)過敏原的外源性蛋白和多肽優(yōu)選分子量2000 50000道爾頓的修飾劑，更有選的是分子量10000 40000道爾頓的修飾劑；對于人體的自身蛋白質(zhì)或者多肽分子，修飾時優(yōu)選使用分子量1000 60000道爾頓的修飾劑，更有選的是平均分子量為5000 40000道爾頓的修飾劑。本發(fā)明實(shí)施過程中，修飾劑的更優(yōu)化選擇是選用了平均分子量為5000 30000、 活化端基為醛基的同端基遙爪聚乙二醇衍生物。用于制備這種修飾劑的不同分子量大小的聚乙二醇均可以在現(xiàn)今市場上購買獲得或者定制獲得，而聚乙二醇的醛基化反應(yīng)可以通過本發(fā)明專利前文中提到的Harris等人提供的方法制備獲得。( 二)生物活性蛋白質(zhì)或者多肽1.蛋白質(zhì)或者多肽藥物的活性反應(yīng)官能團(tuán)PEG與多肽或蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)屬于親核反應(yīng)。多肽或蛋白質(zhì)C端的a-COOH、 N端的α-ΝΗ2及賴氨酸(Lys)、門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸 (Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)、甲硫氨酸(Met)、組氨酸(His)等9種氨基酸的側(cè)鏈在一定的介質(zhì)環(huán)境中較易離子化而呈現(xiàn)親核性，親核活性由大到小依次為R-S- > R-NH2 > R-COO- = R-O-0 Cys的巰基是最易被修飾的氨基酸殘基，但Cys在蛋白質(zhì)中的總量很少，通常位于蛋白質(zhì)的二硫鍵和活性中心。Lys占蛋白質(zhì)中所有氨基酸總量的10%，且較少參與構(gòu)成多肽或蛋白質(zhì)的活性中心。目前，PEG通常修飾的位點(diǎn)是大分子表面Lys殘基上的氨基，包括α-NH2或 εΝΗ2。例如干擾素α-加進(jìn)行的PEG修飾結(jié)果表明，94%的修飾位點(diǎn)都集中在干擾素的 Lys31、Lysl21、Lysl31、Lysl34等4個殘基上，其余6%位于Lys70和Lys83。這種修飾反應(yīng)位點(diǎn)的不確定性使得修飾產(chǎn)物是混合物，給終產(chǎn)品質(zhì)量控制帶來困難。當(dāng)每個多肽或者蛋白質(zhì)分子上有多個可供修飾位點(diǎn)時，如果采用具有兩個活化基團(tuán)的修飾物進(jìn)行修飾時， 得到的產(chǎn)物比較復(fù)雜，會出現(xiàn)多種模式的修飾產(chǎn)物。蛋白質(zhì)和多肽分子上另一個理想的修飾目標(biāo)是N端第一個氨基酸的氨基。在硼氫化鈉存在時，帶醛基的PEG會和伯胺發(fā)生還原氨化反應(yīng)。醛基和其它的親電活性基團(tuán)不同，它只和胺基反應(yīng)。雖然醛基的反應(yīng)活性比NHS活性酯低，但是它具有反應(yīng)條件溫和(pH 6-9. 5，反應(yīng)6 M小時)，易于使PEG和蛋白質(zhì)或其它材料的表面連接。因此，在較低的PH下，帶有醛基的PEG會對蛋白質(zhì)的N端進(jìn)行選擇性反應(yīng)，形成均一的修飾物結(jié)構(gòu)。在此思路下完成的長效人粒細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)品已經(jīng)在美國上市，商品名為Neulasta。本發(fā)明中優(yōu)選的修飾位點(diǎn)確定為蛋白質(zhì)或多肽分子的N端第一個氨基酸的氨基， 優(yōu)選的修飾劑是端基為醛基的同端基遙爪聚乙二醇衍生物。2.目標(biāo)蛋白質(zhì)和多肽分子按照本發(fā)明的思路，在被修飾物具有可被修飾的活性基團(tuán)前提下，任意一種蛋白質(zhì)或者多肽分子都可以制備成本發(fā)明所描述的串聯(lián)體。凡是以本發(fā)明提到的高分子聚合物及其衍生物為連接物的活性蛋白質(zhì)或多肽串聯(lián)體都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。進(jìn)一步地，凡是以同端基遙爪聚乙二醇及其衍生物或者異端基遙爪聚乙二醇及其衍生物為連接物的活性蛋白或多肽串聯(lián)體都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。在本發(fā)明實(shí)施過程中，優(yōu)選的蛋白質(zhì)和多肽分子是目前已經(jīng)商品化的藥物或試劑級蛋白質(zhì)或者多肽，包括重組人干擾素家族各種分子、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、人促紅細(xì)胞生成素、人白細(xì)胞介素-2、人白細(xì)胞介素-11、人腫瘤壞死因子α、微生物來源的天冬酰胺酶、人血管內(nèi)皮抑素、人角化細(xì)胞生長因子、人胸腺素α 、人胸腺素α 2、組織型人纖溶酶原激活劑、人血小板生成素、人腦利鈉肽、水蛭素、人干細(xì)胞因子、腸降血糖素及其類似物、胰高血糖素、鮭魚降鈣素、支原體精氨酸脫亞胺酶、人精氨酸酶、酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長因子、腺苷脫胺酶、人表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、 血小板源性生長因子、超氧化物歧化酶、人生長激素以及上述蛋白或者多肽的突變體等。這里述及的突變體是指與原型蛋白質(zhì)或者多肽分子具有相同或者相似作用的蛋白質(zhì)或多肽分子突變體，包括氨基酸的刪減或者突變。上述蛋白質(zhì)和多肽分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均可以通過現(xiàn)有文獻(xiàn)查詢系統(tǒng)獲得，其制備工藝也已經(jīng)有公開文獻(xiàn)。