專利名稱：存活蛋白衍生肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的存活蛋白衍生肽及它們對于診斷和治療目的的用途，特別是診斷 和治療癌癥的用途。特別地，這些新的肽是MHC I類限制性T細(xì)胞表位，其能夠引發(fā)癌癥患 者中包括原位和先體外后體內(nèi)反應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。特別地，這些新肽衍生自程序 性細(xì)胞死亡抑制蛋白質(zhì)存活蛋白(survivin)，其是公認(rèn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。技術(shù)背景及現(xiàn)有技術(shù)哺乳動物的免疫系統(tǒng)對外來或相異物質(zhì)的識別和反應(yīng)的過程是復(fù)雜的。該系統(tǒng)重 要的方面是T細(xì)胞反應(yīng)。此反應(yīng)需要T細(xì)胞識別并與被稱為人白細(xì)胞抗原(HLA)的細(xì)胞表 面分子與肽的復(fù)合體相作用，該白細(xì)胞抗原構(gòu)成了人主要組織相容性復(fù)合體(MHC)。這些肽 衍生自較大的分子，其經(jīng)細(xì)胞加工，該細(xì)胞也提呈HLA/MHC分子。T細(xì)胞和HLA/肽復(fù)合體的 相互作用是受限制的，需要對于HLA分子和肽的特定組合特異的T細(xì)胞。如果不存在特異 的T細(xì)胞，即使其配偶體復(fù)合體存在也不會有T細(xì)胞反應(yīng)。類似地，如果特異復(fù)合體缺失但 T細(xì)胞存在也沒有反應(yīng)。癌癥中T細(xì)胞識別細(xì)胞異常的機(jī)制也已有涉及。例如，在W092/20356中，公開了 加工成肽的基因家族，上述肽而后表達(dá)于細(xì)胞表面上并能夠通過特異的CTLs導(dǎo)致腫瘤細(xì) 胞的裂解。將這些基因稱之為MAGE家族，且據(jù)說編碼“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子， 并且從所述分子衍生的肽被稱為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。在W094/05304中，公開了結(jié)合到HLA-Al分子的九肽。所述參考文獻(xiàn)公開，假如已 知特定肽對于特定HLA分子的特異性，人們應(yīng)當(dāng)預(yù)期特定肽結(jié)合到一種HLA分子，而不是其 它分子。這是重要的，因為不同的個體具有不同的HLA表型。結(jié)果，盡管作為特定HLA分子 配偶體的特定肽的鑒定具有診斷和治療結(jié)果(ramification)，這些結(jié)果僅僅與具有那種特 定HLA表型的個體有關(guān)。幾種由MHC分子提呈的肽已表征，并且發(fā)現(xiàn)這些肽中的一些可攜帶可能對HLA-肽 復(fù)合體功能性有影響的翻譯后修飾。因此，許多研究已將磷酸化模式的改變與惡性轉(zhuǎn)化相 關(guān)聯(lián)。而且，已有表明，磷酸化對于肽與I類MHC的結(jié)合可能具有中性、負(fù)效應(yīng)或甚至正效 應(yīng)，并且可能產(chǎn)生區(qū)別肽的磷酸化和非磷酸化形式的磷酸肽特異的CTL，表明此CTL很可能 是I類MHC-限制性CTL所有組成成分的部分。最近，已有表明，在體內(nèi)磷酸化肽實際上經(jīng) 天然加工并由MHC I類分子提呈。另外，在從幾種不同的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞分離的I類分 子提取物中磷酸化肽的存在已得以證實。因此，在MHC分子存在下衍生自腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的肽表位能夠由細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTLs)識別為抗原已非常確定(1)。然而，盡管通常公認(rèn)大多數(shù)(如果不是全部) 腫瘤是抗原性的，但是在腫瘤發(fā)展容易由免疫系統(tǒng)控制的意義上，僅僅少數(shù)腫瘤確實是免 疫原性的。
為克服此局限，已開始了幾種免疫療法試驗，例如用TAA-衍生肽接種。對于黑素 瘤，已經(jīng)為此腫瘤表征了最多的CTL-限制的TAAs，通過接種已經(jīng)誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的針對抗原的 CTL反應(yīng)，并且一些患者經(jīng)歷了其疾病的完全緩解(2，3)。然而，用于這些接種試驗的大多 數(shù)肽表位是黑色素細(xì)胞特異的，且這些肽不能應(yīng)用于非黑色素細(xì)胞來源的腫瘤。此外，這些 TAAs的表達(dá)在來自于不同患者的腫瘤間是異質(zhì)的，甚至在來自于同一名患者的轉(zhuǎn)移瘤之間 也不同。然而，在過去幾年中，在許多不同癌癥中表達(dá)的許多腫瘤特異性肽抗原已得以鑒 定，即，HER-2(4)、Muc-l (5)和端粒酶(6)。也已有顯示，通過適當(dāng)?shù)奶幚砟[瘤中存在的腫瘤抗原能夠暴露于免疫系統(tǒng)。研究 表明，免疫反應(yīng)的CD8+CTL臂單獨或與CD4+Th細(xì)胞相結(jié)合構(gòu)成了適應(yīng)性免疫反應(yīng)的原初抗 腫瘤效應(yīng)臂(primary anti-tumor effectorarm)。到目前為止焦點主要集中在免疫反應(yīng)的 CTL臂上。然而，CD4T細(xì)胞反應(yīng)在腫瘤排斥中起根本的作用，尤其是在誘導(dǎo)期或在體內(nèi)CTL 反應(yīng)的擴(kuò)大中，這一點正變得越來越清楚。因此，有效的腫瘤接種方案中II類限制性腫瘤 抗原的并入也許會增加疫苗的有效性。程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞自殺的遺傳程序，已提出程序性細(xì)胞死亡的抑制為參與癌 癥形成的重要機(jī)制，程序性細(xì)胞死亡抑制通過延長有利于轉(zhuǎn)化突變積累的細(xì)胞的壽命導(dǎo)致 癌形成(7)。存活蛋白是新近鑒定的程序性細(xì)胞死亡蛋白抑制因子(IAPs)家族成員。在大 約4百萬轉(zhuǎn)錄物的全球基因表達(dá)分析中，將存活蛋白鑒定為在多種癌癥中總是上調(diào)而在正 常組織中不上調(diào)的首要基因之一(8)。過表達(dá)存活蛋白的實體惡性腫瘤包括肺癌、結(jié)腸癌、 乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌以及造血惡性腫瘤(9)。另外，已報導(dǎo)黑素瘤和非黑素瘤皮膚癌 系列總是存活蛋白陽性(10，11)。多數(shù)人類癌癥中存活蛋白的過表達(dá)暗示了程序性細(xì)胞死 亡抑制在腫瘤發(fā)展中的普遍作用，通過對結(jié)腸和膀胱癌以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤病例中存活蛋白 的表達(dá)與不利的預(yù)后相關(guān)聯(lián)這一觀察，所述概念得以證實。相反，存活蛋白在正常的成人組 織中檢測不到。這些特征使存活蛋白成為用于診斷和治療目的的合適的TAA。因此，在過去的十年中，許多由CTLs識別的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性 形式的TAAs得到鑒定。由于存活蛋白在大多數(shù)人類癌癥中過表達(dá)且其功能的抑制導(dǎo)致增 強(qiáng)的程序性細(xì)胞死亡，因此此蛋白可作為治療性CTL反應(yīng)的靶標(biāo)。存活蛋白蛋白質(zhì)及其潛 在的診斷和治療用途公開于此處引用作為參考的(8)和US6. 245. 523中。存活蛋白是包含 單個BIR和高電荷羧基末端卷曲區(qū)域而不是環(huán)指(RING finger)結(jié)構(gòu)的16. 5kDa胞漿蛋白 質(zhì)，當(dāng)該蛋白轉(zhuǎn)入B細(xì)胞前體時可抑制由生長因子(IL-3)撤消誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。編 碼存活蛋白的基因幾乎與效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-I(EPR-I)的序列相同，但是定向于相反的 方向，從而暗示存在以頭對頭構(gòu)型復(fù)制的兩種獨立基因。因此，可將存活蛋白描述為反義 EPR-I產(chǎn)物。功能上，通過上調(diào)其天然的反義EPR-I產(chǎn)物而引起的對存活蛋白表達(dá)的抑制導(dǎo) 致了大量程序性細(xì)胞死亡和降低的細(xì)胞生長。US6. 245. 523公開了純化的存活蛋白的分離并提供編碼存活蛋白蛋白質(zhì)的核酸分 子，及結(jié)合存活蛋白的抗體和其它分子。US6. 245. 523還公開了存活蛋白蛋白質(zhì)和其變體的 抗程序性細(xì)胞死亡的活性片段，所述變體中一個氨基酸殘基插入到所公開的存活蛋白序列 的N-或C-末端或中間。特別公開，此類肽應(yīng)當(dāng)包含程序性細(xì)胞死亡所需的關(guān)鍵功能殘基， 例如，67位的Trp、73位的Pro和84位的Cys。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了 MHC I類限制性肽可衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)，所述肽能夠結(jié)合
6到MHC I類HLA分子上，從而在患有多種癌癥疾病的患者中引起先體外后體內(nèi)或原位的CTL 免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈暗示存活蛋白作為TRAP分子，所述存活蛋白經(jīng)細(xì)胞加工成具有 TRP功能性的肽。顯然，這些發(fā)現(xiàn)開辟了新的治療和診斷方法的途徑，由于腫瘤細(xì)胞廣泛表 達(dá)存活蛋白的事實，所述新方法通?？蓱?yīng)用于癌癥疾病的控制中。發(fā)明概述因此，本發(fā)明第一方面涉及衍生自存活蛋白的MHC I類限制性表位，所述表位具有 至少一種下列特征(i)能夠以一定親和力結(jié)合限制該表位的I類HLA分子，其中所述親和力使用如文 中描述的裝配結(jié)合測定法測定以能夠半數(shù)最大回收I類HLA分子的肽量(C5tl值)表示最多 為 50μΜ，(ii)能夠以每IO4個PBLs至少1個的頻率在癌癥患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生 INF- γ的細(xì)胞，所述頻率可以通過ELISP0T試驗確定，和/或(iii)能夠原位檢測腫瘤組織中與所述表位肽起反應(yīng)的CTLs。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽具有這三個特征中的至少兩種，最優(yōu)選地具有所有這三種特 征。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物和用于癌癥患者的PBLs或腫瘤組 織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在的先體外后體內(nèi)或原位診斷的組合物，該組合物包含如 上定義的肽。在更進(jìn)一步的方面本發(fā)明涉及用于癌癥患者的PBLs或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng) 性T細(xì)胞存在的先體外后體內(nèi)或原位診斷的診斷試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的肽， 和此肽與I類HLA分子或此分子片段的復(fù)合體。在另一方面還提供了檢測癌癥患者中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞存在的方法，該方法 包括將腫瘤組織或血液樣品與如上所定義的復(fù)合體相接觸，并檢測該復(fù)合體與組織或血細(xì) 胞的結(jié)合。在更進(jìn)一步的方面本發(fā)明涉及能夠特異地結(jié)合本發(fā)明的肽的分子例如抗體或其 片段，并涉及能夠阻斷此類分子結(jié)合的分子。本發(fā)明重要的方面涉及本發(fā)明的肽用于癌癥治療的藥物制備方面的用途。更進(jìn)一 步的方面涉及如上所述的組合物或分子用于癌癥治療的藥物制備方面的用途。更進(jìn)一步的方面獨立地涉及治療哺乳動物例如人類中癌癥的方法，其包括以有效 量的本發(fā)明的肽、組合物或分子施用于患該病的患者。發(fā)明詳述本發(fā)明新的MHC I類限制性肽的特征在于具有幾個特征中的至少一個，所述特征 之一是能夠結(jié)合限制所述肽的I類HLA分子，當(dāng)所述結(jié)合的親和力以如此處所述的裝配試 驗中I類HLA分子的半數(shù)最大回收的肽量(C5tl值)測量時，最多為50 μ M。該裝配試驗如 前所述來完成(12，13)，且該試驗以將肽加入到肽轉(zhuǎn)運蛋白缺陷的細(xì)胞系Τ2后HLA分子的 穩(wěn)定化為基礎(chǔ)。隨后，利用構(gòu)象依賴性抗體將正確折疊的穩(wěn)定HLA重鏈進(jìn)行免疫沉淀并定 量肽結(jié)合。此試驗提供了根據(jù)它們以上述親和力結(jié)合到給定HLA等位基因分子的能力篩選 候選肽的簡單方法。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽在一個實施方案中具有最多為30 μ M的C5tl值，例如最多為20 μ M的C50值，包括最多為10 μ Μ、最多為5 μ M和最多為2 μ M的C5tl 值。如上所述，HLA系統(tǒng)代表人類主要組織相容性(MHC)系統(tǒng)。通常，MHC系統(tǒng)控制著 一系列特征移植抗原、胸腺依賴性免疫反應(yīng)、某些補(bǔ)體因子和某些疾病的誘因。更特別地， MHC編碼三種不同類型的分子，S卩，I類、II類和III類分子，它們決定了 MHC的更加一般的 特征。在這些分子中，I類分子是提呈于大多數(shù)有核細(xì)胞和血小板表面的所稱作的HLA-A、 HLA-B 禾口 HLA-C 分子。本發(fā)明肽的特征在于它們結(jié)合到(受限于)特定MHC I類HLA分子的能力。因 此，在一個實施方案中，所述肽是受限于MHC I類HLA-A分子的一種肽，所述MHC I類HLA-A 分子包括 HLA-Al、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-AlO, HLA-AlU HLA_Awl9、HLA-A23 (9)、 HLA-A24 (9)、HLA-A25 (10)、HLA-A26 (10)、HLA-A28、HLA-A29 (wl9)、HLA-A30 (wl9)、 HLA-A31 (wl9)、HLA-A32 (wl9)、HLA_Aw33 (wl9)、HLA_Aw34 (10)、HLA_Aw36、HLA_Aw43、 HLA-Aw66(10)、HLA_Aw68 (28)、HLA_A69(28)。更多簡單名稱也貫穿應(yīng)用于本文中，其中只用 了主要的數(shù)字名稱，例如HLA-A19或HLA-A24分別代替了 HLA-Aw 19和HLA-A24 (9)。在特 定的實施方案中，本發(fā)明的肽受限于選自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-All和HLA-A24的 MHC I類HLA種類。本發(fā)明的肽衍生自存活蛋白的已知序列，例如，公開于US6. 245. 523的 序列。潛在具有結(jié)合特定HLA分子能力的肽的選擇可通過結(jié)合到給定的具體HLA分子的已 知序列的比對來完成，從而揭示肽的特定位置上少數(shù)相關(guān)氨基酸的超優(yōu)勢度。此類優(yōu)勢氨 基酸殘基此處也稱為“錨定殘基”或“錨定殘基基序”。通過依照此種基于已知序列數(shù)據(jù)的 相對簡單的方法，肽可衍生自可能結(jié)合到特定HLA分子的存活蛋白蛋白質(zhì)分子，所述已知 序列數(shù)據(jù)可在可進(jìn)入的數(shù)據(jù)庫中找到。此類對于一系列HLA分子分析的有代表性的實例在 下表中給出 因此，作為例子，潛在具有結(jié)合到HLA-Al能力的九肽將具有下述序 ^lJ 之 一 :Xaa~T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa~Y> Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y ； Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y 或 Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (Xaa 指任意氨基酸殘 基)。以類似的方式，可設(shè)計潛在具有結(jié)合到任何其它HLA分子的能力的序列。將理解本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員將能夠鑒定給定HLA分子的其它的“錨定殘基基 序”。因此，在有用的實施方案中，本發(fā)明的肽包括這樣的肽，對于表中所列的每個特定 HLA等位基因，所述肽的序列包含任何一個如表中所指出的氨基酸殘基。
