專利名稱：一種抑制人肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的siRNA的結(jié)構(gòu)及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種針對血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growthfactor, VEGF)基因的小干擾 RNA(small interference RNA, siRNA)的序列結(jié)構(gòu)及其成為治療肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的新型藥物。
背景技術(shù)：
肺癌已成為引起人類死亡的常見疾病之一，在我國大中城市的發(fā)病率與死亡率均 居各種惡性舯瘤首位。盡管采用多種治療方法，但患者3年及5年生存率仍很低，導(dǎo)致患者 死亡的主要原因與腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是一個多因素調(diào)控的復(fù)雜過程。癌細(xì)胞的增殖是腫瘤 細(xì)胞通過細(xì)胞分裂增加細(xì)胞數(shù)量和增大腫瘤體積的過程，腫瘤體積的增大會破壞所在組織 器官的結(jié)構(gòu)與功能。癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，侵入并穿過周圍基質(zhì) (此階段為侵襲)，經(jīng)血液或淋巴循環(huán)向遠(yuǎn)處擴(kuò)散(該階段為轉(zhuǎn)移)的過程。研究顯示，腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在新血管形成和癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，VEGF無論是 在體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞中，還是在荷瘤動物的腫瘤細(xì)胞中，或是在人體肺癌組織中均有高 表達(dá)，且VEGF表達(dá)水平與肺癌預(yù)后密切相關(guān)。Ohta等[OhtaY，et al. Chest, 2002,121 1624-1627]對肺癌研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶VEGF表達(dá)水平高于無轉(zhuǎn)移者，在 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中VEGF的表達(dá)高于原發(fā)灶。VEGF是肺癌預(yù)后的獨(dú)立因子，VEGF表達(dá)高的患 者預(yù)后較差[Seto T, et al. Lung Cancer, 2006, 53 (1) 91-96 ；SadasiwanC, et al. ASCO MeetingAbstract,2007，25 7696]。因此，利用相關(guān)技術(shù)手段降低VEGF表達(dá)就有可能降低肺癌增殖及轉(zhuǎn)移的發(fā)生率， 延長患者生命，提高患者生存率和生活質(zhì)量。RNAi是1998年建立的一種簡便快速的轉(zhuǎn)錄后基因干預(yù)技術(shù)，通過20 23個堿 基對的小分子雙鏈RNA片段特異性地與同源序列基因結(jié)合，從而沉默靶基因，可代替?zhèn)鹘y(tǒng) DNA水平的基因敲除技術(shù)。與傳統(tǒng)反義技術(shù)相比，RNAi具有作用特異性強(qiáng)，效果好、持續(xù)時 間長、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定、可遺傳等優(yōu)勢，可廣泛用于目的基因的沉默[Liu G，et al. Histol Histopathol. 2007,22(2) 211-217 ；Fuchs U，et al. Adv cancer Res. 2007，96 :75_102·]。 2003年以來，RNAi在代謝性疾病、病毒感染性疾病、多種惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥物篩 選等領(lǐng)域的研究應(yīng)用日益廣泛。鑒于RNAi技術(shù)的巨大價值與廣闊應(yīng)用前景，2002年美國 《SCIENCE》雜志將其評為全球年度十大科學(xué)進(jìn)展之首。而RNAi的發(fā)現(xiàn)者美國科學(xué)家Craig Mello和Andrew Fire也因此榮獲2006年諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。本發(fā)明的目的在于尋找能特異高效抑制肺癌細(xì)胞增殖的新型基因藥物，即能明顯 降低VEGF基因表達(dá)的小分子干擾RNA(SiRNA)及能改善其生物活性的化學(xué)修飾衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容是根據(jù)VEGF mRNA的序列信息和生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計若干靶向VEGF mRNA的siRNA序列，分別構(gòu)建VEGF_siRNA質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定株， 以熒光定量PCR檢測VEGF-siRNA對VEGF mRNA表達(dá)的抑制效果。結(jié)果顯示有1條siRNA 序列具有較為理想的抑制VEGF mRNA表達(dá)并在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中能明顯抑制A549細(xì)胞增 殖和轉(zhuǎn)移，提示可用于肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的預(yù)防與治療。根據(jù)本發(fā)明，針對美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫中人VEGF mRNA的序列 全長(序列號:NM001033756, CDS =492-1607)中1220 1238位點(diǎn)設(shè)計的siRNA能能抑制 VEGF基因表達(dá)，有可能成為預(yù)防和治療肺癌等惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新型生物工程藥物。根據(jù)本發(fā)明，為增強(qiáng)siRNA的核酸酶抗性、生物利用度、組織靶向性等，本發(fā)明包 含了 VEGF-siRNA的各種化學(xué)修飾。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明的VEGF-SiRNA及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給 藥的試劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的VEGF-siRNA及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨(dú)的有效成分 或組合物形式包括聯(lián)合其它反義核酸及其衍生物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學(xué)、藥代動 力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時限 等，以適量的劑量給藥。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施對嚴(yán)重危害人類健康的肺癌等惡性腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的預(yù) 防與治療具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)設(shè)計、方法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1、siRNA設(shè)計合成及質(zhì)粒載體構(gòu)建在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取人VEGF mRNA的序列全長(序 列號匪001033756，⑶S =492-1607)。依據(jù)siRNA設(shè)計原則，結(jié)合設(shè)計軟件和文獻(xiàn)報道，分 別設(shè)計了 12條VEGF-siRNA靶序列。