因而這些蛋白質(zhì)和多肽分子本身的制備技術(shù)不是本發(fā)明的內(nèi)容， 這些分子都可以通過商業(yè)渠道獲得，也可以依據(jù)參考文獻(xiàn)中的多肽化學(xué)合成技術(shù)或者蛋白質(zhì)基因工程表達(dá)技術(shù)獲得，屬于公知技術(shù)范疇。本發(fā)明中具有生物活性的單體蛋白質(zhì)或者單體多肽的目標(biāo)范圍包括但不限于上述蛋白質(zhì)或者多肽以及它們的突變體。三、修飾反應(yīng)和修飾后分離( 一 )修飾反應(yīng)根據(jù)修飾劑端基的種類選擇不同的修飾條件，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是不難作出判斷的。本發(fā)明實(shí)施過程中使用最多的是端基為醛基的同端基遙爪聚乙二醇進(jìn)行修飾。反應(yīng)緩沖體系采用醋酸緩沖液，PH值選擇4. 0，氰硼氫化鈉的濃度為0. 1沈％，蛋白或多肽濃度為l-10mg/ml，蛋白或多肽與修飾劑的摩爾比為2 5 1，室溫下攪拌2 16小時后加入甘氨酸至終濃度為4%，終止反應(yīng)。為了更高效地獲得反應(yīng)產(chǎn)物，本發(fā)明在具體實(shí)施過程中可根據(jù)目標(biāo)蛋白和多肽的等電點(diǎn)對反應(yīng)緩沖液的酸堿度進(jìn)行調(diào)整，以規(guī)避開蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)，一般反應(yīng)緩沖體系的pH為4. 0 5. 0。(二)修飾混合物的分離PEG修飾后的混合物，其分子量差異較明顯，優(yōu)先選用凝膠層析進(jìn)行分離。凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動時，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運(yùn)動，而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達(dá)到分離的目的。凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺生物凝膠介質(zhì)化學(xué)惰性較好且有不同大小孔徑，適應(yīng)不同分子量的蛋白質(zhì)的分級分離，但這些凝膠的機(jī)械強(qiáng)度差，很難用于大規(guī)模條件下的分離。 近年來，Sepharcryl, Superdex等幾種機(jī)械強(qiáng)度較好的凝膠得到廣泛應(yīng)用。這些凝膠均有商品化的實(shí)物，都可以用于本發(fā)明中反應(yīng)混合物的分離。本發(fā)明分離實(shí)驗(yàn)在kphacryl S-200層析柱上進(jìn)行，平衡緩沖液選用與反應(yīng)緩沖體系相同的弱酸性溶液即醋酸緩沖液(PH4. 0 5. 0)，并在緩沖液中加入0. IM的NaCl來減少蛋白的非特異性吸附。經(jīng)過分子篩層析分離后，蛋白或多肽分子的串聯(lián)體可以很好的從反應(yīng)混合物中分
尚出來。四、本發(fā)明的方案在本發(fā)明的實(shí)施方案中，分別選用市售平均分子量分別為5000道爾頓、10000道爾頓、20000道爾頓和30000道爾頓的線型聚乙二醇為原料，采用Harris等提供的方法(參考文獻(xiàn)見上文)，制備了不同分子量大小、端基均為醛基的同端基遙爪聚乙二醇衍生物。PEG 的醛基化活化反應(yīng)在化學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有數(shù)十年的歷史，反應(yīng)路線也多樣化，屬于公知技術(shù)之一，本發(fā)明不再提供具體實(shí)施例。按照本發(fā)明方案制備的端基均為醛基的同端基遙爪聚乙二醇衍生物其分子式為(0CH2CH0)-PEG-(0CH2CH0)，化學(xué)反應(yīng)式如下(l)K0tBu/C6H6H0-PEG-0H+BrCH2CH(0Et)2 — (0CH2CH0)-PEG-(0CH2CH0)(2) HCl本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人干擾素α _2a(沈陽三生生物制藥公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S^hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人干擾素α "2a串聯(lián)體，用VSV_WISH(具體參見《中國藥典》三部附錄 XC)系統(tǒng)進(jìn)行活性測定的比活性約為2X107IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人干擾素α-lb(北京三元公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾， 在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人干擾素α-lb串聯(lián)體，用VSV-WISH(具體參見《中國藥典》三部附錄XC)系統(tǒng)進(jìn)行活性測定，比活性為2. 1 6. OX 107IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人干擾素a _2b (北京遠(yuǎn)策藥業(yè)公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人干擾素a _2b串聯(lián)體，用VSV-WISH(具體參見《中國藥典》三部附錄XC)系統(tǒng)進(jìn)行活性測定，比活性為1 2X 107IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人干擾素Y (上海生物制品研究所產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人干擾素Y串聯(lián)體，用VSV-WISH(具體參見《中國藥典》三部附錄XC)系統(tǒng)進(jìn)行活性測定的比活性為0. 