因此，鑒定本發(fā)明肽的簡單方法包括下列步驟選擇特定的HLA分子，例如在給 定的群體中以高比率出現(xiàn)的HLA分子，如上所述實施比對分析來鑒定存活蛋白蛋白質(zhì)中的 “錨定殘基基序”，分離或構(gòu)建包含一個或更多已鑒定的錨定殘基的合適大小的肽，并測試 所得肽(i)利用如此處所述的裝配試驗測定的結(jié)合到特定HLA分子的能力，(ii)在如此處 所述的ELISP0T試驗所確定的肽以每IO4個PBLs至少1個的頻率引發(fā)癌癥患者的PBL群 體中產(chǎn)生INF-Y的細(xì)胞的能力，和/或(iii)肽原位檢測腫瘤組織中與所測表位肽反應(yīng)的 CTLs的能力。在特定的實施方案中，本發(fā)明的肽是具有選自下列序列的hla-a2限制性的存 活蛋白衍生肽=Flkldrera (存活蛋白 101_109) (seq id no ι)、tlppawqpfl (存活蛋白 5_14) (seq id no 2)、eltlgeflkl(存活蛋白 95_104) (seq id no 3)、lllgeflkl(seq id no 4)和 lmlgeflkl(seqid no 5)。(括號中的名稱指如us6. 245. 523所公開的存活蛋白蛋白中的 殘基位置)。lllgeflkl(seq id no 4)是通過用“l(fā)”替代肽2位上“t”的衍生自存活蛋白 96-104的序列，且lmlgeflkl(seq id no 5)是通過用“m”替代2位上“t”而衍生自存活蛋白 96-104的序列。在更有用的實施方案中，本發(fā)明的肽是受MHC I類HLA-B分子限制的肽，所述 mhc i 類 hla-b 分子包括下列任何一個hla_b5、hla-b7、hla-b8、hla-b12、hla-b13、 HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17、HLA-B18, HLA-B21、HLA_Bw22、HLA-B27、HLA-B35、 HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA_Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA_Bw46 和 HLA-Bw470在特定的實施方案中，本發(fā)明的肽能夠結(jié)合的MHC I類HLA-B種類選自HLA-B7、 HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27 和 HLA-B51。在特定的實施方案中，本發(fā)明的肽是具有選自下列序列的HLA-B35限制性的存活 蛋白衍生肽CPTENEPDL (存活蛋白 46_54) (SEQ ID NO 6)、EPDLAQCFF (存活蛋白 51_59) (SEQ ID NO 7), CPTENEPDY (SEQ ID NO :8)和 EPDLAQCFY (SEQ ID NO :9)。(括號中的名稱指如 US6. 245. 523所公開的存活蛋白蛋白質(zhì)中的殘基位置)。CPTENEPDY (SEQ ID NO 8)是通過 用“Y”替代肽C-末端“L”的衍生自存活蛋白46_54的序列，EPDLAQCFY(SEQID NO 9)是通過 用“Y”替代C-末端2位上的“F”殘基而衍生自存活蛋白51_59。在更特定的實施方案中，本發(fā)明的肽是具有選自下列序列的HLA-Al限制 性肽存活蛋白 38-46 (Sur38Y9)(在 P9 處 C 變?yōu)?Y，MAEAGFIHY(SEQID NO 38)、存活 蛋白 47_56(Sur47Y10)(在 PlO 處 Q 變?yōu)?Y，PTENEPDLAY(SEQ ID NO :39))、存活蛋白 92_101(Sur92-101) (QFEELTLGEF) (SEQ ID NO :27)、和存活蛋白 93_1(11 (Sur93T2 (在 P2 處 E 變 為t，fteltlgef(seq id n0:36))。本發(fā)明的肽也可為hla-a3限制性肽，例如存活蛋白 18_24(Surl8K10)(在 PlO 處 F 變?yōu)?K, RISTFKNWPK) (SEQ ID NO 57)禾口 / 或 HLA-All 限制性 肽，例如存活蛋白 53_62 (Sur53-62) (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO 45)和 / 或 HLA-A2 限制性肽， 例如存活蛋白 18_28 (Sur 18-28) (RISTFKNWPFL) (SEQ IDNO 66)。在更加有用的實施方案中，本發(fā)明的肽是受MHC I類HLA-C分子限制的肽，所述 MHC I 類 HLA-C 分子包括下列任何一種HLA-Cwl、HLA_Cw2、HLA_Cw3、HLA_Cw4、HLA_Cw5、 HLA-Cw6、HLA-Cw7 禾口 HLA_Cwl60優(yōu)選地，本發(fā)明的肽包含少于50個氨基酸殘基，并且更優(yōu)選地它包含最多20個氨 基酸殘基，例如最多10個氨基酸殘基。在特定實施方案中，該肽為七肽、八肽、九肽、十肽或
11十一肽。如上所述，本發(fā)明的肽衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)或其片段。能夠從中衍生肽的存活 蛋白蛋白質(zhì)來自于任何表達(dá)該蛋白質(zhì)的動物種類。在優(yōu)選的實施方案中，存活蛋白起始蛋 白質(zhì)來自于哺乳動物類包括嚙齒類、兔和靈長類例如人?；谒x擇的存活蛋白蛋白質(zhì)的 序列，本發(fā)明的肽衍生自對存活蛋白起始材料的任何適宜的化學(xué)或酶的處理，所述處理導(dǎo) 致如上所述獲得的合適大小的肽，或者本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的任 何常規(guī)肽合成方法來合成。本發(fā)明的肽可具有衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)的天然序列的序列。然而，對任何給定 的HLA分子具有更高親和力的肽可通過替換、缺失或添加至少一個氨基酸殘基來修飾該天 然序列從而衍生自此天然序列，例如，所述修飾以上述方法為基礎(chǔ)由此鑒定關(guān)于給定HLA 分子的錨定殘基基序。因此，為增加存活蛋白衍生肽的免疫原性，可在錨定位置但不是TCR接觸殘基處 引入氨基酸替換，以增加肽與HLA I類分子的結(jié)合。這樣已獲得更具免疫原性的表位，例如 這已提高了誘導(dǎo)癌癥反應(yīng)性CTL的能力并已證明其更適于誘導(dǎo)臨床上有意義的CTL反應(yīng)。 然而，重要地，目標(biāo)癌細(xì)胞只表達(dá)和提呈天然存活蛋白衍生肽于細(xì)胞表面上。在這方面，對 修飾的存活蛋白衍生肽特異的治療誘導(dǎo)的CTL與天然類似物交叉反應(yīng)，這一點尤其重要。本發(fā)明也包括如此處所公開的存活蛋白衍生肽的變體和功能等同物。本上下文所 用的“功能等同物”通過參考所討論序列的預(yù)定片段的相應(yīng)功能性來確定。功能等同物可 通過例如由ELISP0T試驗所闡明的對HLA I類分子相似的結(jié)合親和力或相似潛能來確定。將理解由于插入、缺失和替換包括保守替換的數(shù)目和范圍增加，如此處所述的存 活蛋白衍生肽的功能等同物或變體顯示出逐漸區(qū)別于優(yōu)選的預(yù)定序列的氨基酸序列。此區(qū) 別被測量為優(yōu)選的預(yù)定序列與衍生自存活蛋白的變體或衍生自存活蛋白的功能等同物之 間同源性的降低。氨基酸序列間的同源性可利用本領(lǐng)域公知的算法來計算。當(dāng)與包含或由連續(xù)的存 活蛋白衍生氨基酸殘基組成的片段具有同源性的片段優(yōu)選地與預(yù)定的存活蛋白衍生肽至 少具有約90%同源性，例如至少94%同源性，包括95%、96%、97%、98%或99%同源性時， 認(rèn)為所述片段在本發(fā)明的范圍內(nèi)。而且，實施本發(fā)明肽的翻譯后修飾是有利的。已有顯示，將乳腺癌MCF-7細(xì)胞或?qū)m 頸癌HeLa細(xì)胞暴露于抗癌試劑(包括阿霉素、紫杉酚或UVB)導(dǎo)致了存活蛋白蛋白質(zhì)表達(dá) 增加4-5倍?？拱┲委熀蟠婊畹鞍姿降淖兓话ù婊畹鞍譵RNA表達(dá)的調(diào)整并且獨立 于從頭基因轉(zhuǎn)錄。相反地，通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑flavopiridol抑制存活蛋 白Thr34上磷酸化導(dǎo)致了存活蛋白表達(dá)的喪失，并且不可磷酸化的存活蛋白Thr34 — Ala與 野生型存活蛋白相比顯示出加速的清除。在存活蛋白Thr34處磷酸化的順序消除增加了乳 腺癌體內(nèi)異種移植模型中不依賴P53的由抗癌試劑誘導(dǎo)的腫瘤程序性細(xì)胞死亡并無毒性 地抑制了腫瘤生長。這些數(shù)據(jù)表明Thr34磷酸化關(guān)鍵性地調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的存活蛋白水平， 并且P34-2激酶活性的隨后除去可除去腫瘤細(xì)胞中存活蛋白生存力(viability)限制點及 增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡。因此，預(yù)期本發(fā)明存活蛋白衍生肽包括磷酸化的肽。天然存活蛋白磷酸肽抗原可 通過掃描磷酸化位點Thr34周圍MHC肽結(jié)合基序的存在來鑒定。因此，可能的衍生自存活蛋白的磷酸肽序列包括TPERMAEAGF 假定的HLA-B35-和/或HLA-B7-和/或HLA-B51-限制性 肽抗原。此處所包括的另外的天然磷酸肽包括HLA-A2 :CACTPERMA和CTPERMAEA ；HLA-A3 FLEGCACTP ；HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51 :WPFLEGCACT (磷酸化 Thr 殘基用斜體標(biāo)記)。本發(fā)明肽的重要特征是識別或引發(fā)產(chǎn)生INF-Y-的效應(yīng)T細(xì)胞的能力，所述細(xì) 胞即特異識別癌癥患者的PBL群體或腫瘤細(xì)胞(靶細(xì)胞)中的特定肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (CTLs)。此活性可通過將來自患者的PBLs或腫瘤細(xì)胞進(jìn)行如參考文獻(xiàn)(16)和下文實施例 中所述的ELISP0T試驗而容易地確定。測定前，刺激要測定的PBL群體或腫瘤細(xì)胞是有利 的，可通過使細(xì)胞與待測肽相接觸實現(xiàn)刺激。優(yōu)選地，在如此處所用的ELISP0T試驗所確定 的，所述肽能夠以每IO4個PBLs至少1個的頻率引發(fā)或識別產(chǎn)生INF-Y的T細(xì)胞。更優(yōu)選 地此頻率為每IO4個PBLs至少5個，最優(yōu)選地每IO4個PBLs至少10個，例如每IO4個PBLs 至少50或100個。ELISP0T試驗代表監(jiān)測存活蛋白肽特異的T細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)大工具。然而，盡管已有 顯示ELISP0T反應(yīng)性在大多數(shù)情況下與CLLs裂解靶細(xì)胞的能力相關(guān)，對此觀念的決定性證 據(jù)只能直接給出。此處提供了這種直接證據(jù)，因為已證實(見實施例2)通過HLA/肽復(fù)合 體分離的存活蛋白反應(yīng)細(xì)胞具備裂解靶細(xì)胞的功能。另外，已證實特異識別本發(fā)明肽的分 離的CTLs能夠裂解不同來源，例如黑素瘤和乳腺癌來源的HLA匹配的腫瘤細(xì)胞。此發(fā)現(xiàn)有 力地證明了癌癥細(xì)胞通常加工和提呈相同的內(nèi)源性存活蛋白肽。因此，此處該發(fā)現(xiàn)的主要 含義是本發(fā)明的肽經(jīng)表達(dá)并與多種不同組織學(xué)來源的腫瘤細(xì)胞上HLA分子形成復(fù)合體。這 使得這些癌細(xì)胞對CTLs的破壞敏感并強(qiáng)調(diào)了存活蛋白免疫對控制不同腫瘤生長的潛在有 用性。PBLs和腫瘤細(xì)胞中存在針對幾種HLA限制性存活蛋白衍生肽表位的自發(fā)性CTL-反 應(yīng)，進(jìn)一步證實了此腫瘤抗原普遍的免疫治療潛力，所述肽表位來自患有三種不相關(guān)的癌 癥類型，即乳腺癌、黑素瘤和CLL的患者。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽能夠引發(fā)患有其中表達(dá)存活蛋白 的癌癥疾病的患者PBL群體中產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞，所述癌癥疾病包括包括慢性淋巴細(xì)胞性 白血病和慢性髓細(xì)胞白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸 癌、胰腺癌和前列腺癌。特別地，本發(fā)明的肽能夠以具有針對癌細(xì)胞系的存活蛋白表達(dá)細(xì)胞 的細(xì)胞毒性效應(yīng)的T細(xì)胞形式引起免疫反應(yīng)，所述癌細(xì)胞系包括選自乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和黑素瘤細(xì)胞系FM3的細(xì)胞系。除它們引發(fā)PBL群體和癌細(xì)胞系中免疫反應(yīng)的能力之外，已證實本發(fā)明的肽還能 夠在原位，即在實體瘤組織中引發(fā)細(xì)胞溶解性免疫反應(yīng)。這已通過提供HLA-肽復(fù)合體(例 如進(jìn)行多聚化和提供可檢測的標(biāo)記)及利用這類復(fù)合體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來檢測腫 瘤組織中與本發(fā)明的表位肽反應(yīng)的CTLs得以證實。因此，本發(fā)明的肽更重要的特征是它能 夠原位檢測腫瘤組織中與表位肽反應(yīng)的CTLs。預(yù)期本發(fā)明的肽除了它們結(jié)合HLA分子導(dǎo)致HLA和肽的復(fù)合體提呈于細(xì)胞表面之 外，該復(fù)合體進(jìn)而作為細(xì)胞溶解性T細(xì)胞的表位或靶標(biāo)，還可引起其它類型的免疫反應(yīng)，例 如導(dǎo)致產(chǎn)生針對該復(fù)合體的抗體的B-細(xì)胞反應(yīng)和/或遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)。后一類型 的免疫反應(yīng)被定義為在本發(fā)明肽的注射部位充血并且可觸知的硬結(jié)。眾所周知，不同的HLA分子在主要人類群體中具有不同的優(yōu)勢。因此，需要鑒定受 限于幾種HLA I類分子的肽表位來擴(kuò)大根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得治療的患者群體。用不同的HLA限制元件對多個存活蛋白表位的表征以兩種重要方式拓寬了此靶抗原的臨床潛力 (i)其增加了適合基于存活蛋白衍生肽的免疫療法的患者數(shù)目。大約有50%的白種人和亞 洲群體體表達(dá)HLA-A2抗原，大約有25%的白種人和5%的亞洲人表達(dá)HLA-Al和HLA-A3抗 原，而大約有15%的白種人和30%的亞洲人表達(dá)HLA-All抗原。盡管這些數(shù)字由于共表達(dá) 而無法相加，受這些多樣性限制的肽的組合肯定能包含大多數(shù)癌癥患者，(ii)每名患者中 幾種限制性元件的集體靶定可能降低由HLA-等位基因缺失而引起的免疫逃逸的危險。單 個HLA等位基因的缺失是關(guān)于癌細(xì)胞描述的MHC改變的重要部分，而I類表達(dá)的完全缺失 是相當(dāng)罕見的事件。因此，隨著受限于不同HLA等位基因的存活蛋白表位的鑒定，目前利用 等位重疊在患者中同時靶定一種以上的HLA分子是可能的。因此，基于本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠開發(fā)高免疫原性的多表位疫苗。優(yōu) 選地，應(yīng)當(dāng)設(shè)計此類疫苗，以促進(jìn)最適存活蛋白衍生肽與如下文所述的其它合適肽和/或 佐劑任選組合的同時遞送。而且，如前所述，對引發(fā)腫瘤特異性T輔助細(xì)胞免疫已有更高的關(guān)注，所述免疫即 用II類MHC限制表位接種，盡管事實上腫瘤一般不表達(dá)II類MHC。這是基于最近的發(fā)現(xiàn) 許多病例中疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)的誘導(dǎo)和功效需要腫瘤特異的CD4陽性Th細(xì)胞的共同 作用。因此，推動具有更多復(fù)雜成分的疫苗開發(fā)的重要因素是對靶向多種腫瘤抗原的期望， 例如通過設(shè)計包含或編碼一組仔細(xì)挑選的CTL和Th細(xì)胞表位的疫苗實現(xiàn)所述靶向。顯然，無需引入(基因編碼)有潛在危險的蛋白質(zhì)例如癌蛋白質(zhì)，多表位疫苗組成 了產(chǎn)生針對衍生自幾種不同抗原的表位的免疫性的有效途徑。這類疫苗也允許針對亞優(yōu)勢 和隱蔽T細(xì)胞表位的免疫力的選擇性誘導(dǎo)，這在腫瘤相關(guān)自身抗原情況下可能尤其重要， 因為針對正常組織中顯著提呈的表位可能存在耐受性。