各siRNA靶序列長度19bp，均行BLAST比對檢查，以保 證和其它基因沒有同源性，合成的siRNA轉(zhuǎn)錄模板長度為64bp，在序列中間為加入9bp莖環(huán) 序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5個T作為終止序列。上游和下游分別加了 BamHI和 HindllI酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒(經(jīng)HindIII和BamHI酶切后與合成的表達(dá)模板DNA片段用T4DNA 連接酶連接，反應(yīng)條件16°C，8h)改造可表達(dá)GFP，轉(zhuǎn)化DH5ci菌株，涂卡那霉素瓊脂平板， 挑選陽性克隆，擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，用BamHI和Hind IlI雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆 送生物公司測序。pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi載體由上海吉凱基因化學(xué)公司合成。2、篩選轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA肺癌A549細(xì)胞穩(wěn)定株2. 1瞬時轉(zhuǎn)染①取復(fù)蘇后第三代處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色，存活 率> 95 %，顯微鏡下計數(shù)，以2 X 105個細(xì)胞/孔接種于24孔板內(nèi)。細(xì)胞匯合度60 % 80 % 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。②質(zhì)粒DNA 1 μ g加入50 μ IOPTI-MEM中混勻；Lipofectamine 20002 μ 1加入 50 μ 1 OPTI-MEM中混合均勻，室溫靜置5min。Lipofectamine2000稀釋液加入質(zhì)粒DNA稀 釋液中混勻，室溫靜置20min。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，OPTI洗細(xì)胞兩次，加入500 μ 1
40ΡΤΙ-ΜΕΜ。將混合液100 μ 1緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時輕輕晃動培養(yǎng)板。37°C、5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5h后換含10% FBS的1640培養(yǎng)液。2. 2 G418篩選轉(zhuǎn)染穩(wěn)定株瞬時轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞按1 3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)48h，吸棄培養(yǎng)液，加入含 G418500yg/ml的含10% FBS1640培養(yǎng)液。隔日換液，6d后大量細(xì)胞死亡，G418濃度調(diào)整 至200 μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)至單克隆形成。熒光顯微鏡下挑選出表達(dá)GFP的陽性克隆，轉(zhuǎn)至培 養(yǎng)瓶內(nèi)擴(kuò)增。以GFP為報告子，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。3、熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA對A549細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)影響。4、Western印跡檢測轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA對A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)影響。5、MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖能力改變。6、Transwell模型檢測各組A549細(xì)胞體外侵襲能力結(jié)果1在設(shè)計的12條VEGF-siRNA中發(fā)現(xiàn)靶向VEGF mRNA 1220 1238位點(diǎn)(序列為 “GATCCGCAGACGTGTAAAT”)的siRNA有較為理想的抑制VEGF mRNA表達(dá)的效果，其抑制效率 為73%，經(jīng)文獻(xiàn)檢索尚未發(fā)現(xiàn)有該位點(diǎn)被用于設(shè)計siRNA的文獻(xiàn)報道，因此，本專利所發(fā)現(xiàn) 的VEGF基因位點(diǎn)和基于該位點(diǎn)所設(shè)計的VEGF-siRNA具有自主知識產(chǎn)權(quán)。2ffestern blot檢測轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞內(nèi)源性VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果顯示與對 照組(0. 73士0.01)相比，轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA后A549細(xì)胞內(nèi)源性VEGF蛋白表達(dá)明顯降低 (0. 38 士 0. 01，P < 0. 01)；3MTT實(shí)驗(yàn)顯示單純轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA組1 4d細(xì)胞增殖與對照組無差別(P > 0. 05)，5 6d明顯低于對照組水平(P < 0.01)4細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示在Transwe 11小室中接種細(xì)胞后20h，與對照組 (108士9)比較，VEGF-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(56士9，P < 0. 01)，表明所設(shè)計的 VEGF-siRNA可降低A549細(xì)胞侵襲能力。
權(quán)利要求
一種可特異性結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的小干擾RNA(siRNA)，其沉默的VEGF mRNA(序列號NM 001033756；CDS492 1607)位點(diǎn)(1220～1238)序列為“GATCCGCAGACGTGTAAAT”。
2.含有權(quán)利要求1中的siRNA序列及可藥用載體的藥物組合物。
3.權(quán)利要求1中的siRNA用于制備抗肺癌及其它惡性腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抑制人肺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的siRNA的結(jié)構(gòu)及用途。本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是根據(jù)人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)基因序列信息，設(shè)計、合成、篩選小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，用于抑制(沉默)人VEGF基因表達(dá)從而抑制肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。本發(fā)明設(shè)計、發(fā)現(xiàn)了互補(bǔ)于VEGF mRNA特定區(qū)域的siRNA體外對培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移有抑制效應(yīng)。故本發(fā)明涉及到針對VEGF基因的siRNA序列、結(jié)構(gòu)及其成為預(yù)防和治療肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的新型藥物。
文檔編號A61P35/00GK101942441SQ20101011937
公開日2011年1月12日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者江其生 申請人:江其生