4 1. IX 107IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組復(fù)合α干擾素(美國安進(jìn)公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾， 在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人復(fù)合α干擾素串聯(lián)體，用VSV-WISH(具體參見《中國藥典》三部附錄XC)系統(tǒng)進(jìn)行活性測定的比活性為1. 1 3. 5Χ 108IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人粒細(xì)胞集落刺激因子(美國安進(jìn)公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄XE方法進(jìn)行活性測定， 串聯(lián)體的比活性為4 5X 107IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(華北制藥產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄XF方法進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為6 8X 106IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人促紅細(xì)胞生成素(沈陽三生產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾， 在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人促紅細(xì)胞生成素串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄X B方法進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為 4. 6 9. 8X 104IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人白細(xì)胞介素-2(遼寧衛(wèi)星公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(kphacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人白細(xì)胞介素-2串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄》)方法進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為6 8X 106IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人白細(xì)胞介素-11(山東齊魯藥業(yè)公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人白細(xì)胞介素-11串聯(lián)體，用韓蕾報道的方法[韓蕾.重組人白細(xì)胞介素 11生物學(xué)活性測定方法研究.中國生化藥物雜志.2003，M(1)]進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為 2. 0 6. 5X106IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對大腸桿菌天門冬酰胺酶(常州千紅公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的天冬酰胺酶串聯(lián)體，用底物降解法[韋玉軍，高向東，吳梧桐.L-門冬酰胺酶突變體的構(gòu)建及其活性測定.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2005，36 (5)]進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為 100 210IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人腫瘤壞死因子α (上海賽達(dá)生物藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200) 純化獲得了聚乙二醇連接的重組人腫瘤壞死因子α串聯(lián)體，用張英起等報道的方法[張英起，趙寧，李波，劉磊，王增祿，朱寶娥，顏真，蘇成芝.應(yīng)用基因工程方法制備新型重組人腫瘤壞死因子α.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.2002，18 ) :402-406]進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為 2. 6 7. 8X108IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人血管內(nèi)皮抑素(蘇州中凱生物制藥廠產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人血管內(nèi)皮抑素串聯(lián)體，用楊芳等報道的方法[楊芳，何援利，姜孝玉，劉蕓，彭冬先，宗利麗.人內(nèi)皮抑素基因的克隆、表達(dá)、純化及活性測定.2005,25 )]進(jìn)行活性測定，結(jié)果比活性為2. 6 9. 8X 105IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人角化細(xì)胞生長因子(美國安進(jìn)公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人角化細(xì)胞生長因子串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄XG方法進(jìn)行活性研究表明，修飾產(chǎn)物能夠刺激小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生長。