而且，由于抗原提呈細(xì)胞的免疫蛋 白酶體(immunoDroteasome)與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中的‘組成性’蛋白酶體間的功能差別，抗 原提呈細(xì)胞可能無法提呈某些表達(dá)于腫瘤細(xì)胞上的表位。在以肽為基礎(chǔ)的疫苗的情況下， 這類表位能夠以“MHC-現(xiàn)成”的形式施用，這使得能夠通過獨立于抗原攝入的外源裝載來提 呈和由宿主抗原提呈細(xì)胞加工。顯然本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為存活蛋白衍生肽的治療及診斷應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。因此，在更進(jìn)一步的方面本發(fā)明提供了藥物組合物，其單獨包含一種或多種本發(fā) 明的肽或與其它蛋白質(zhì)或肽片段的合適的組合。在特定的實施方案中，這類其它蛋白質(zhì) 或肽片段包括但不限于參與程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)或其肽片段。這類蛋白質(zhì)的合 適的實例可選自Bcl-2蛋白質(zhì)家族，例如，Bcl-2蛋白質(zhì)、Bcl-w蛋白質(zhì)、Mcl-I蛋白質(zhì)、 8(1-\蛋白質(zhì)和衍生自任何這些蛋白質(zhì)的肽片段。其它已知的程序性細(xì)胞死亡抑制因子 包括程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)抑制因子(IAP)家族的成員例如X-IAP、C-IAPl和C-IAP2，這 些蛋白質(zhì)都相對普遍地表達(dá)而程序性細(xì)胞死亡多肽ML-IAP的抑制因子則具有相當(dāng)選擇 性表達(dá)，且主要在黑素瘤中檢測到。因此，能夠引發(fā)特異性T細(xì)胞反應(yīng)，即細(xì)胞毒性T細(xì) 胞反應(yīng)或輔助性T細(xì)胞反應(yīng)的ML-IAP片段可任選地包括于本發(fā)明的組合物中。ML-IAP 的有用的肽片段包括 ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO 75)、ML-IAP280 (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO 76)、ML-IAP90 (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO 77)、ML-IAP154 (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO 78)、ML-IAP230 (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO 79)、ML-IAP98 (PLTAEVPPEL) (SEQ IDNO 80)、ML-IAP34 (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO 81)、ML-IAP54 (QILGQLRPL) (SEQ ID NO 82)、ML-IAP99 (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO 83)、ML-IAP83 (GMGSEELRL) (SEQ IDNO 84)禾口 ML-IAP200 (ELPTPRREV) (SEQ ID NO 85)。另外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可用作包含如上文定義的I類限制性表位和/或II類 限制性表位的多表位疫苗。目前優(yōu)選的多表位疫苗的實例包括“定制的”依賴于特定患者組織類型的存活 蛋白衍生肽表位的組合，例如，具有HLA-A2、HLA-A3和HLA-B35表型的受試者可用包含 surlM2、sur9、surl8K10、sur46Y9、sur51Y9的疫苗接種。另外，本發(fā)明的藥物組合物可有利 地包含至少一種另外的免疫原性蛋白質(zhì)或其肽片段，該蛋白質(zhì)或肽片段選自不屬于或衍生 自存活蛋白蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽片段。在特定的實施方案中，所述免疫原性蛋白質(zhì)或其片 段衍生自如上文所述的Bcl-2蛋白質(zhì)家族。另外的免疫原性的衍生自Bcl-2的肽是HLA-A2 限制性肽，其具有選自下列的序列=Bcl172, Bcl180, Bcl208和Bcl214。由于本發(fā)明的肽是相對小的分子，需要在這類組合物中組合所述肽與多種物 質(zhì)，例如佐劑，以產(chǎn)生疫苗、免疫原性組合物等等。廣義定義的佐劑是促進(jìn)免疫反應(yīng)的物 質(zhì)。通常，佐劑的選擇是弗氏完全或不完全佐劑、或滅活的百日咳桿菌(B. pertussis)生 物，用于例如與明礬沉淀的抗原組合。Goding, Monoclonal Antibodies principles & Practice (第二版，1986)的61-63頁提供了有關(guān)佐劑的全面討論。然而，Goding指出，當(dāng) 目標(biāo)抗原為小分子量或是弱免疫原性抗原時，建議連接免疫原性載體。這類載體分子的 實例包括匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白和家禽免疫球蛋白。已認(rèn)為多種皂苷提 取物可用作免疫原性組合物中的佐劑。近來，已有建議用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)( 一種熟知的細(xì)胞因子)作為佐劑(W097/28816)。因此，本發(fā)明包括進(jìn)一步包含任何佐劑物質(zhì)的治療組合物，所述佐劑包括任何上 述佐劑或其組合。也可預(yù)期，抗原，即本發(fā)明的肽與佐劑可以以任何適當(dāng)?shù)男蛄蟹謩e施用。本發(fā)明的藥物組合物中抗原的選擇依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的參數(shù)。如已 提到的，本發(fā)明的每種不同肽由特定的HLA分子提呈到細(xì)胞表面上。同樣，如果將接受治療 的患者關(guān)于HLA表型進(jìn)行分類，則選擇已知結(jié)合到該特定HLA分子的一種或多種肽。備選地，目標(biāo)抗原基于多種HLA表型在給定群體中的優(yōu)勢來選擇。例如，HLA-A2 是白種群體體中最優(yōu)勢的表型，因此包含結(jié)合到HLA-A2的存活蛋白衍生肽的組合物將在 大部分該群體中有活性。然而，本發(fā)明的組合物也可包含兩種或更多存活蛋白衍生肽的組 合，每種肽特異地與不同的HLA分子相互作用以便覆蓋目標(biāo)群體的更大比例。因此，作為實 例，藥物組合物可包含受限于HLA-A分子的肽與受限于HLA-B分子的肽的組合，例如，包括 那些對應(yīng)于目標(biāo)群體中HLA表型優(yōu)勢的HLA-A和HLA-B分子，例如HLA-A2和HLA-B35。另 外，組合物可包含受限于HLA-C分子的肽?？梢灶A(yù)期，本發(fā)明有用的免疫原性組合物除此處所定義的存活蛋白衍生肽之外， 還可包含免疫學(xué)上有效量的如此處所定義的存活蛋白蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。藥物組合物中本發(fā)明的免疫原性肽的量可依賴于特定應(yīng)用而不同。然而，免疫原 的單次劑量優(yōu)選為大約IOyg至大約5000 μ g，更優(yōu)選地大約50 μ g至大約2500 μ g例如約 IOOy g至約1000μ g。施用的方式包括皮內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用，延時釋放制劑形式的植入 物，等等。此處包含本領(lǐng)域公知的任何和所有施用形式。而且包含本領(lǐng)域公知的適于配制 可注射的免疫原性肽組合物的任何和所有常規(guī)劑型，例如凍干形式和溶液劑、懸浮劑或乳劑形式，如需要的話，上述形式中包含常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、防腐劑、佐劑、緩 沖劑組分，等等。本發(fā)明組合物的免疫保護(hù)效果可利用幾種方法測定。在下文的實施例中提供了其 實例。W097/28816(如前)中有關(guān)于如何測定由免疫原性組合物引起的CTL反應(yīng)的進(jìn)一步 的實例。成功的免疫反應(yīng)也可通過免疫后DTH反應(yīng)的出現(xiàn)和/或特異識別疫苗組合物的肽 的抗體的檢測來測定。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是能夠引發(fā)針對癌癥疾病的免疫反應(yīng) 的免疫原性組合物或疫苗。如此處所用，表達(dá)“免疫原性組合物或疫苗”指引發(fā)針對癌細(xì)胞 的至少一種類型免疫反應(yīng)的組合物。因此，這種免疫反應(yīng)可為上述提及類型的任何一種 CTL反應(yīng)，該反應(yīng)中產(chǎn)生能夠識別提呈于細(xì)胞表面的HLA/肽復(fù)合體的CTLs，導(dǎo)致細(xì)胞裂解， 即疫苗引發(fā)經(jīng)接種受試者產(chǎn)生對癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性效應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞；產(chǎn)生抗癌抗體的 B細(xì)胞反應(yīng)；和/或DTH類型的免疫反應(yīng)。在有用的實施方案中，針對癌癥疾病的免疫原性反應(yīng)通過施用本發(fā)明的肽引發(fā)， 上述施用既可通過將MHC I類分子裝載到來自患者的抗原提呈細(xì)胞(APCs)上；通過從患者 中分離PBLs并用肽孵育細(xì)胞后將細(xì)胞注射回患者；或通過從患者中分離前體APCs并利用 細(xì)胞因子和抗原使細(xì)胞分化成專職APCs后將細(xì)胞注射回患者來實現(xiàn)。因此，在本發(fā)明的一 個實施方案中，治療癌癥患者的方法是這樣的一種方法，此方法通過先體外后體內(nèi)地將肽 呈遞給患者的抗原提呈細(xì)胞(APCs)，然后將經(jīng)過處理的APCs注射回患者中進(jìn)行肽的施用。 實施此方案至少有兩種備選的方法。一種備選方法是從癌癥患者中分離APCs并將MHC I類 分子與肽一起孵育(裝載)。裝載MHC I類分子意味著孵育APCs和肽以便帶有對所述肽特 異的MHC I類分子的APCs將結(jié)合肽并因此能將該肽提呈給T細(xì)胞。然后，將APCs重新注 射進(jìn)患者體內(nèi)。另一備選方法依賴于最近在樹突細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域做出的發(fā)現(xiàn)。在這種情況 下，將單核細(xì)胞(是樹突細(xì)胞的前體)從患者中分離出來并在體外利用細(xì)胞因子和抗原使 單核細(xì)胞分化為專職APC (或樹突細(xì)胞)。這在實施例3和5中描述，其中貼壁的PBLs (主 要是單核細(xì)胞)在體外與61^3 、11^-4和1順-(1 一起培養(yǎng)。隨后，將體外產(chǎn)生的DCs與肽 一起脈沖并注射進(jìn)患者體內(nèi)。由于存活蛋白似乎在大多數(shù)癌癥形式中表達(dá)的事實，本發(fā)明的疫苗能夠用來控制 其中表達(dá)存活蛋白的任何癌癥疾病類型是非?？赡艿摹Ｒ虼?，作為實例，本發(fā)明的疫苗組合 物針對包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮 頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌是免疫活性的。根據(jù)上述描述，技術(shù)人員將容易理解本發(fā)明的肽可以作為癌癥診斷工具，當(dāng)肽是 衍生自在所有癌癥類型中均表達(dá)的存活蛋白時尤其如此。因此，本發(fā)明的肽為開發(fā)有關(guān)癌 癥疾病診斷和預(yù)后的通用方法提供了基礎(chǔ)。因此，在其它有用的實施方案中本發(fā)明的組合 物是用于先體外后體內(nèi)或原位診斷癌癥患者中存在的組合物，例如基于PBLs或腫瘤組織 中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的檢測進(jìn)行診斷。因此，在更進(jìn)一步的方面，提供了用于先體外后體內(nèi)或原位診斷PBLs或腫瘤組織 中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在的診斷試劑盒，該試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的肽，和 檢測癌癥患者中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞存在的方法，所述方法包含將腫瘤組織或血液樣品 與本發(fā)明肽和I類HLA分子或此分子片段的復(fù)合體接觸，并檢測復(fù)合體與組織或血細(xì)胞的
16結(jié)合。另一有用的診斷或預(yù)后方法是以在異源動物種類中產(chǎn)生抗體為基礎(chǔ)，所述抗體為 例如針對本發(fā)明的人存活蛋白衍生肽的鼠抗體，然后所述抗體可用于，例如診斷提呈該肽 的癌細(xì)胞的存在。對于這類免疫目的，肽的量可低于體內(nèi)治療過程所用量，例如上面提到的 量。通常，優(yōu)選的劑量可為大約Iyg至大約750yg肽?；诶帽景l(fā)明的肽的免疫也可 以產(chǎn)生單克隆抗體。因此，本發(fā)明還涉及分子，尤其是單克隆或多克隆抗體，包括其片段，該 分子能夠特異地結(jié)合本發(fā)明的肽，還涉及能夠阻斷此類結(jié)合的分子，例如針對針對本發(fā)明 肽的單克隆或多克隆抗體而產(chǎn)生的抗體。在一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽與I類HLA分子或此分子片段的復(fù)合體，其可 作為診斷試劑，例如如上所述。此復(fù)合體可通過任何常規(guī)方法包括下文實施例所述的方法 來制備。這種復(fù)合體可為單體的或多體的。本發(fā)明提供了減輕或治愈癌癥疾病的方法。因此，將如上文所定義的肽用于癌癥 治療藥物的制備是本發(fā)明更進(jìn)一步的方面。本發(fā)明更進(jìn)一步的方面涉及如上文所定義的分 子或組合物用于制備癌癥治療藥物的用途。優(yōu)選地，癌癥疾病與存活蛋白的表達(dá)有關(guān)，癌癥 疾病包括例如，包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳 腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌。此用途包括對患所述疾病的患者 施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物、能夠特異結(jié)合本發(fā)明肽的分子和/或能夠阻斷此 種分子結(jié)合的分子。在一些情況下，聯(lián)合使用本發(fā)明與常規(guī)癌癥治療例如放射療法或化學(xué)療法將是適 當(dāng)?shù)摹，F(xiàn)在將以下面的非限制性實施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)描述，其中

圖1說明了 ELISP0T中所測的患者CLLl對于無肽、Surl肽(LTLGEFLKL，SEQ ID NO 10)和Sur9肽(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO 3)的T細(xì)胞反應(yīng)。將PBLs用肽刺激一次后， 以每孔6X IO5個細(xì)胞一式兩份接種平板。利用CCD掃描裝置和計算機(jī)系統(tǒng)計算出每種肽 的斑點的平均數(shù)，圖2說明了 ELISP0T中所測的患者CLLl對于無肽、肽類似物Sur 1L2 (LLLGEFLKL， SEQ ID NO 4)和肽類似物 SurlM2(LMLGEFLKL，SEQ ID NO 5)的 T 細(xì)胞反應(yīng)。將 PBLs 用肽 刺激一次后，以每孔IO4個細(xì)胞一式兩份接種平板。利用CCD掃描裝置和計算機(jī)系統(tǒng)計算 出每種肽的斑點的平均數(shù)，圖3顯示了 ELISP0T中所測的患者CLL2和CLL3對于無肽(黑條形)、Surl肽 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO 10)(灰條形)、Sur9 肽(ELTLGEFLKL, SEQ ID NO 3)(白條形)、 肽類似物 SurlL2 (LLLGEFLKL，SEQ ID NO :4)(淺灰條形)和肽類似物 SurlM2 (LMLGEFLKL， SEQ ID N0:5)(深灰條形)的反應(yīng)。每個實驗用每孔IO5個細(xì)胞一式兩份進(jìn)行，并計算出斑 點的平均數(shù)，圖4代表用ELISP0T試驗所分析的T細(xì)胞對于無肽(黑條形)、Surl肽 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO 10)(灰條形)、Sur9 肽(ELTLGEFLKL，SEQID NO 3)(白條形)的反 應(yīng)，其中上述T細(xì)胞分離自患者M(jìn)ell、Mel2和Mel3的腫瘤浸潤淋巴結(jié)并在體外刺激一次。 每個實驗以每孔IO5個細(xì)胞一式兩份進(jìn)行。每個實驗中還包括兩個未加肽的孔。對每名患 者計算出每種肽的斑點的平均數(shù)，