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200) 純化獲得了聚乙二醇連接的人堿性成纖維細(xì)胞生長因子串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄XG 方法進(jìn)行活性研究表明，比活性為0. 4 1. 5X 105IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人表皮生長因子(深圳市華生基因工程發(fā)展有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人表皮生長因子串聯(lián)體，用《中國藥典》三部附錄XG方法進(jìn)行活性研究表明，比活性為1. 2 3. 8X 105IU/mg。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人胸腺素α 1(商品名日達(dá)仙)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人胸腺素α 串聯(lián)體，用宮照龍等報道的方法[宮照龍，徐義輝，展瑞，高昱，蔣作君.胸腺素α 串聯(lián)體的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測.中國生物制品學(xué)雜志，2005年，18(02) :111-114] 進(jìn)行活性研究表明，修飾產(chǎn)物能顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人胸腺素α 2{參考苗紅等學(xué)者的報道自行制備，(苗紅，郭葆玉，張冉，張莉.重組胸腺素α 的表達(dá)、純化和生物學(xué)活性.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報.2003，10，19( :636 639)}進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacrylS-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人胸腺素α 2串聯(lián)體，用宮照龍等報道的方法[宮照龍，徐義輝，展瑞，高昱，蔣作君.胸腺素α 1串聯(lián)體的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測.中國生物制品學(xué)雜志，2005年，18 (02) :111-114]進(jìn)行活性研究表明，修飾產(chǎn)物能顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人組織型纖溶酶原激活劑(商品名“愛通立”)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人組織型纖溶酶原激活劑串聯(lián)體，用李寶宗報道的方法[李寶宗，鄭竑，葉林柏，郜金榮，佘應(yīng)龍，賀石漢，吳正輝.重組tPA及其突變體纖溶活性的比較.武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2004 50(6) =765-768]進(jìn)行活性研究表明，串聯(lián)體能夠激活纖溶蛋白酶的活性。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為5000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人腦利鈉肽(商品名“新活素”，成都諾迪康生物制藥有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200) 純化獲得了聚乙二醇連接的人腦利鈉肽串聯(lián)體，用饒春明等報道的方法[饒春明，王軍志， 趙陽，韓春梅，郭瑩，高凱。重組人腦利鈉肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢定方法研究。藥物分析雜志。2002， 22(05) =346-349]進(jìn)行活性研究表明，串聯(lián)體具有刺激兔動脈條收縮的活性。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為5000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對鮭魚降鈣素(北京世橋生物制藥有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的鮭魚降鈣素串聯(lián)體。用杜清友等報道的方法[杜清友，趙明，王會信，丁紅梅。鮭魚降鈣素基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)。生物化學(xué)雜志，1997，13 (5) :531-536]進(jìn)行活性研究表明，串聯(lián)體具有降低大鼠血鈣的作用。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人血小板生成素(沈陽三生制藥股份有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人血小板生成素串聯(lián)體。用李朝等報道的方法[李朝，程度勝，周艷榮，陳添彌，黃培堂。一種新型血小板生成素(TPO)模擬肽的合成及功能研究。中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志。2003;11(2) :128-131]進(jìn)行活性研究表明，串聯(lián)體能夠顯著提高小鼠循環(huán)血液中血小板的數(shù)量。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為5000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對水蛭素(商品名Angiomax，生產(chǎn)商BenVenice公司)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的水蛭素串聯(lián)體。用李朝等報道的方法[陳華友，邢自力，李媛媛。凝血酶滴定法測定水蛭素活性的改進(jìn)。生物技術(shù)，2002，12 (6) :24-25]進(jìn)行活性研究表明，串聯(lián)體能夠有效地抑制血液凝固。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為5000道爾頓、雙端基均為醛基的
12自制線型同端基遙爪聚乙二醇對重組人干細(xì)胞因子(商品名STEMGEN ，美國Amgen公司產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人干細(xì)胞因子串聯(lián)體。用王軍志等報道的方法[王軍志，趙陽， 陳國慶，饒春明。重組人干細(xì)胞因子生物學(xué)活性測定的質(zhì)量控制研究。中國腫瘤生物治療雜志。2001 ；8 (4) =294-296]進(jìn)行活性研究表明，UT-7細(xì)胞對重組人干細(xì)胞因子串聯(lián)體具有顯著依賴性。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為5000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對人胰高血糖素(商品名諾和生，美國諾和諾德公司產(chǎn)品) 進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的人胰高血糖素串聯(lián)體。用WEN Chongwei等報道的方法[WFN Chongwei5WANG Zuoren, DU Peng, GAN Renbao, ZHU Shangquan. Secretion expression of recombinant glucagon inEscherichia Coli. SCIENCE IN CHINA(Series C),2001 ；44(3) :233-240]進(jìn)行活性研究表明，人胰高血糖素串聯(lián)體具有與人高血糖素相似的生物活性。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為5000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對腸降血糖素類似物Exenatide(商品名艾塞那肽，即美國的BYETTATM，Amylin Pharmaceuricals Inc產(chǎn)品)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的Exenatide串聯(lián)體。用 Scrocchi LA 等報道的方法[Scrocchi LA, Brown TJ, Maclusdy N, et al. Glucose intolerancebut normal satiety in mice with a mull mutation in the glucagon—like peptide I receptorgene [J]. Nat Med，1996，2 (11) :1254-1258]進(jìn)行活性研究表明， Exenatide串聯(lián)體具有與Exenatide相似的生物活性，能夠減緩小鼠胃的排空速度。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對自制的重組人精氨酸酶(參見文獻(xiàn)一李大力，鄭迎迎.人工型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表達(dá).化學(xué)與生物工程.2006，23 ) 41-49)進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(Sephacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人精氨酸酶串聯(lián)體。LA等報道的方法[Masaki ΙΚΕΜ0Τ0, Masayoshi TABATA, Toshio MIYAKE, Toshiaki Κ0Ν0, Masataka MORI, Masayuki TOTANI and Takashi MURACHI. Expression of human liver arginase in Escherichia coli[J]. Biochem. J. 1990，270，697-703]進(jìn)行活性研究表明，重組人精氨酸酶串聯(lián)體具有與重組人精氨酸酶相似的生物活性，能夠把精氨酸降解為尿素。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為30000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對自制的重組精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S印hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體。用Misawa S等報道的方法進(jìn)行活性研究表明，重組精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體具有與重組精氨酸脫亞胺酶具有相似的生物活性，能夠把精氨酸降解為瓜氨酸。制備方法參見文獻(xiàn)一Misawa S，Aoshima M，Takaku H，et al. High-level expression of Mycoplasma argininedeiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme. J Biotechnol. 