圖5顯示了存活蛋白特異的CTLs的功能活性。CTLs是利用包被存活蛋白的磁珠 分離自黑素瘤浸潤的淋巴結(jié)。(A)黑素瘤細(xì)胞系HLA-A2陽性FM3 (三角形)和HLA-A2陰 性FM45 (正方形)的特異裂解。(B)乳腺癌細(xì)胞系HLA-A2陽性MCF-7 (三角形)和HLA-A2 陰性BT-20 (正方形)的特異裂解，圖6顯示了乳腺癌患者的PBL中存活蛋白反應(yīng)性CTLs的頻率。通過ELISP0T檢 測三名乳腺癌患者(分別上、中和下)中的反應(yīng)性。對于每名患者，在不存在肽、存在surl 肽、存在sur9和存在修飾的SurlM2肽時進(jìn)行測定。每孔使用1 X IO4個效應(yīng)細(xì)胞。該圖描 述了反應(yīng)性細(xì)胞的定量；灰色柱形代表產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞的平均數(shù)，圖7說明了 HLA-35對存活蛋白衍生肽的結(jié)合，以及通過存活蛋白衍生肽對 HLA-B35分子的肽介導(dǎo)的回收的分析。在50、5、0. 5,0. 05和0. 005mM肽存在下，將代謝標(biāo) 記的T2-B35細(xì)胞的裂解物在4°C下孵育。在裝配試驗中分析HLA-B35的回收并在IEF-凝 膠電泳后利用ImageGaug印hosphorimager軟件(FUJI photo film有限公司，日本)定量。 C50值是與HLA-B35的半最大結(jié)合所需肽的濃度，圖8顯示了癌癥患者的PBLs中所觀察到的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)。A) ELISPOT試驗所 測定的無肽(白條形)、有sur51-59(黑條形)或sur46_54(灰條形)時體外刺激的PBLs 中的IFN γ斑點形成細(xì)胞的數(shù)目，所述PBLs來自患者CLL5 (IO5個細(xì)胞/孔),HEMl2 (IO5個 細(xì)胞/孔)和HEM8(5X104個細(xì)胞/孔)，B)與肽脈沖的成熟自體樹突細(xì)胞培養(yǎng)10天的來 自HEM12的1. 7 X IO5個PBL中斑點形成細(xì)胞數(shù)。柱形代表兩次測量的平均值。圖9表明了針對黑素瘤患者中的天然和修飾的存活蛋白肽的自發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。A) 用ELISP0T試驗所測得的來自患者FM25的PBLs (4X IO3個細(xì)胞/孔)禾口 TILs (7 X IO4個細(xì) 胞/孔)以及來自患者FM45的TILs (IO4個細(xì)胞/孔)中針對sur51_59和sur51Y9的斑點 形成細(xì)胞的數(shù)目。B)在ELISP0T試驗中測量的來自FM74的TILs (5 XlO3個細(xì)胞/孔)中 針對sur46-54和surf46Y9的斑點形成細(xì)胞數(shù)。柱形代表了利用扣除非特異IFN γ釋放 的兩次測定的平均值。圖10說明了存活蛋白衍生肽對于HLA-Al的結(jié)合親和力。用Phosphorimager將I 類MHC重鏈的條帶定量。穩(wěn)定化的HLA-Al重鏈的量與所加肽的結(jié)合親和力直接相關(guān)。由 40,4,0. 4,0. 04 μ M Sur93_101 (線形)、Sur93T2 (正方形)、Sur49_58 (圓形)或流感 Α,ΡΒΙ 591-599 (三角形)誘導(dǎo)HLA-Al的肽介導(dǎo)的回收(任意單位)，圖11顯示了針對HLA-Al限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性 T細(xì)胞反應(yīng)由ELISP0T試驗來測定。在來自黑素瘤患者的5 X IO4體外刺激的PBL或TIL中， 對Sur92-101、Sur38Y9、Sur47Y10和Sur93T2反應(yīng)形成肽特異IFN γ斑點的平均數(shù)目。在 對來自黑素瘤(Mel)患者的6個PBL樣品和3個TIL樣品的分析中觀察到了所顯示的肽特 異反應(yīng)。非特異的IFNy斑點已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖12顯示了針對HLA-All限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自 發(fā)性τ細(xì)胞反應(yīng)由ELISP0T試驗來測定。在來自癌癥患者的5X IO4個體外刺激的PBL或 TIL中，對Sur53-62反應(yīng)形成肽特異IFNy斑點的平均數(shù)目。在對5名黑素瘤(Mel)患者 (5PBL, 1TIL)和2名CLL(CLL)患者(PBL)的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異 的IFNy斑點已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖13說明了針對HLA-A3限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì)胞反應(yīng)由ELISP0T試驗來測定。在來自黑素瘤患者的5X IO4個體外刺激的PBL或TIL 中，對SurlSKlO反應(yīng)形成肽特異IFNy斑點的平均數(shù)目。在對來自黑素瘤(Mel)患者的23 個PBL樣品和4個TIL樣品的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異的IFNy斑點 已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖14說明了針對HLA-A2限制性肽的自發(fā)性反應(yīng)。針對存活蛋白衍生肽的自發(fā) 性τ細(xì)胞反應(yīng)由ELISP0T試驗來測定。在來自癌癥患者的5X IO4個體外刺激的PBL中，對 11聚體肽Sur 18-28反應(yīng)形成肽特異IFNy斑點的平均數(shù)目。在對2名黑素瘤(Mel)、6名 CLL(CLL)和2名乳腺癌(MC)患者的分析中觀察到了所顯示的肽特異反應(yīng)。非特異的IFN γ 斑點已扣除。橫條形多次測量的范圍，圖15說明了通過ELISP0T試驗所測定的針對存活蛋白衍生肽的自發(fā)性T細(xì) 胞反應(yīng)。在來自5名黑素瘤患者(mel25、mel26、mel3、mel6、mel39)、兩名CLL患者 (CLL1、CLL54)和2名乳腺癌患者(breastll、breastl5)的IO5個體外刺激的PBL中，對 sur6-14 (LPPAffQPFL)反應(yīng)形成肽特異IFN γ斑點的平均數(shù)目。非特異的IFNy斑點已扣 除，圖16說明了 4名患者(▲ RW、· KN,-WffE, ■ GB)的免疫療法后對LDH、膽堿酯酶、
肌酸酐、血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板穩(wěn)定檢測的實驗值，和圖17表明了通過IFNy ELISP0T來評定的存活蛋白肽免疫性的動力學(xué)分析。 PBMCs在首次DC接種之前和接種后3個月獲得。描述了高于背景的IFNY斑點形成細(xì)胞的 數(shù)目。在下表中，列出了此處所用的肽的氨基酸序列和它們各自的SEQ IDNOs
實施例1癌癥患者中針對程序性細(xì)胞死亡抑制因子蛋白質(zhì)存活蛋白的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞反應(yīng)的鑒定MM利用衍生自存活蛋白的CTL表位，通過ELISP0T分析研究了針對來自慢性淋巴細(xì) 胞性白血病(CLL)患者外周血中和黑素瘤患者腫瘤浸潤淋巴結(jié)中此類抗原的特異性T細(xì)胞 反應(yīng)。在6名黑素瘤患者的3名和4名CLL患者的3名中檢測到了針對存活蛋白衍生肽表 位的CTL反應(yīng)。在來自6名健康對照的PBL中未檢測到T細(xì)胞反應(yīng)。因此，存活蛋白衍生 肽可作為抗癌免疫療法策略的重要和可廣泛應(yīng)用的靶標(biāo)。篩選存在HLA-A女0201 (HLA-A2)結(jié)合肽基序的存活蛋白蛋白質(zhì)并在成功鑒定后， 通過ELISP0T試驗將此肽用于白血病和黑素瘤患者中特異性T細(xì)胞反應(yīng)的測試。在兩種患 者群體中均檢測到了針對兩種存活蛋白衍生肽表位的CTL反應(yīng)，而健康對照中未能檢測到 T細(xì)胞反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明存活蛋白代表被自體T細(xì)胞識別的廣泛表達(dá)的腫瘤抗原。材料與方法患者和正常對照將來自4名診斷為CLL(命名為CLL1-4)的患者的外周靜脈血樣品和來自6名正 常個體的血樣品收集到肝素化管中。利用Lymphopr印分離來分離PBLs并在含10%二甲 亞砜的胎牛血清(FCS)中冷凍。另外，來自腫瘤浸潤淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞從6名黑素瘤患 者(命名為mell-6)獲得。將剛切除的淋巴結(jié)切成小碎片，壓碎使細(xì)胞釋放進(jìn)培養(yǎng)液并冷 藏。從4名黑素瘤患者得到PBLs。如利用HLA-A2特異抗體BB7. 2通過FACS分析所測定 的，所包括的所有個體都是HLA-A2陽性。此抗體純化自雜交瘤上清液?；颊邩悠返米缘?的State University Hospital, Herlev0在做任何這些測量之前均從患者處獲得知情同
辰、ο存活蛋白衍生肽所有肽均來自Research Genetics (Huntsville, AL，美國)且以如 HPLC 和 MS 分 析所核實的大于90%的純度提供。所用的肽在表1中列出表1.此研究中所撒__t及它們對HLA-A2的結(jié)合親和力 3下標(biāo)所列的數(shù)值范圍指肽在如US6. 245. 523所公開的存活蛋白序列中肽的位置。bC50值是如下所述測定的對HLA-A2的半最大結(jié)合所需肽的濃度。用于肽與I類MHC分子結(jié)合的裝配試驗用于合成肽與I類MHC分子結(jié)合的裝配試驗如所述(12，13)的來完成，其中所述I 類MHC分子經(jīng)[35S]-甲硫氨酸代謝標(biāo)記。裝配試驗以將肽加入到肽轉(zhuǎn)運蛋白缺陷的T2細(xì) 胞系后I類分子的穩(wěn)定化為基礎(chǔ)。隨后，利用構(gòu)象依賴性抗體免疫沉淀正確折疊的穩(wěn)定MHC 重鏈。IEF電泳后將凝膠置于phosphorlmager屏曝光，并利用Imagequant PhosphorImager 程序(Molecular Dynamics, Sunnyvale,力口拿大)定量月太結(jié)合。PBLs的抗原刺激為增加ELISP0T試驗的靈敏度，分析之前將PBLs在體外刺激一次(14，15)。新鮮 的和從前冷凍的PBLs在ELISP0T試驗中得出了相似結(jié)果。第O天，將PBLs或壓碎的淋巴 結(jié)解凍，置于AIM V培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Roskilde，丹麥)、5%熱滅活的人血清和 2mM L-谷氨酰胺中以2X IO6個細(xì)胞的濃度2mi每孔接種24孔板(Nunc，丹麥)，上述孔中 存在IOyiUt每個實驗中均包括一個不含肽的孔。兩天后，向培養(yǎng)物中加入300IU/ml重 組白介素-2(IL-2) (Chiron，Ratingen，德國)。第12天用ELISP0T試驗測定培養(yǎng)細(xì)胞的反 應(yīng)性。ELISP0T 試驗用于定量肽表位特異的釋放干擾素-Y的效應(yīng)細(xì)胞的ELISP0T試驗如(16)中完 成。簡言之，用抗-IFN-Y-抗體(1-D1K，Mabtech, Nacka，瑞典)包被硝酸纖維素底的96 孔板(Multiscreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene，丹麥)?？捉?jīng)洗滌，用 AIM V 培養(yǎng) 基封閉后，將不同細(xì)胞濃度的細(xì)胞一式兩份加入。然后將肽加入每孔并將板孵育過夜。第 二天，在加入生物素化的二級抗體(7-B6-1-生物素，Mabtech)之前，棄去培養(yǎng)基并洗孔。 將板孵育2小時，洗滌并將抗生物素蛋白-酶綴合物(AP-抗生物素蛋白，Calbiochem， Life Technologies)加入每孔。將板在室溫下孵育1小時并向每孔中加入酶底物NBT/ BCIP(Gibco, Life Technologies)，室溫下孵育5_10分鐘。出現(xiàn)暗紫色斑點時即通過自來 水洗滌終止反應(yīng)。利用AlphaImager系統(tǒng)(Alpha Innotech，San Leandro，CA，美國)計數(shù) 斑點并可從斑點形成細(xì)胞的數(shù)目計算出肽特異的CTL頻率。對每一種肽抗原的測試均一式兩份地進(jìn)行。MM存活蛋白衍生肽對HLA-A2的結(jié)合利用主要的HLA-A2特異性錨定殘基(17)，篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以 尋找最可能的HLA-A2九肽和十肽表位。合成了十種存活蛋白衍生肽并檢測了對HLA-A2 的結(jié)合。來自HIV-lpol476-484(ILKEPVHGV，SEQ ID NO :11)(表1)的表位用作陽性對 照。對于陽性對照，I類MHC的半最外回收所需的肽濃度(C5tl值)為0.7μΜ。比較起 來，命名為Sur9(ELTLGEFLKL，SEQ ID NO :3)的肽以C5tl = 10 μ M的親和力結(jié)合。命名為 Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO 1)和 Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO 2)的肽分別以 C5tl = 30 μ M 結(jié)合 HLA-A2，而 Surl(LTLGEFLKL，SEQ ID NO: 10)禾口 Sur3 (KVRRAIEQL，SEQ ID NO 13)結(jié) 合較弱(C5Q > 100 μ Μ)。所檢測肽中的5種(Sur2、Sur4、Sur5、Sur7、和SurlO)不結(jié)合到 HLA-A2。由于Surl是弱HLA-A2結(jié)合劑，所以合成了兩種分別命名為SurlL2和SurlM2的 類似肽，在上述類似肽中分別用更好的錨定殘基(亮氨酸或甲硫氨酸)代替了 2位上天然 的蘇氨酸。所述兩種都以與陽性對照幾乎一樣高的親和力(C5tl= ΙμΜ)結(jié)合到HLA-A2上。CLL患者中對存活蛋白的CTL反應(yīng)在ELISP0T試驗中檢測之前，將來自4名HLA-A2陽性CLL患者的PBLs在體外刺 激一次。選擇此方法以增加ELISP0T的靈敏度。所有上面10種存活蛋白衍生肽都包括在 實驗的第一線(first line)中。檢測了針對Surl和Sur9的反應(yīng)并且只有這些肽的數(shù)據(jù) 在圖中給出。圖1顯示了如患者CLLl中所測定的針對Surl和Sur9的CTL反應(yīng)性。每個 斑點代表一個肽反應(yīng)性產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞。利用CCD掃描裝置和計算機(jī)系統(tǒng)計算出了每 種肽的斑點平均數(shù)目。在CLLl患者中每6X IO5個細(xì)胞中檢測出52個Sur9肽特異性斑點 (在扣除不加入肽的斑點后)(圖1)。未檢測到針對弱HLA-A2結(jié)合肽Surl的反應(yīng)，然而患 者對強(qiáng)HLA-A2結(jié)合肽類似物Sur 1M2反應(yīng)強(qiáng)烈(每IO4個細(xì)胞35個肽特異性斑點)(圖2)。 在此患者中未檢測到針對另一種強(qiáng)HLA-A2結(jié)合肽類似物SurlL2的反應(yīng)(圖2)?；颊逤LL2 對于Sur9反應(yīng)強(qiáng)烈(每IO5個細(xì)胞128個肽特異性斑點)卻對Surl反應(yīng)微弱(每IO5個 細(xì)胞22個肽特異性斑點)(圖3)。針對SurlL2類似物的反應(yīng)相對于天然表位只是稍微增 強(qiáng)，而患者對于Sur 1M2肽的反應(yīng)與針對十聚體肽Sur9相似地強(qiáng)烈?；颊逤LL3中觀察到針 對Sur9的微弱反應(yīng)(圖3)。該患者中未觀察到針對Surl和修飾的Surl肽的反應(yīng)。在最 后一名患者CLL4中未檢測到存活蛋白反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。為研究是否能在健康個體中檢 測出針對存活蛋白的反應(yīng)，分析了來自6名健康HLA-A2陽性對照的PBLs。在任何對照中均 未檢測到針對任何存活蛋白衍生肽的反應(yīng)。黑素瘤患者中針對存活蛋白的CTL反應(yīng)對分離自HLA-A2陽性黑素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了檢測。 將剛切除的淋巴結(jié)切成小碎片并壓碎從而將細(xì)胞釋放進(jìn)培養(yǎng)液。在ELISP0T試驗中檢測之 前在體外用肽將細(xì)胞刺激一次。在6名所分析的患者中的3名中檢測到存活蛋白特異性T 細(xì)胞反應(yīng)。在患者M(jìn)el2和Mel3中檢測到強(qiáng)烈的Sur9反應(yīng)。在這些患者中也檢測到較弱 的針對Surl肽的反應(yīng)(圖4)。在Mell中針對微弱結(jié)合肽Surl的反應(yīng)比針對較強(qiáng)HLA-A2 結(jié)合劑Sur9的反應(yīng)要強(qiáng)(圖4)。在來自最后三名黑素瘤患者(Mel4-6)的腫瘤浸潤淋巴結(jié) 中未檢測到反應(yīng)。檢測了來自兩名存活蛋白反應(yīng)患者M(jìn)e 11和Me 12和來自兩名非反應(yīng)患者
25Mel4和Mel5的PBLs。在來自任何這些患者的PBLs中均未檢測到針對Sur9或Surl的反 應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例2癌癥患者中原位或先體外后體內(nèi)的針對衍生自存活蛋白的MHC I類限制性T細(xì)胞 表位的自發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)鍵乳腺癌、白血病和黑素瘤患者中的原位及先體外后體內(nèi)的針對衍生自存活蛋白的 MHC I類限制性T細(xì)胞表位的自發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)已得到闡明。而且，通過包被MHC/ 肽復(fù)合體的磁珠分離的存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞對于不同組織類型的HLA匹配的腫瘤是細(xì)胞 毒性的。作為普遍的腫瘤抗原，存活蛋白可作為抗癌免疫療法的可廣泛應(yīng)用的靶標(biāo)。材料與方法用于T細(xì)胞染色和T細(xì)胞分選的HLA-肽復(fù)合體的構(gòu)建利用生物素蛋白質(zhì)連接酶(BirA)將酶促生物素化的識別位點與HLAA女0201 胞外結(jié)構(gòu)域(殘基1-275)的5’ -末端融合并且融合體在大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3) 中表達(dá)。該重組蛋白質(zhì)通過大小排阻層析(S印hadeXG25，Pharmacia)和離子交換 (mono-Q, Pharmacia)層析從溶于8M尿素的包函體中得到純化。在修飾的存活蛋白肽 Sur 1M2 (LMLGEFLKL, SEQ IDNO 5)或MAA 肽 gpl00154_163 的存在下，在體外通過稀釋使 HLA A * 0201折疊，并隨后如前所述將其生物素化(35，36)。在用Pharmacia S印hadexG25柱 凝膠過濾除去未結(jié)合的生物素后，用鏈霉親和素-FITC連接的葡聚糖分子(由丹麥DAKO 的L. Winther友情提供)將所述蛋白質(zhì)多聚化以產(chǎn)生用于免疫組織化學(xué)的多價HLA-葡 聚糖化合物。HLA A * 0201 構(gòu)建體是 Mark Μ. Davis 博士(D印t. of Microbiology and Immunology, StanfordUniversity, Palo Alto, CA)的友好贈品。細(xì)胞分離如前所述(37) 來完成。簡言之，將5X IO6個鏈霉親和素連接的磁珠(Dynal，Oslo，挪威)在200 μ 1冷的 PBS中洗滌兩次，加入0. 5 μ g肽/A * 0201單體并將混合物在室溫下孵育15分鐘。洗滌兩 次后將磁珠與PBLs以1 10的比例混合，且隨后孵育1小時后在磁場中沉淀珠子結(jié)合的 細(xì)胞。重復(fù)一次此沉淀步驟。免疫組織化學(xué)染色將組織切片干燥過夜且隨后在冷丙酮中固定5分鐘，用于用FITC-連接的多 聚化肽/MHC復(fù)合體染色。所有孵育步驟均在室溫和黑暗中完成(i)45分鐘一級抗體 (1 100稀釋)，(ii)Cy 3-連接的山羊抗小鼠(1 500稀釋；編號115-165-100，Jackson ImmunoResearch，從德國漢堡的Dianova處獲得)孵育45分鐘，和最后(iii)多聚體75分 鐘。每步之間將載玻片在PBS/BSA 0. 中洗滌兩次10分鐘。將載玻片在vectashield中 封片并保存在冰箱中直到在共焦顯微鏡下觀察為止。細(xì)胞毒性測試用于CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的常規(guī)[51Cr]_釋放測定如(13)中所述的來進(jìn)行。靶 細(xì)胞是自體EBW轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系，HLA-A2陽性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 (從ATCC獲得)、HLA_A2 陽性黑素瘤細(xì)胞系FM3 (38)、HLA-A2陰性乳腺癌細(xì)胞系BT-20 (從ATCC獲得)和HLA-A2陰 性黑素瘤細(xì)胞系FM45 (38)。如通過RT-PCR所檢測的，所有癌細(xì)胞系均表達(dá)存活蛋白(數(shù)據(jù) 未顯不)ο
ELISP0T 試驗ELISP0T試驗用于對肽表位特異性釋放IFN- γ的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行定量且從前已有 描述(39)。簡言之，用抗IFN-γ的抗體(1-D1K MabtechJ^W)包被硝酸纖維素底的96孔 板(Multiscreen MAIP N45, Millipore)并用 AIMV (GibcoBRL，Life Technologies Inc.， GaithersbUry，MD，美國)封閉非特異性結(jié)合。將不同細(xì)胞濃度的淋巴細(xì)胞與特異性肽和T2 細(xì)胞一起加入并在37°C下孵育過夜。兩次洗滌后加入生物素化的檢測抗體(7-B6-1-生物 素，Mabtech)。利用堿性磷酸酶-親和素和各自的底物(GibcoBRL)顯現(xiàn)特異性結(jié)合。在暗 紫色斑點出現(xiàn)時即終止此反應(yīng)，利用AlphaImager系統(tǒng)(Alphalnnotech，San Leandro，CA， 美國)將斑點定量。用于ELISP0T的肽是Surl、Sur9和如實施例1所述的Surl的類似肽 Sur1M2。MMHLA-A2/存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的原位染色在實施例1中，鑒定了白血病和黑素瘤中由T細(xì)胞識別的兩種存活蛋白衍生肽表 位，即Surl。通過用更好的錨定殘基(甲硫氨酸；SurlM2)替換2位的蘇氨酸，Surl對HLA-A2 的弱結(jié)合親和力得到極大提高。此措施使得可以構(gòu)建穩(wěn)定的HLA-A2/肽復(fù)合體。這些復(fù)合 體利用葡聚糖分子得以多聚化，所述葡聚糖分子與鏈霉親和素和FITC連接。多聚化的MHC 復(fù)合體用于對丙酮固定的冰凍材料染色。利用共焦激光顯微鏡，SurlM2/HLA-A女0201反 應(yīng)性CTLs能夠容易地在腫瘤微環(huán)境中原位檢測到。我們描述了 III期黑素瘤患者的原發(fā) 腫瘤和崗哨淋巴結(jié)以及原發(fā)乳腺癌病灶中的此類細(xì)胞。為確保染色的特異性，做了一系列 的陰性對照。無論肽/HLA-葡聚糖多聚體與同一腫瘤上衍生自黑素瘤分化抗原gplOO的肽 的使用，還是在來自于HLA-A2陰性供體的腫瘤樣品情況下使用SurlM2/HLA-葡聚糖多聚體 均未得出陽性染色。分離的存活蛋白反應(yīng)性CTLs裂解不同來源的腫瘤細(xì)胞系為表征存活蛋白反應(yīng)性CTLs的功能性能力，通過包被HLA_A2/SurlM2復(fù)合體的磁 珠將這些細(xì)胞分離(36)。將剛切除的黑素瘤浸潤淋巴結(jié)切成碎片并壓碎使細(xì)胞釋放進(jìn)培養(yǎng) 液。分離前將細(xì)胞在體外用肽刺激一次。分離后一天加入IL-2并在第5天通過ELISP0T或 在標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放試驗中對這些細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的能力進(jìn)行測試。首先，通過ELISP0T分 析可能證實利用修飾的SurlM2/HLA-A2復(fù)合體分離的CTLs也對天然Surl肽起反應(yīng)(數(shù)據(jù) 未顯示)。第二，測試了存活蛋白反應(yīng)性CTLs對于HLA-A2陽性黑素瘤細(xì)胞系FM3 (圖5A) 和HLA-A2陽性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(圖5B)的細(xì)胞毒性。分離的T細(xì)胞有效地裂解了兩種 HLA-A女0201細(xì)胞系。與此相反，未觀察到針對HLA-A2陰性黑素瘤細(xì)胞系FM45 (圖5A)或 HLA-A2陰性乳腺癌細(xì)胞系BT-20(圖5B)的細(xì)胞毒性。通過ELISP0T測量PBL中的存活蛋白反應(yīng)性通過ELISP0T檢查了來自十名HLA-A2陽性乳腺癌患者的PBLs中存活蛋白反應(yīng)性 T細(xì)胞的存在。分析前，為增加測試的靈敏度將PBLs在體外刺激一次。檢查了對于下列存 活蛋白肽的反應(yīng)性Surl、Sur9和Sur 1M2。在十名HLA-A2陽性乳腺癌患者的六名中檢測到 了存活蛋白特異性T細(xì)胞。圖6中給出了代表性實例。來自兩名患者的PBLs中檢測到針 對Surl和修飾的類似物Sur 1M2但不是針對Sur9 (圖6，上部，中部)的反應(yīng)，三名患者中檢 測到針對Sur9而不是針對Surl或SurlM2(圖6底部)的反應(yīng)，一名患者僅應(yīng)答Sur 1M2。
27與此相反，在來自20名健康HLA-A2陽性供體的PBLs中未檢測到存活蛋白反應(yīng)。相似地， 檢查了來自14名HLA-A2陽性黑素瘤患者的PBLs。存活蛋白反應(yīng)存在于這些患者的7名中 (表2)。兩名患者對Sur9肽起反應(yīng)，三名對Sur 1M2肽起反應(yīng)，一名對Surl和SurM2都起反 應(yīng)，一名對所有三種肽都起反應(yīng)。在實施例1中，測試了 3名慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL) 患者中針對存活蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)(表2 ;CLL1、CLL2、CLL3)。利用來自三名另外的CLL患 者的PBLs擴(kuò)大了這些研究。顯著地，所有患者產(chǎn)生了針對至少一種存活蛋白表位的T細(xì)胞 應(yīng)答(表2 ；CLL5、CLL6、CLL7)。另外，檢查了來自一名患有慢性髓性白血病(CML)患者的 PBLs。在此患者中，鑒定出了針對所有三種肽的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。表2中概述了這些數(shù) 據(jù)。 表2.誦i寸ELISP0T檢測丨的在PBLs中含有存活蛋白flt _特異t牛T淋Piffl朐的患、者 a)每IO4個細(xì)胞中反應(yīng)細(xì)胞的頻率；檢查了 14名患者。b)每IO4個細(xì)胞中反應(yīng)細(xì)胞的頻率；檢查了 10名患者。c)每IO5個細(xì)胞中反應(yīng)細(xì)胞的頻率；檢查了 14名患者。實施例3癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-B35-限制性免疫反應(yīng)MM在此研究中，鑒定和表征了兩種受限于HLA-B35的衍生自存活蛋白的表位。針對 這兩種肽表位的特異性T細(xì)胞反應(yīng)性存在于來自患有不同造血惡性腫瘤和黑素瘤的患者的外周血液中。C末端錨定殘基的替換提高了被黑素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的識別。而 且，證實了原發(fā)黑素瘤病灶中原位針對存活蛋白的自發(fā)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。這些表位 擴(kuò)大了將來的疫苗策略適用性，此策略以涉及惡性腫瘤的存活蛋白肽以及有關(guān)患者的HLA 圖譜為基礎(chǔ)。在實施例1和2中，研究了 HLA-A2限制性的衍生自存活蛋白的T細(xì)胞表位。由于 HLA-A2只在大約30%的白種人群體中表達(dá)(63)，需要鑒定受限于其它HLA I類分子的肽表 位以擴(kuò)大可以治療的患者比例。在此研究中，來自受限于HLA-B35的存活蛋白的兩個新的 T細(xì)胞表位得以鑒定，HLA-B35在9%的白種人群體中表達(dá)(63)，并檢測了患有不同造血惡 性腫瘤和黑素瘤的患者中這些存活蛋白肽的自發(fā)性免疫反應(yīng)。材料與方法患者收集癌癥患者的外周靜脈血液樣品，利用Lymphopr印分離來分離PBLs，HLA分型 (Department of Clinical Immunology, UniversityHospital,哥本哈根)并冷凍在含有 10% DMSO的FCS中。篩選出10名HLA-B35陽性患者用于進(jìn)一步的分析。這些患者分別患 有黑素瘤、CLL、濾泡性淋巴瘤(FL)、擴(kuò)散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)。 在收集血液樣品之時，患者在前面四個月中未進(jìn)行過醫(yī)學(xué)上的治療。另外，從三名黑素瘤患 者中收集分離自淋巴結(jié)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)并冷凍于含10% DMSO的FCS中。肽七種合成的存活蛋白衍生肽用于此研究Sur6-14、Surl 1_19、Sur34_43、 Sur46-54、Sur51_59、Sur46Y9、Sur51Y9 和一種衍生自 EBV 的肽 EBNA3A457-466 (63)。所有 肽均從Research Genetics (Huntsville, AL)獲得，并以如通過HPLC和MC分析證實的> 90%的純度提供。這些肽在下面表3中列出。表3.存活蛋白衍生肽對HLA-B35的結(jié)合 用于肽與MHC I類分子結(jié)合的裝配試驗實施例1和實施例2中所描述的裝配試驗用于測定合成肽對于用[S35]甲硫氨酸 代謝標(biāo)記的HLA-B35分子的結(jié)合親和力。簡言之，此試驗以肽介導(dǎo)的空HLA分子的穩(wěn)定化為 基礎(chǔ)，所述HLA分子是在細(xì)胞裂解時釋放自用HLA-B35穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TAP缺陷型細(xì)胞系T2 (由 J. Haurum博士友情提供，Symphogen ApS, Lyngby，丹麥)。用依賴構(gòu)象的mAb W6/32免疫 沉淀穩(wěn)定折疊的HLA分子。通過IEF電泳分離HLA分子，將凝膠暴露于phosphor imager屏 (成像板，F(xiàn)UJI photo film有限公司，日本)，分析并利用ImageGauge phosphorimager軟 件(FUJI photo film有限公司，日本)定量正確折疊的HLA分子的量。