1994,361 :145_155。本發(fā)明的又一個具體方案中，采用平均分子量為20000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇對自制的重組人生長激素進(jìn)行了修飾，在含有硼氫化鈉的酸性條件下反應(yīng)，經(jīng)分子篩(S^hacryl S-200)純化獲得了聚乙二醇連接的重組人生長激素串聯(lián)體。用李湛軍等報道的方法[李湛軍，楊化新，徐康森.聚乙二醇化重組人生長激素長效作用及在體生物活性研究.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué).2005，10(11) :25- ]，采納脛骨法和體重法進(jìn)行活性研究表明，重組人生長激素串聯(lián)體具有與重組人生長激素具有相似的生物活性，比活性約為5. 0IU/mg。人生長激素制備方法參見文獻(xiàn)[劉曉宏，粟永萍，李淑蓉，王蒙，艾國平，王軍平，程天民.人生長激素基因的克隆、高效表達(dá)及純化.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志.2003，20 (8) :106-109]。同法制備對商品名為安蘇萌的重組人生長激素進(jìn)行修飾， 獲得了相同活性的重組人生長激素串聯(lián)體。在本發(fā)明的方案中還包括驗(yàn)證復(fù)合分子分子量大小的內(nèi)容。方法采用SDS-PAGE 電泳，步驟參見中國藥典2005年版附錄IVC。濃縮膠濃度5% ；分離膠濃度12% ；上樣量 5-15 μ g。電泳后在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描。由于PEG在水溶液中每個乙氧基重復(fù)基團(tuán)可以結(jié)合2 3個水分子導(dǎo)致其流體力學(xué)半徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同分子量的球狀蛋白，因此用 SDS-PAGE電泳測量的聚乙二醇化蛋白分子量要大于其真實(shí)的分子量，與分子量標(biāo)準(zhǔn)相比有 “拖后”現(xiàn)象。這一現(xiàn)象在本發(fā)明的實(shí)施例中也同樣出現(xiàn)，見圖1、圖2和圖3。該方案的實(shí)施證明了本發(fā)明能夠制備出上述蛋白和多肽分子的串聯(lián)體，增大了原分子的分子量，見圖 1、圖2和圖3。在本發(fā)明的實(shí)施例中雖然僅僅給出了 19種蛋白和多肽的串聯(lián)體電泳結(jié)果， 但并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，同業(yè)者可以根據(jù)本發(fā)明的描述制備出其它蛋白質(zhì)和多肽分子的串聯(lián)體。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的方案中還包括驗(yàn)證修飾后的串聯(lián)體分子在動物體內(nèi)代謝方面發(fā)生變化的研究內(nèi)容。針對不同的蛋白和多肽分子，采用的藥物代謝檢測方法也不盡相同。如可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或者放射性核素標(biāo)記的方法來直接檢測藥物在動物或者人體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，這一方法適合于大部分蛋白質(zhì)和多肽，是藥代動力學(xué)研究與實(shí)踐領(lǐng)域常用的方法；也可以采用蛋白質(zhì)和多肽分子的作用的底物或產(chǎn)物的體內(nèi)濃度變化來評估蛋白質(zhì)和多肽分子的代謝狀況，如門冬酰胺酶、精氨酸酶和精氨酸脫亞胺酶等；還可以通過檢測蛋白質(zhì)或多肽引起的生理生化變化過程中的效應(yīng)分子來評估蛋白質(zhì)和多肽體內(nèi)轉(zhuǎn)歸情況，如檢測血鈣來評價降鈣素等。與上述SDS-PAGE電泳試驗(yàn)的內(nèi)容一樣，本環(huán)節(jié)提供的是一種凡例，目的是證明本發(fā)明制備的復(fù)合分子具有延長的體內(nèi)半衰期的特性，本發(fā)明方案和實(shí)施例中的個例提供的內(nèi)容并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。PEG修飾能夠增加蛋白質(zhì)和多肽分子的藥物代謝半衰期，這在上市的藥物和眾多文獻(xiàn)中可以得到相應(yīng)的認(rèn)知。故此，本發(fā)明的方案中僅以精氨酸脫亞胺酶為例測定了本發(fā)明制備的藥物串聯(lián)體的半衰期的變化。研究選擇了注射精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體后血清內(nèi)精氨酸和瓜氨酸的變化的方法，而檢測血清內(nèi)精氨酸和瓜氨酸可以通過HPLC的方法實(shí)現(xiàn)，這是現(xiàn)代色譜領(lǐng)域的常用方法。研究結(jié)果顯示， 精氨酸脫亞胺酶的串聯(lián)體比原型分子具有更長久的維持血清低精氨酸狀態(tài)作用，說明串聯(lián)體具有更長的活性衰減周期，具體見實(shí)施例。更進(jìn)一步地，本發(fā)明還設(shè)計了證明串聯(lián)體分子能夠減少過敏反應(yīng)的研究內(nèi)容?？梢酝ㄟ^過敏反應(yīng)試驗(yàn)方法檢測串聯(lián)體與單體對動物過敏反應(yīng)的強(qiáng)弱來檢測串聯(lián)體的優(yōu)勢。 研究通過豚鼠全身主動過敏試驗(yàn)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，具體步驟參見2005年版藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(國家食品藥品監(jiān)督管理局組織編寫)127 131頁。