PBLs的抗原刺激為增加ELISP0T試驗的靈敏度，分析前在體外將淋巴細(xì)胞用肽刺激一次(14，15)。 將PBLs或TILs解凍并在96孔板中用50 μ M各自的肽表位在26°C下刺激2小時(每種肽 5 X IO5-IO6個細(xì)胞)，合并后再培養(yǎng)10天，所述培養(yǎng)在37°C下in χ-vivo中用5%的人血清 (HS)以2X IO6個細(xì)胞每孔在24孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)中進(jìn)行。孵育的第二天，加 入^yg/mllLKApodan A/S，丹麥)。第十天在ELISP0T試驗中測試培養(yǎng)細(xì)胞的反應(yīng)性。ELISP0T 試驗用于對收集自癌癥患者的PBLs或TILs中的肽特異性釋放IFN-Y的效應(yīng)細(xì)胞 定量的ELISP0T試驗，如實施例1中所述的來完成。簡言之，用針對人的IFN-Y的mAb 7. 5μ g/ml(l-DlK ；Mabtech，Nacka，瑞典)包被硝酸纖維素底的 96 孔板。在 x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker，MolecularApplications Aps，丹麥)中洗滌和封閉孔并以不同濃 度一式兩份加入細(xì)胞。對于抗原提呈，將含有和不含10 μ M肽的IO4個Τ2-Β35細(xì)胞加入 每孔中。將板孵育過夜，棄去細(xì)胞并洗滌孔后加入生物素化的二級抗體(7-Β6-1-生物素； Mabtech)。在室溫下將板孵育2小時，洗滌并加入親和素-堿性磷酸酶綴合物(AP-親和素； Calbiochem, Life Technologies, Inc.)。室溫下孵育1小時后，加入酶底物氮藍(lán)四唑/磷 酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯(編號K0598, DakoCytomation Norden A/S)，暗紫色斑點在 3-7分鐘內(nèi)顯現(xiàn)。通過用自來水洗滌終止反應(yīng)。利用Alpha Imager系統(tǒng)(Alpha Innotech, San Leandro，加拿大)計數(shù)斑點，并從斑點形成細(xì)胞的數(shù)目計算出肽特異性T細(xì)胞的頻率。對于每種肽抗原所有試驗均一式兩份地進(jìn)行，并且將培養(yǎng)在同一孔中的淋巴細(xì)胞 在含有和不含有肽時以相等的細(xì)胞數(shù)目測試，以測量培養(yǎng)物中肽特異性細(xì)胞的數(shù)目。樹突細(xì)胞(DCs)的成熟培養(yǎng)2小時后從PBLs中分離貼壁細(xì)胞。將這些細(xì)胞在含有10 % FCS的RPMI 1640中(GibcoTM Invitrogen公司，英國)再培養(yǎng)10天。每隔一天加入800ng/ml 61-05卩(？1~印1~(^6吐，倫敦，英國)和 40ng/mlIL-4 (Pi^proTech)。第 10 天，通過加入 50ng/ ml TNF- α (PreproTech)使DCs成熟。成熟后，將DCs釋放并在3 μ g/ml β 2-微球蛋白存 下與20 μ M肽一起在26°C下脈沖2小時。肽特異性T細(xì)胞的分離如實施例2中所述的利用sur51Y9/HLA_B35包被的磁珠分離抗原特異性細(xì)胞。 通過將2. 5μ g單體與5 X IO6個磁珠在40 μ 1 PBS中室溫下孵育20分鐘，將生物素化 的HLA-B35單體和sur51Y9(獲得自Prolmmune，牛津，英國)與鏈霉親和素包被的磁珠 (Dynabeads M-280,Dynal A/S，0slo，挪威)偶聯(lián)在一起。利用磁性裝置(Dynal,A/S,Oslo, 挪威)用PBS將磁性復(fù)合體洗滌三次，并隨后與含有5% BSA的PBLs以1 10的比率混 合，并非常輕柔地旋轉(zhuǎn)1小時。將與磁性復(fù)合體結(jié)合的抗原特異性CD8+T細(xì)胞輕柔地洗滌 二次或三次。分離的細(xì)胞在補(bǔ)加5%人血清的x-vivo中重懸浮幾次并孵育2小時后將磁珠 釋放并從細(xì)胞懸浮液中移走。分離的抗原特異性CD8+T細(xì)胞用于ELISP0T試驗以分析天然 和修飾肽之間的交叉反應(yīng)性。通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行TCR克隆型作圖人類TCR BV區(qū)域1-24的DGGE克隆型作圖已有詳細(xì)描述(66)。簡言之，利用 Purescript Isolation 試劑盒(Gentra Systems Inc. MN)分離 RNA 并利用 TCR beta 鏈可變區(qū)的引物連同共同的恒定區(qū)引物通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄的cDNA。用計算機(jī)程序MELT87確保 如果將50bp的富含GC的序列(GC-夾子)連接在恒定區(qū)引物的5’末端，那么擴(kuò)增的DNA 分子適合于DGGE分析。DGGE分析在含有20% -80%的尿素和甲酰胺梯度的6%的聚丙烯 酰胺凝膠中進(jìn)行。電泳在1 XTAE緩沖液中54°C恒溫下以160V進(jìn)行4. 5小時。免疫組織化學(xué)染色利用如實施例2中所述的方法，將多聚化的肽/HLA復(fù)合體用于鑒定癌癥患者的 腫瘤病灶中原位的抗原特異性T細(xì)胞。生物素化的sur51Y9/HLA-B35單體由英國牛津的 Proimmune有限公司提供。將生物素化的sur51Y9/HLA_B35單體用鏈霉親和素-FITC-連 接的葡聚糖分子(由丹麥Glostrup，DAKO的LWinther友情提供)多聚化以產(chǎn)生用于免疫 組織化學(xué)的多價HLA-葡聚糖化合物。將組織切片干燥過夜并隨后在冷丙酮中固定5分鐘。 所有的孵育步驟均在黑暗中室溫下完成(a) —級抗體(1 100稀釋)45分鐘；(b)Cy3-連 接的山羊抗小鼠抗體(1 500稀釋；編號115-165-100 Jackson ImmunoResearch，獲得自 Dianova，漢堡，德國)45分鐘；及最后(c)多聚體75分鐘。每步之間，在PBS/BSA 0.1%中 洗滌載玻片兩次10分鐘。將載玻片在vectashield中封片并保存在冰箱中直到在共焦顯 微鏡(Leica)下觀察。HLA-B35結(jié)合存活蛋白衍生肽的鑒定根據(jù)HLA-B35的肽結(jié)合基序(67)篩選存活蛋白的氨基酸序列以尋找?guī)в绣^定殘 基的九聚體和十聚體肽。篩選出包含脯氨酸作為2位N-末端錨定殘基和苯丙氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸或酪氨酸作為C-末端錨定殘基的5種肽(表3)。裝配試驗顯示出能夠有效 穩(wěn)定 HLA-B35 的兩種肽:sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO 7)和 sur46_54 (CPTENEPDL，SEQ IDNO :6)。另外，兩種肽 sur34-43 (TPERMAEAGF，SEQ ID NO 20)和 sur6_14 (LPPAWQPFL，SEQ ID NO 18)顯示出弱穩(wěn)定性，而剩余的肽根本不穩(wěn)定HLA-B35。HLA-B35的半數(shù)最大回收所 需的肽濃度(C5tl)估計為對于sur51-59為13 μ M和對于sur46_54為20 μ Μ。比較起來，來 自 ΕΒΝΑ3Α458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO 21)的陽性對照表位 C24 具有估計為 0. 8 μ M 的 C50 值。為提高sur46-54和sur51-59的結(jié)合親和力，將C末端氨基酸用更好的錨定殘基 酪氨酸來代替(67)。在裝配試驗中分析由修飾的肽介導(dǎo)的HLA-B35的回收，并估計出C5tl值 對于 sur51Y9 是 1. 5 μ M 和對于 sur46Y9 是 4 μ M (圖 7)。針對天然肽表位的自發(fā)性免疫反應(yīng)最初，分析了五名患者對于四種天然HLA-B35結(jié)合肽sur51_59、sur46_54、 sur34-43和sur6_14的自發(fā)性免疫反應(yīng)。這五名患者患有不同的造血惡性腫瘤HEM8和 HEM18 患有 MM，HEMl2 患有 FL，HEM9 患有 DLBCL 和 CLL5 患有 CLL。十天的體外刺激后對PBLs進(jìn)行INF-γ ELISP0T試驗，以檢測肽前體CTLs。檢測出 針對兩種天然HLA-B35結(jié)合肽sur51-59和sur46_54的自發(fā)性免疫反應(yīng)。兩名患者HEM12 和CLL5對sur51-59和sur46_54均顯示出反應(yīng)，而HEM8只顯示出針對sur51-59的反應(yīng) (圖8A和B)。在剩余兩名患者HEM9和HEM18中未檢測到反應(yīng)，且在任何患者中均沒檢測 到針對弱結(jié)合肽sur34-46和sur6_14的反應(yīng)。將體外刺激的備選方法用于患者HEM12中，即將PBLs與用sur51_59脈沖的成熟 自體樹突細(xì)胞共培養(yǎng)從而體外刺激CTL反應(yīng)。此培養(yǎng)的PBLs在ELISP0T中顯示出針對
31sur51-59的強(qiáng)烈反應(yīng)性(圖8B)。修飾肽的增強(qiáng)識別如上所述，為提高HLA-B35親和力的肽修飾導(dǎo)致了 HLA-B35相對于天然肽的5_10 倍高的親和力。通過ELISP0T試驗將一組五名黑素瘤患者用于分析針對天然和修飾肽的自 發(fā)性免疫反應(yīng)。PBL樣品在體外刺激后進(jìn)行分析，而直接分析TIL樣品。在來自五名患者中 的三名的PBLs或TILs中觀察到自發(fā)性免疫反應(yīng)。FM25在PBL和TIL樣品中均顯示出針 對sur51-59和sur51Y9的反應(yīng)性(圖9A)。FM45只對修飾肽sur51Y9起反應(yīng)，在TILs中 可檢測到強(qiáng)烈反應(yīng)。在此患者中未獲得PBLs (圖9A)。FM74在TIL中顯示出針對sur46Y9 的強(qiáng)烈反應(yīng)，但未檢測到針對天然肽的反應(yīng)(圖9B)。在來自FM74的PBLs中也觀察到針對 sur46Y9的弱反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。天然和修飾肽之間的交叉反應(yīng)性Sur51Y9對HLA-B35的高親和力使得用sur51Y9產(chǎn)生HLA-B35的穩(wěn)定單體成為可 能。在來自不同癌癥患者的腫瘤浸潤淋巴結(jié)和PBLs中存活蛋白反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的存在 已經(jīng)確定，用此類HLA-B35/Sur51Y9復(fù)合體包被磁珠并將這些磁珠用于從患者CLL5的PBL 中分離存活蛋白肽反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。此患者顯示出針對sur51-59的強(qiáng)烈反應(yīng)。如通過顯 微術(shù)所顯現(xiàn)的，珠子緊密結(jié)合到特異性細(xì)胞的細(xì)胞表面(數(shù)據(jù)未顯示)，容許通過磁場沉淀 抗原特異性細(xì)胞。分離的sur51Y9特異性細(xì)胞強(qiáng)烈應(yīng)答sur51-59 (圖9)，而在剩余的PBLs 中未能檢測到應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。此分離通過RT-PCR/DGGE為基礎(chǔ)的TCR克隆型作圖來 分析。此技術(shù)允許對復(fù)雜細(xì)胞群體中的T細(xì)胞克隆性(clonality)的分析，甚至只要獲得 少數(shù)細(xì)胞就可分析。這些分析表明8個不同的克隆得以分離(數(shù)據(jù)未顯示)?？乖禺愋訲細(xì)胞原位存在于黑素瘤病灶中利用與鏈霉親和素和FITC連接的葡聚糖分子將sur51Y9/HLA-B35單體多聚化。利 用實施例2中所述的方法將多聚化的MHC復(fù)合體用于對丙酮固定的冰凍材料染色?？乖?異性細(xì)胞用共焦激光顯微鏡觀察。分析了來自三名患者的原發(fā)黑素瘤切片，并在一名患者 的腫瘤微環(huán)境中能夠在原位容易地檢測到Sur51Y9/HLA-B35反應(yīng)性CTLs。用針對粒酶B的 mAb的共染色表明這些存活蛋白特異性CTLs釋放粒酶B，發(fā)揮細(xì)胞毒素的活性，將HLA-B35 陰性黑素瘤患者用作對照(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例4具有不同HLA-A限制譜的新的衍生自存活蛋白的CTL表位的鑒定MM以癌癥患者中的CTL反應(yīng)為基礎(chǔ)表征了新的HLA-A1-、HLA-A2-、HLA-A3-和 HLA-All-限制性存活蛋白表位。這些表位顯著增加了適合基于存活蛋白衍生肽的免疫療法 的患者數(shù)。另外，幾種限制元件的集體靶定可能降低HLA-等位基因缺失造成的免疫逃逸的危險。材料與方法患者患者樣品獲得自德國的University of Wurzburg大學(xué)和丹麥Herlev的 University Hospital。在做任何這些測量之前均獲得了患者的知情同意。組織分型在丹 麥哥本哈根的 Department of Clinical Immunology, University Hospital 進(jìn)行。利用Lymphopr印分離來分離患有黑素瘤、乳腺癌和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者的外周血 淋巴細(xì)胞(PBL)并冷凍在含有10%二甲亞砜的胎牛血清(FCS)中。而且，獲得了來自黑素 瘤患者的原發(fā)病灶和腫瘤浸潤淋巴結(jié)的T淋巴細(xì)胞。將剛切除的腫瘤組織切成小快并壓碎 以釋放用于冷藏的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)。月太所有的肽都購買自Invitrogen (Carlsbad，CA，美國)并以如通過HPLC和MS分析 所證實的> 80%的純度提供。所有用到的肽在下面表4、實施例5中列出。細(xì)胞系人T2細(xì)胞系是B-LCL. 174和T-LCL CEM細(xì)胞的TAPl和TAP2缺陷雜種，因此只在 細(xì)胞表面表達(dá)低水平的HLA I類分子(HLA-A * 0201和HLA-B * 5101)。用HLA-A * 0301 轉(zhuǎn)染的T2細(xì)胞由牛津的John RadcliffeHospital IMM的A McMicheael博士友情提供。用 HLA-A * 1101轉(zhuǎn)染的T2細(xì)胞由瑞典斯德哥爾摩Karolinska Institute MTC的M Masucci 博士友情提供。BM36. 1細(xì)胞系也是TAP功能缺陷的并具有與T2相似的表型，在表面低水 平表達(dá) HLA I 類(HLA-A * 0101 和 HLA-B * 3501)。BM36. 1 細(xì)胞由德國柏林的 Humboldt University 的 A Ziegler 博士友情提供。用于肽結(jié)合MHC I類分子的裝配試驗如前所述(12)，在裝配試驗中測定合成肽(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)對用 [35S]-甲硫氨酸代謝標(biāo)記的HLA-Al、-A2、-A3或-All分子的結(jié)合親和力。此試驗以細(xì)胞裂 解時從TAP缺陷細(xì)胞系中所釋放的空HLA分子的肽介導(dǎo)的穩(wěn)定化為基礎(chǔ)。利用HLA I類特 異的構(gòu)象依賴性mAb W6/32將穩(wěn)定折疊的HLA分子免疫沉淀，并通過等電聚焦(IEF)凝膠電 泳將其分離。用 ImageGauge Phosphorimager 禾呈序(FUJI photo film 公司，Carro 11 ton, TX，美國)定量MHC重鏈條帶。條帶的強(qiáng)度與試驗中所回收的肽結(jié)合的I類MHC復(fù)合體的 量是成比例的。其次，HLA分子的穩(wěn)定化程度與所加肽的結(jié)合親和力是直接相關(guān)的。用于 分析HLA分子回收的肽濃度對于HLA-Al和HLA-All是40、4、0. 4,0. 04 μ Μ,而對于HLA-A2 和HLA-A3是100、10、1、0. Κ0.01μΜο隨后對每種肽計算出C5tl值，其為足以達(dá)到半最大穩(wěn) 定化的肽濃度。PBL的抗原刺激為增加ELISP0T試驗靈敏度，分析前在體外刺激一次PBL。第O天，將PBL或壓碎 的淋巴結(jié)解凍并以2ml/孔中2Χ IO6個細(xì)胞接種24孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)，所述細(xì) 胞存在于10 μ M肽存在下的含有5%熱滅活的人血清和2mM L-谷氨酰胺的χ-vivo培養(yǎng)基 (Bioffhi11aker,Wa 1 kersνi 11 e,Mary 1 and)中。兩天后，向培養(yǎng)物中加入20IU/ml的重組白 介素-2(IL-2) (Chiron, Ratingen，德國)。第10天在ELISP0T中測試所培養(yǎng)細(xì)胞的反應(yīng) 性。ELISP0T 試驗如前面描述的(16)，用ELISP0T試驗定量肽表位特異的Y干擾素釋放性效應(yīng)細(xì) 胞。簡言之，用抗-IFN-Y-抗體(1-D1K，Mabtech, Nacka，瑞典)包被硝酸纖維素底的96 孔板(Multiscreen MAIP N45，Millipore，Hedehusene，丹麥)。將孔洗滌，用 X-vivo 培 養(yǎng)基封閉，并將細(xì)胞以不同細(xì)胞濃度一式兩份加入。然后每孔中加入肽并將板孵育過夜。 第二天，在加入生物素化的二次抗體(7-B6-1-生物素，Mabtech)之前，棄去培養(yǎng)基并洗滌孔。將板孵育2小時，洗滌并將抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Calbiochem，Life Technologies, Inc, San Diego，CA，美國)加入每孔。將板在室溫下孵育1小時，洗滌，并在 每孔中加入酶底物NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S，Glostrup，丹麥)并在室溫下孵 育5-10分鐘。暗紫色斑點出現(xiàn)時即通過自來水洗滌來終止反應(yīng)。利用ImmunoSpot Series 2. O分析儀(CTL分析儀，LLC, Cleveland，美國)計數(shù)斑點并可從斑點形成細(xì)胞的 數(shù)目計算出肽特異的CTL頻率。對每種肽抗原的所有測試均一式兩份地進(jìn)行。MMHLA-Al限制件存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-Al的結(jié)合利用主要的HLA-Al錨定殘基3位上的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和C末端的 酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找最可能的HLA-Al九 聚體或十聚體肽表位。