為了更好地說明本發(fā)明的現(xiàn)實(shí)可行性和效果，我們列舉了一些實(shí)施例。這些實(shí)施例雖然沒有能夠把自然界常見的活性蛋白和多肽一一列舉，但實(shí)施例提供的方法和產(chǎn)物足以延伸到任意有生物活性的蛋白質(zhì)和多肽分子，同業(yè)人員可以方便地依據(jù)本發(fā)明的描述制備出具有更優(yōu)化功能的蛋白質(zhì)和多肽分子的串聯(lián)體，這些串聯(lián)體同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。


圖1.重組人干擾素等蛋白和多肽分子串聯(lián)體的電泳結(jié)果Lanel 分子量Marker ;Lane2 :PEG連接的重組人干擾素α加串聯(lián)體；Lane3 PEG連接的重組人干擾素0讓串聯(lián)體；1^1^4 :PEG連接的重組人干擾素α 2b串聯(lián)體； Lane5 :PEG連接的重組人干擾素γ串聯(lián)體；Lanee :PEG連接的重組人復(fù)合α干擾素串聯(lián)體；Lane7 :PEG連接的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子串聯(lián)體；LaneS =PEG連接的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子串聯(lián)體；圖2.重組人腫瘤壞死因子α等蛋白和多肽分子串聯(lián)體的電泳結(jié)果Lanel 分子量Marker ；Lane2 :PEG連接的重組人腫瘤壞死因子α串聯(lián)體；Lane3 PEG連接的大腸桿菌門冬酰胺酶串聯(lián)體；Lane4 :PEG連接的重組人白細(xì)胞介素2串聯(lián)體； Lane5 :PEG連接的重組人白細(xì)胞介素11串聯(lián)體；Lane6 :PEG連接的人胸腺素α 1串聯(lián)體； Lane7 =PEG連接的重組人胸腺素α 2串聯(lián)體；圖3.重組鮭魚降鈣素等蛋白和多肽分子串聯(lián)體的電泳結(jié)果Lanel 分子量Marker ；Lane2 =PEG連接的鮭魚降鈣素串聯(lián)體；Lane3 =PEG連接的人胰高血糖素串聯(lián)體；Lane4 :PEG連接的艾塞那肽串聯(lián)體；Lane5 :PEG連接的重組人精氨酸酶串聯(lián)體；Lanee =PEG連接的重組精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體；Lane7 :PEG連接的重組人生長激素串聯(lián)體；
圖4.復(fù)合分子結(jié)構(gòu)示意圖 A為連接功能團(tuán)，B為生物活性功能團(tuán)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.聚乙二醇連接的重組人干擾素α -2a等蛋白或多肽串聯(lián)體的制備反應(yīng)采用平均分子量為10000道爾頓、雙端基均為醛基的自制線型同端基遙爪聚乙二醇，重組人干擾素α- 來自沈陽三生生物制藥公司。將重組人干擾素α- 濃縮為 5mg/ml，緩沖液為20mM PB, pH7. 0。用冰醋酸調(diào)節(jié)緩沖液pH值為5. 0，加入20mMNaCNBH3， 充分溶解后，再加入自制的活化PEG干粉，PEG與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為5 1。在4°C條件下攪拌反應(yīng)15h，然后加入2g甘氨酸以終止反應(yīng)。層析分離將反應(yīng)混合物上樣于S-100層析柱中，用緩沖液以20ml/min的流速洗脫，Pharmacia UV_U80nm檢測，REC-101記錄出峰圖譜。分段收集樣品。SDS-PAGE電泳分析。此步驟旨在分離PEG修飾物、未修飾物和部分多修飾物，以及除去游離的PEG和過量的甘氨酸。將第一次kphacryl-SlOO層析分離后SDS-PAGE電泳純度大于90%的樣品合并，濃縮至濃度lmg/ml以上。上樣于S-100層析柱中，用緩沖液以20ml/min的流速洗脫。 PharmaciaControl Unit UV-I在^Onm檢測吸收，REC-IOl記錄洗脫峰譜。手動分段收集樣品峰，獲得PEG連接的重組人干擾素α-Μ純品。同法制備了重組人干擾素α Ib串聯(lián)體、重組人干擾素α 2b串聯(lián)體、重組人干擾素 Y串聯(lián)體、重組人復(fù)合α干擾素串聯(lián)體、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子串聯(lián)體、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子串聯(lián)體、重組人腫瘤壞死因子α串聯(lián)體、大腸桿菌門冬酰胺酶串聯(lián)體、重組人白細(xì)胞介素2串聯(lián)體、重組人白細(xì)胞介素11串聯(lián)體、人胸腺素α 1串聯(lián)體、 重組人胸腺素α 2串聯(lián)體、鮭魚降鈣素串聯(lián)體、人胰高血糖素串聯(lián)體、艾塞那肽串聯(lián)體、重組人精氨酸酶串聯(lián)體、重組精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體和重組人生長激素串聯(lián)體。制備過程中采用的反應(yīng)緩沖體系的酸堿度適當(dāng)調(diào)整，保持在酸性條件下，盡量避開目標(biāo)分子的等電點(diǎn)。 不同的蛋白或多肽分子使用的修飾劑大小見前文所述。實(shí)施例2.聚乙二醇連接的重組人干擾素α -2a串聯(lián)體等分子的電泳檢測方法采用SDS-PAGE電泳，步驟參見中國藥典2005年版附錄IVC。濃縮膠濃度5%; 分離膠濃度12% ；上樣量約10 μ g。電泳后在凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描。電泳掃描結(jié)果提示，本發(fā)明制備的上述蛋白和多肽串聯(lián)體的分子量測定結(jié)果比理論分子量稍大(具體數(shù)據(jù)省略)，見附圖1、附圖2和附圖3。實(shí)施例3.重組精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體藥代初步分析采用健康、成年、雄性昆明種小鼠。單劑量單次給藥后，血清中精氨酸濃度的降低和瓜氨酸濃度的升高作為檢測指標(biāo)。小鼠給藥后，不同時間尾靜脈取血，常規(guī)方法制備血清，用HPLC分析測定精氨酸和瓜氨酸的含量。結(jié)果表明，重組精氨酸脫亞胺酶串聯(lián)體比非串聯(lián)體具有更長久的降低血液精氨酸的特點(diǎn)。數(shù)據(jù)見下表1 表1.血漿精氨酸、瓜氨酸濃度(μ Μ)法推測藥物體內(nèi)代謝情況