因此，合成了六種存活蛋白衍生肽并檢測了與HLA-Al的結(jié)合(表 4)。另外，包括兩種肽 Sur38-46(MAEAGFIHC) (SEQ ID NO :23)和 Sur47_56 (PTENEPDLAQ) (SEQ IDNO :25),盡管它們R含有主要錨定殘基中的一個，因為通過在http //syfpeithi. bmiheidelberR. com/可獲得的Rammensee等人的預(yù)測算法將這兩種肽鑒定為可能的良好 結(jié)合物。估計每種肽的C5tl值，其為HLA-Al的半最大穩(wěn)定化所需的肽濃度(表4)。然而， 這些肽中只有一種Sur92-101(QFEELTLGEF) (SEQ ID NO 27)以與已知陽性對照表位相似高 的親和力結(jié)合，所述陽性對照表位來自如圖10中例示的流感A蛋白質(zhì)堿性聚合酶I(PBl) (VSDGGPNLY)。Sur93_101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO :24)對 HLA-A1 具有低結(jié)合親和力，而所 分析的其它肽中沒有肽結(jié)合到HLA-Al (表4)。因此，我們合成了許多類似肽，在其中更好的 錨定殘基代替了天然氨基酸。我們在C末端引入酪氨酸(Y)分別代替半胱氨酸(C)或谷氨 酰胺(Q)來修飾兩種肽 Sur38_46(MAEAGFIHC) (SEQ ID NO 23)和 Surf7-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID N0:25)。兩種修飾肽都強(qiáng)烈地結(jié)合到HLA-Al上(表4)。另外，我們用輔助錨定 蘇氨酸(T)或絲氨酸(S)替換兩種肽Sur92-101和Sur93_101中2位上的氨基酸。這些修 飾對 Sur92-101 與 HLA-Al 的結(jié)合不具有正效應(yīng)。相反，Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ IDNO 36)對HLA-Al以高親和力結(jié)合(表4)。圖10說明了與來自流感的陽性對照表位相比，天 然低親和力肽Sur93-101、高親和力修飾肽Sur93T2和非結(jié)合肽Sur49_58的結(jié)合。最后，我 們在 C 末端用酪氨酸(Y)修飾了 Surl4-22、Sur34_43、Sur49_58、Sur51_59、Sur92_101 和 Sur93-101，然而這沒有提高任何這些肽對于HLA-Al的結(jié)合親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-Al限制性CTL反應(yīng)通過ELI SPOT分析了來自六名黑素瘤患者的PBL和來自三名黑素瘤患者的 TIL中，特異針對四種高親和力的存活蛋白衍生的肽Sur38Y9、Sur47Y10、Sur 92-101和 Sur93T2中任何一種的CTL的存在。在所有來自九名所分析患者的三個PBL樣品和一個TIL 樣品中觀察到針對至少一種存活蛋白衍生肽的T細(xì)胞反應(yīng)性。如圖11中所示，來自一名患 者 Mel. A1-3 的 PBL 具有針對所有 4 種肽 Sur38Y9、Sur47Y10、Sur 92-101 和 Sur93T2 的 T 細(xì)胞反應(yīng)。Mel. A1-2顯示出針對Sur47Y10、Sur 92-101和Sur93T2的反應(yīng)，而在Mel. Al-I/ TIL和Mel. A1-4/PBL中分別觀察到針對Sur47Y10和Sur93T2的反應(yīng)(圖11)。另外，通過ELISP0T試驗了十名黑素瘤患者的針對天然肽Sur93-101、Sur38-46和 Sur47-56的免疫反應(yīng)性；然而，在任何這些肽中都未檢測到肽特異反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
HLA-Al限制件存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-All的結(jié)合篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找九聚體或十聚體肽，所述肽含有相應(yīng)于 HLA-A3超家族包括HLA-A3和HLA-All的結(jié)合基序的結(jié)合基序。根據(jù)Rammensee等人的預(yù) 測算法選擇了含有主要錨定殘基在2位的亮氨酸(L)和C末端的賴氨酸(K)的肽序列，和 在這些位置上具有相關(guān)氨基酸的肽序列(表4)。從存活蛋白的蛋白質(zhì)序列預(yù)測了十三種肽并分析了其與HLA-All和HLA-A3的結(jié) 合。這些肽中的三種 Sur53_62(DLAQCFFCFK) (SEQ IDNO 47) ,Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO 42)和 Sur 112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO 44)以高親和力結(jié)合 HLA-A11，所述親和力 與來自EBV核抗原4 (AVFDRKSDAK) (SEQ ID NO 63)的病毒的表位結(jié)合HLA-All的親和力相 當(dāng)。另夕卜，一種肽 Surll2-121(KIAKETNNKK) (SEQ ID NO 51)與 HLA-A11 弱結(jié)合(表 4)。癌 癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-All限制性CTL反應(yīng)測試了來自五名黑素瘤患者和兩名CLL患者的PBL針對四種HLA-All結(jié)合肽 Sur53-62、Sur54_62、Surll2_120、和 Surll2_121 的 T 細(xì)胞反應(yīng)性。通過 ELISP0T，我們能 夠檢測來自兩名黑素瘤患者M(jìn)el. Al 1-1、Mel. Al 1-2的PBL中針對存活蛋白衍生肽Sur53-62 的反應(yīng)(圖12)。另外，我們能夠在來自患者M(jìn)el.All-2的腫瘤浸潤淋巴結(jié)的腫瘤浸潤淋 巴細(xì)胞(TIL)中檢測到Sur53-62特異性T細(xì)胞(圖12)。在兩年時間內(nèi)從患者M(jìn)el. All-I 所采集的五個不同血液樣品中觀察到針對存活蛋白肽Sur53-62的強(qiáng)免疫反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯 示)°HLA-A3限制性存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-A3的結(jié)合另外分析了經(jīng)預(yù)測結(jié)合HLA-A3超家族的存活蛋白衍生肽與HLA-A3的結(jié)合。只 有兩種肽 Sur112-120(KIAKETNNK)(SEQ ID NO 44)和 Surl12-121(KIAKETNNKK)(SEQ ID NO 57)以高親和力結(jié)合HLA-A3，與病毒表位流感A核蛋白265-273 (ILRGSVAHK) (SEQ ID N0:74)相似(表 4)。而且，兩種肽 Sur53_62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO 47)和 Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO 43)弱結(jié)合至Ij HLA—A3。為了增加對HLA-A3的結(jié)合親和力，修飾了檢測不到結(jié)合的一些肽。因此，我們合 成了兩種類似肽Sur54-62和Surll3_122，在其中2位上用更好的錨定殘基亮氨酸(L)代 替了天然的丙氨酸(A)。Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO 56)以高親和力結(jié)合HLA-A3，而 Surll3L2(ILKETNNKKK) (SEQ ID NO 59)只是弱結(jié)合(表4)。另外，我們合成了四種類似肽 Sur5-13、Surl3-22、Surl8-27、和Sur53_61，在其中用更好的錨定殘基賴氨酸(K)代替了 C 末端天然的苯丙氨酸(F)。Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO 54)和 Surl8K10 (RISIFKNWPK) (SEQ IDNO 58)以高親和力結(jié)合到HLA-A3上，而與天然類似物相比，所述替換對于 Surl3K9(FLKDHRISTK)(SEQ ID NO 57)和 Sur53K9 (DLAQCFFCK)(SEQ ID NO 55)對 HLA-A3 的結(jié)合無可檢測的效果。癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-A3限制性CTL反應(yīng)分析了來自黑素瘤患者的九個樣品(5個PBL和4個TIL)針對兩種天然高親和力 HLA-A3結(jié)合肽Surll2-120和Surll2_121以及兩種天然弱結(jié)合肽Sur53_62和Sur95_103 的免疫反應(yīng)。然而，通過ELISP0T在任何這些患者中均未檢測出針對這些肽的免疫反應(yīng)。隨力的經(jīng)修飾的存活蛋白衍生肽Sur5K9、SUr18K10、 和Sur54L2的自發(fā)性免疫反應(yīng)性。在來自三名患者M(jìn)el. A3-1、Mel. A3-2、Mel. A3-3的TIL 樣品中檢測到針對Surl8K10的CTL反應(yīng)性(圖13)。未檢測到針對另外兩種肽Sur5K9和 Sur54L2的反應(yīng)。為進(jìn)一步證實這些反應(yīng)，分析了來自另外18名黑素瘤患者的PBL的針對 Surl8K10的CTL反應(yīng)性。在這些患者中發(fā)現(xiàn)了三名應(yīng)答患者M(jìn)el. A3_4、Mel. A3-5、和Mel. A3-6，導(dǎo)致在所分析的27名患者中共有6名應(yīng)答患者(表13)。新的HLA-A2限制t牛存活蛋白表擬的鑒定11聚體存活蛋白衍生肽對HLA-A2的結(jié)合利用主要的HLA-A2特異性錨定殘基，篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列尋找最 可能的HLA-A211聚體肽表位。合成了六種存活蛋白衍生肽并檢測了其對HLA-A2的結(jié) 合。沒有檢測到以與已知的陽性對照表位相似的高親和力結(jié)合的肽，所述陽性對照表位來 自 EB 病毒 BMLF280-288 肽(GLCTLVAML) (SEQ ID NO 72)(表 4)。對于陽性對照，HLA-A2 的半數(shù)最大回收所需的肽濃度(C5tl值)是0.9 μ M。比較起來，Surl8-28(RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO 67)禾口 Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQID NO 69)弱結(jié)合到 HLA-A2 (分另Ij C50 =69μΜ和72μΜ)。然而，兩種已知的HLA-A2限制性存活蛋白表位以相似的方式弱結(jié)合 到 HLA-A2 ;Sur95-104(ELTLGEFLKL) (SEQ ID NO 43)以中等親和力(C50= 10 μ M)結(jié)合而 Sur96-104(LTLGEFLKL) (SEQ ID NO 10)只是弱結(jié)合(C5。> 100 μ Μ)。剩余四種所檢測的 11-聚體肽(Sur4-14 (PTLPPAffQPFL) (SEQ ID NO 66)、Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ IDNO 68)、Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO 70)、和 Surl03_113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO 74))不結(jié)合到HLA-A2。癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-A2限制性CTL反應(yīng)最初分析了來自10名癌癥患者(2名黑素瘤(Mel)、6名CLL(CLL)和2名乳腺癌 (MC)患者)的PBL以研究兩種弱結(jié)合11聚體肽Surl8-28和Sur86_96是否由HLA-A2提呈 并由癌癥患者的免疫系統(tǒng)識別。在10名所分析患者中的2名(CLL-l、CLL-2，圖14)的PBL 中發(fā)現(xiàn)了針對Surl8-28的CTL反應(yīng)，而未檢測到針對Sur86_96的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。為 進(jìn)一步證實這些Surl8-28特異性反應(yīng)，分析了來自另外12名患者(7名黑素瘤、1名CLL和 4名乳腺癌患者)的PBL針對此肽的CTL反應(yīng)性。在這些患者中，4名患者(CLL-3、MC-1、 MC-2、Mel. A2-1)具有通過ELISPOT可檢測的Sur 18-28特異性免疫活性(圖14)。因此， 總共22名所分析患者中的6名的PBL具有針對Surl8-28的CTL反應(yīng)。HLA-B7限制性存活蛋白表位的鑒定存活蛋白衍生肽對HLA-B7的結(jié)合篩選存活蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列以尋找九到十個氨基酸組成的肽，所述肽含有 根據(jù)HLA-B7的肽結(jié)合基序的錨定殘基。選出了 5種肽并在裝配試驗中分析了它們穩(wěn)定 HLA-B7的能力。估計每種肽的C5tl值，其為HLA-B7的半最大穩(wěn)定化所需的肽濃度(表4)。 兩個存活蛋白衍生肽 sur6-14(LPPAWQPFL) (SEQ ID NO 18)和 surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQID NO 19)弱穩(wěn)定 HLA-B7，所述肽具有超過 100 μ M 的 C5tl 值；而 sur46_54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO 6)、sur51-59(EPDLAQCFF)(SEQ IDNO 7)和 sur34-43(TPERMAEAGF)(SEQ ID NO 20)不 結(jié)合到HLA-B7 (表4)。癌癥患者中針對存活蛋白衍生肽的HLA-B7限制性CTL反應(yīng)
36
檢測了來自5 名黑素瘤患者(mel25、mel26、mel3、mel6、mel39)、2 名 CLL 患者 (CLLUCLL54)和 2 名乳腺癌患者(breastll、breastl5)的 HLA-B7 陽性 PBL 針對弱 HLA-B7 結(jié)合肽 sur6-14(LPPAWQPFL) (SEQ IDNO 18)和 surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO 19)的 T 細(xì)胞反應(yīng)性。我們能夠在一名CLL患者和一名乳腺癌患者的PBL中檢測到針對存活蛋白衍 生肽sur6-14的強(qiáng)自發(fā)性CTL反應(yīng)(圖15)。另外，我們能夠在黑素瘤患者mel3中檢測到 針對此肽的弱反應(yīng)(圖15)。癌癥患、者中針對存活蛋白衍牛At的HLA等位某_限吿Ht牛免,瘡 應(yīng)概沭利用前面實施例所述的肽與MHC I類分子結(jié)合的裝配試驗，測試了一系列包含 9-11個氨基酸殘基的存活蛋白衍生肽對于下列HLA等位基因的結(jié)合HLA-A1、HLA-A3、 HLA-All和HLA-B7。另外，利用也如上所述的ELISP0T試驗測試了幾種肽引發(fā)CTL免疫反 應(yīng)的能力。結(jié)果，包括前面實施例中所獲得的結(jié)果的概述在下面表4中給出表4.所詵擇的存活蛋白衍牛肽的C=和ELISP0T數(shù)據(jù) 1通過ELISP0T觀察到的一名淋巴瘤患者(HEM34)中針對肽Surl 12-120的反應(yīng)。 ”通過ELISP0T檢測到的3名淋巴瘤患者(HEM9、11、34)中針對肽Sur53_62的反應(yīng)。iv通 過ELISP0T觀察到的黑素瘤患者(FM-TIL95)中的弱反應(yīng)。vii通過ELISP0T觀察到的黑素 瘤患者(PM6)中針對Surll2-121的反應(yīng)，該反應(yīng)在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)懸液中最明顯，而在來自 原發(fā)腫瘤的TIL和PBL中較弱。viii通過ELISP0T在CLL患者(CLL9)中觀察到針對肽Sur6_14的反應(yīng)，并在淋巴 瘤患者(HEM21)中觀察到較弱的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例5利用存活蛋白衍生肽作為免疫原的治療試驗方法MM用經(jīng)修飾的HLA-A2限制性存活蛋白表位，即surlM2肽對5名嚴(yán)重預(yù)處理的IV 期黑素瘤患者接種，所述表位由自愿使用(in a compassionateuse setting)的自體樹 突細(xì)胞提呈。如通過ELISP0T試驗所測的，4名患者產(chǎn)生針對此表位的強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)。而 且，原位肽/HLA-A2多聚體染色揭示出存活蛋白反應(yīng)性細(xì)胞浸潤到內(nèi)臟和軟組織轉(zhuǎn)移瘤 (metastases)中。顯著地，未觀察到接種相關(guān)的毒性。這些數(shù)據(jù)證實誘導(dǎo)針對存活蛋白的 T細(xì)胞反應(yīng)，甚至在晚期黑素瘤患者中誘導(dǎo)也是可行的，且這些接種是良好耐受的。材料與方法患者合格標(biāo)準(zhǔn)和治療方案所有臨床方法均根據(jù)赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)且在治療前為所 有患者提供知情同意。當(dāng)至少兩種不同的化學(xué)的、免疫的或化學(xué)免疫治療后VI期皮膚或血 管膜黑素瘤患者的病情仍然惡化時，他們適于用來研究。另外，患者必須18歲或以上，表達(dá) HLAA女0201并患有通過頭顱、胸部和腹部的計算層析X射線照相術(shù)掃描證實的可測量的 疾病?；颊叩腒arnofsky指數(shù)必須為60%或更好。接種前的4周內(nèi)不允許有全身的化學(xué)、 和/或免疫療法。重要的排除標(biāo)準(zhǔn)是CNS轉(zhuǎn)移、主動自身免疫或傳染性疾病、妊娠和哺乳、 以及顯著的精神異常的證據(jù)。肽脈沖的樹突細(xì)胞如前所述產(chǎn)生(82)。簡言之，將來自白細(xì) 胞除去法(Ieukapheresis)的 PBMCs 在 Lymphopr印TM(Nycomed Pharma)上分離，以等分試 樣冷凍并儲存在液氮中。接種前的一周，將PBMCs解凍、洗滌并培養(yǎng)在含有慶大霉素、谷氨 酰胺和熱滅活的自體血漿的培養(yǎng)基中。在第1和第5天，加入IL-4和GM-CSF。為分化成熟 的DCs，在第6天加入TNF-Y和前列腺素E2。在第7天，將顯示出成熟DCs的表型和形態(tài)