權(quán)利要求
1.一類人工的復(fù)合分子，其主要特征是該類復(fù)合分子由一個連接功能團(tuán)A和兩個結(jié)構(gòu)相同的生物活性功能團(tuán)B組成，其中連接功能團(tuán)A通過化學(xué)鍵把兩個活性功能團(tuán)B連接起來。其結(jié)構(gòu)如附圖4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合分子，其中的連接功能團(tuán)A是分支型或者線型高分子聚合物，選自聚烯醇類化合物、聚醚類化合物、二乙烯基醚與馬來酸酐共聚物、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、氧化乙烯和甲醛共聚物、聚環(huán)氧化物、乙二酸和丙二酸共聚物以及上述這些物質(zhì)的衍生物中的一種。
3.如權(quán)利要求1 2所述的復(fù)合分子，其中的連接功能團(tuán)A是聚醚類化合物時選自具有H0((CH2)x0)nH結(jié)構(gòu)通式的化合物、聚丙二醇、聚氧化乙烯HO ((CH2) 20) nH、聚乙烯醇 (CH2CH0H) η或這些物質(zhì)的衍生物中的一種。
4.如權(quán)利要求1 2所述的復(fù)合分子，其中的連接功能團(tuán)A是聚烯醇類化合物時選自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或其它烯醇化合物及它們的衍生物中的一種。
5.如權(quán)利要求4所述的復(fù)合分子，其中的功能團(tuán)A是具有兩個活性端基的聚乙二醇及其衍生物，所述活性端基選自醛基、羧基、氨基、對甲苯磺酸酯基、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯基、琥珀酰亞胺基碳酸酯基、馬來酰亞胺順丁烯二酰亞胺、硝基苯基碳酸酯、3-(2-吡啶二巰基)丙酸η-羥基琥珀酰亞胺酯、異氰酸、酰胼、琥珀酸、對甲苯磺酸。
6.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合分子，其中的連接功能團(tuán)A是兩個活性端基為醛基的同端基遙爪聚乙二醇。
7.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合分子，其中的生物活性功能團(tuán)B是蛋白質(zhì)或多肽分子。
8.如權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)或多肽分子，特別是指選自人干擾素家族各種分子、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、人促紅細(xì)胞生成素、人白細(xì)胞介素-2、人白細(xì)胞介素-11、人腫瘤壞死因子、微生物來源的天冬酰胺酶、人血管內(nèi)皮抑素、人角化細(xì)胞生長因子、人胸腺素α 、人胸腺素α 2、組織型人纖溶酶原激活劑、人血小板生成素、人腦利鈉肽、水蛭素、人干細(xì)胞因子、腸降血糖素及其類似物、胰高血糖素、鮭魚降鈣素、 支原體精氨酸脫亞胺酶、人精氨酸酶、酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長因子、腺苷脫胺酶、人表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子、超氧化物歧化酶、人生長激素以及上述這些蛋白質(zhì)或多肽的活性突變體中的任意一種。
9.如權(quán)利要求1 8所述的復(fù)合分子，其中的連接功能團(tuán)A的兩個活性端基分別連接在兩個生物活性功能團(tuán)B的碳末端α羧基、氮端的α氨基以及賴氨酸、門冬氨酸、谷氨酸、 精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、組氨酸等9種氨基酸的側(cè)鏈上。
10.如權(quán)利要求9所述的復(fù)合分子，連接功能團(tuán)A與生物活性功能團(tuán)B進(jìn)行連接的方式是連接功能團(tuán)A的兩個活性醛基末端分別與兩個B功能團(tuán)的氮末端氨基酸的α氨基發(fā)生還原氨化反應(yīng)而連接。
11.含有如權(quán)利要求1 10所述的復(fù)合分子的制劑在制備用于延長B功能團(tuán)的藥物代謝半衰期、增加B功能團(tuán)水溶性以及減少B功能團(tuán)過敏性的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了一類藥物分子，其特點(diǎn)是通過高分子聚合物把活性蛋白質(zhì)或多肽連接在一起，形成活性蛋白多肽的雙分子串聯(lián)體，從而得以實(shí)現(xiàn)制備延長蛋白質(zhì)多肽分子的藥物代謝半衰期、增加水溶性以及減少這些分子應(yīng)用在人體時可能產(chǎn)生的過敏反應(yīng)的目的。這類復(fù)合分子在生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K47/34GK102188715SQ20101011732
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者吳彥卓, 張鵬, 徐明波, 楊仲璠, 梁果義, 王俊玲, 王喜鶴, 趙晶晶, 連治國 申請人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司