40學(xué)特征即面紗(veiled)外觀和=75%的CD83表達(dá)的細(xì)胞用經(jīng)修飾的衍生自存活蛋白的 HLA-A2 限制性存活蛋白 96_1(14 表位 LMLGEFLKL(SEQ ID NO 10) (Clinalfa 瑞士)14 脈沖。只 有當(dāng)?shù)?和第5天取自培養(yǎng)物的樣品的微生物測試證明是無菌的，才能將細(xì)胞用于接種。對于前兩次接種，對患者以七天間隔進(jìn)行接種，然后以28天間隔進(jìn)行進(jìn)一步的接 種。將總共10-20X 106個成熟的存活蛋白96_1(14脈沖的DCs懸浮在含有人血清白蛋白 的PBS中，并以每個注射部位1. 5X IO6個DCs等分試樣在靠近局部淋巴結(jié)的大腿的腹內(nèi)側(cè) 區(qū)域進(jìn)行皮內(nèi)注射。引流(draining)淋巴結(jié)被除去和/或輻射過的四肢除外。在不存在 患者健康狀態(tài)嚴(yán)重惡化或出現(xiàn)CNS轉(zhuǎn)移的情況下，5次接種后重復(fù)白細(xì)胞除去法。臨床和免疫反應(yīng)的測量接種前和接種后每三個月或如果有疾病發(fā)展的嚴(yán)重臨床病征時，進(jìn)行CT掃描。為 檢測存活蛋白96-1(14特異性的IFN- γ釋放，每三個月利用PBMCs通過ELISP0T試驗監(jiān)視免 疫反應(yīng)。為增加ELISP0T試驗的靈敏度，在10 μ M肽存在下，在24孔板(Nunc，丹麥)中 以每mil X IO6個細(xì)胞的濃度體外刺激PBMCs —次，所述細(xì)胞存在于添加了 5%熱滅活的人 血清和 2mM L-谷氨酰胺的 X-vivo 培養(yǎng)基(Bio ffhittaker, ffalkersville, Maryland)中。 兩天后，加入40IU/ml的重組白介素-2(IL-2) (Chiron, Ratingen，德國)。10天后測試細(xì) 胞反應(yīng)性。為此，用抗IFN-Y抗體(I-DlKMabtechJ^W)包被硝酸纖維素底的96孔板 (Multiscreen MAIP N45, Millipore, Glostrup，丹麥)。以每孔 200μ1 X-vivo 培養(yǎng)基中 IO4-IO5個細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞連同IO4個T2細(xì)胞和終濃度為2μ M的相應(yīng)肽。在37°C下過 夜孵育和兩次洗滌后，加入生物素化的檢測抗體(7-B6-1-生物素，Mabtechj^W )，利用堿 性磷酸酶-抗生物素蛋白連同各自的底物(GibcoBRL)顯現(xiàn)其特異性結(jié)合。當(dāng)暗紫色斑點 出現(xiàn)時終止此反應(yīng)，所述斑點利用AlphaImager系統(tǒng)(Alpha Innotech，San Leandro, CA, 美國)來定量。還通過多聚化存活蛋白96_1Q4/HLA-A * 0201復(fù)合體在接種部位以及內(nèi)臟、軟組織 或皮膚轉(zhuǎn)移瘤原位追蹤了存活蛋白96-1M/HLA-A女0201反應(yīng)性⑶8+T淋巴細(xì)胞。在所有患者 中皮內(nèi)注射24小時后將免疫部位切除，如果容易得到，只將選定患者(患者KN和GB)中的 轉(zhuǎn)移性病灶除去，或在治療目的(curative intent)中除去(患者WW)。對于多聚體肽/MHC 復(fù)合體的染色方法最近已有描述(68)。通過在HLA-A 0201胞外結(jié)構(gòu)域(殘基1-275)的 5’端引入酶促生物素化識別位點來產(chǎn)生多聚化的存活蛋白96_1(i4/HLA-A女0201復(fù)合體。通 過大小 阻(Sephadex G25，Pharmacia,Erlangen，德國)禾口離子交換(mono—Q，Pharmacia) 層析來純化重組蛋白質(zhì)，并在各自肽和β 2-微球蛋白存在下通過稀釋使所述重組蛋白質(zhì) 折疊。在S印hadex G25柱上凝膠過濾后，用連接到葡聚糖分子的鏈霉親和素-FITC(由丹麥 哥本哈根DAKO的L. Winther友情提供)將所述蛋白質(zhì)多聚化以產(chǎn)生多價的HLA-葡聚糖復(fù) 合體。將各自樣品的冷藏切片干燥過夜并隨后在冷丙酮中固定5分鐘。所有孵育步驟均在 黑暗中室溫下如下進(jìn)行:(i)抗-CD8抗體(1 100，克隆HIT8a，Pharmingen, San Diego, CA)45分鐘，(ii)Cy3-連接的山羊抗小鼠(1 500稀釋，編號115-165-100，Dianova，漢堡， 德國)45分鐘，最后(iii)多聚體75分鐘。每步驟之間在PBS/BSA 0.1%中洗滌載玻片兩 次10分鐘。最后，將載玻片在vectashield中封片并在Leica共焦顯微鏡(TCS 4D, Leica, 曼海姆，德國)下觀察。結(jié)果
患者特征、毒性和臨床發(fā)病病程5個極晚期的IV期黑素瘤患者得以參加，兩名患有血管膜黑素瘤、一名患有軟組 織黑素瘤而剩余兩名患有皮膚黑素瘤。由于癥狀性腦轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)，一名患者在兩次接種后 取消治療。其它4名患者接受治療多達(dá)15次接種。一名患者在剩余轉(zhuǎn)移瘤的外科切除術(shù) 后在無腫瘤狀態(tài)下死于心博停止。另一名患者(RW)在10次接種后由于內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而 取消治療。一名患者在15次接種后繼續(xù)進(jìn)行研究。在表5中概述了詳細(xì)的患者特征、先前 的治療、接種的次數(shù)和存活狀態(tài)。無較大的毒性發(fā)生。因此，血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板以及乳酸脫氫酶、肌酸酐和 膽堿酯酶未受接種治療的影響(圖16)。在注射部位未觀察到全身或局部毒性的病征。而 且，未檢測到受損傷口的治愈、出血病癥、心臟功能異常、脈管炎和炎性腸病。在一名患者 (WW)中，預(yù)先存在的肝轉(zhuǎn)移在接種治療下能夠得以穩(wěn)定，但仍出現(xiàn)了新的腎上腺轉(zhuǎn)移。不 幸的是，此患者由于心搏停止而死亡，盡管治療性手術(shù)后無腫瘤。接種開始后僅4周在患者 PB中檢測到腦轉(zhuǎn)移。因此，在僅僅兩次DC注射后，不得不將此患者排除在進(jìn)一步的接種之 外。其它3名患者表現(xiàn)出在他們的一般健康狀態(tài)下無實質(zhì)損傷的轉(zhuǎn)移性疾病的慢速發(fā)展。 顯著地，對于患者KN，能夠達(dá)到13個月的總體生存(從接種開始到死亡)，盡管在接種開始 時有嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性負(fù)荷(load)和快速的疾病發(fā)展?；颊逩B在用存活蛋白肽脈沖的DCs接 種開始后的14個月仍保持在方案中。然而，應(yīng)該注意，兩名患者(RW和GB)都接受過用于 腫瘤控制的其他局部治療皮下腫瘤的放射療法(RW)或局部化學(xué)療法(GB)。存活蛋白特異性⑶8+T細(xì)胞反應(yīng)為監(jiān)視細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的動力學(xué)，通過IFN- γ的ELISP0T試驗測試接種前和 接種后三個月所獲得的PBMCs對于經(jīng)修飾的存活蛋白96_1(14表位的反應(yīng)性。分析前，為增加 試驗的靈敏度在體外刺激PBMCs —次。在所有4名所測試的患者中，存活蛋白96_1(14反應(yīng)性 T細(xì)胞的誘導(dǎo)是明顯的(圖17)。針對其它HLA-A女0201限制性存活蛋白肽，即未修飾的 存活蛋白96_1(14和鄰近的Sur9表位的反應(yīng)性分析證實了在兩名患者(KN和RW)中針對這些 肽的T細(xì)胞反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。在外周血液中腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)測量的預(yù)后和臨床價值已被反復(fù)置疑；因 此，我們還在原位通過肽/MHC多聚體染色，測試了腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中存活蛋白96_1(14/ HLA-A 0201反應(yīng)性⑶8+T淋巴細(xì)胞的存在。為證實此方法，我們首先分析了來自24小時 內(nèi)發(fā)生在接種部位的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的組織樣品。此分析證實了早期觀察肽脈沖的DC的 皮內(nèi)注射誘導(dǎo)強(qiáng)烈的肽特異性炎性T細(xì)胞浸潤。隨后，將肽/MHC多聚體染色方法應(yīng)用于軟 組織和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移瘤，顯示了在⑶8+浸潤中存活蛋白96_1Q4/HLA-A 0201反應(yīng)性細(xì)胞的存在。 此觀察表明接種不僅誘導(dǎo)具有預(yù)期特異性的T細(xì)胞，而且賦予它們必要的歸巢(homing)能 力。
參考文獻(xiàn)1. Van den Eynde, B. J.禾口 Boon, Τ. Tumor antigens recognized byTlymphocytes. Int. J. Clin. Lab. Res.，27 :81_86，1997.2. Rosenberg, S. A. Development of cancer immunotherapies based onidentification of the genes encoding cancer regression antigens. J. Natl. Cancer Inst. ,20 ；88 :1635_1644，1996.3. Marchand, Μ.，van Baren, N.，Weynants, P.，Brichard，V.，Dreno, B.，Tessier, Μ. H.，Rankin，Ε.，Parmiani, G.，Arienti，F(xiàn).，Humblet, Y.，Bourlond，Α.，Vanwi jck, R.， Lienard，D.，Beauduin，Μ.，Dietrich，P. Y.，Russo，V.，Kerger, J.，Masucci，G.，Jager, Ε.，De Greve, J.，Atzpodien, J.，Brasseur, F.，Coulie，P. G.，van der Bruggen, P.，禾口 Boon, Τ. Tumorregressions observed in patients with metastatic melanoma treated with anantigenic peptide encoded by gene MAGE—3 and presented by HLA-A1. Int. J. Cancer,80 :219_230，1999.4. Brossart，P.，Stuhler, G.，F(xiàn)lad，Τ.，Stevanovic, S.，Rammensee, H. G.， Kanz, L，禾口 Brugger，W. Her-2/neu-derived peptides are tumor-associatedantigens expressed by human renal cell and colon carcinoma lines and arerecognized by in vitro induced specific cytotoxic T lymphocytes. CancerRes. ,58 :732-736,1998.5. Brossart，P.，Heinrich，K. S.，Stuhler, G.，Behnke, L，Reichardt，V. L.， Stevanovic, S.，Muhm, Α.，Rammensee, H. G.，Kanz, L，禾口 Brugger，W. Identification of HLA-A2-restricted T—cell epitopes derived from theMUCl tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood，93 :4309_4317，1999.6. Vonderheide, R. H. , Hahn, W. C.，Schultze，J. L，禾口 Nadler，L M. Thetelomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigenrecognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. ,10 :673-679,1999.7. LaCasse, E. C.，Baird，S.，Korneluk，R. G.，禾口 MacKenzie，A. E. Theinhibitors of apoptosis(IAPs) and their emerging role in cancer. Oncogene, 17 :3247_3259， 1998.8. Altier, D. C.，Marchisio，P. C.， 禾口 Marchisio，C. Survivin apoptosis aninterloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest,79 1327-1333，1999.9. Ambrosini，G.，Adida，C.，Sirugo，G.，禾口 Altieri，D. C. Induction ofapoptosis and inhibition of cell proliferation by survivin gene targeting. J. Biol. Chem., 273 :11177-11182，1998.10. Grossman,D. ,McNiff, J. M. ,Li,F.，禾口 Altier，D. C. Expression andtargeting of the apoptosis inhibitor，survivin, in human melanoma. J. Invest Dermatol.，113 1076-1081,1999.11. Grossman， D. ，McNiff, J. M. ， Li， F.，禾口 Altier， D. C. Expression of theapoptosis inhibitor， survivin, in nonmelanoma skin cancer and genetargeting in a keratinocyte cell line. Lab Invest, 79 1121-1126,1999.12. Andersen,M. H.，Sondergaard，I. , Zeuthen, J. ,Elliott, T.，禾口 Haurum，J. S. An assay for peptide binding to HLA-Cw * 0102.Tissue Antigens. ，54 :185_190，1999.Μ. H.，Bonfill, J. Ε.，Neisig，Α.，Arsequel 1, G.，ndergaard，I.， Neef jes，J.，Zeuthen，J.，Elliott，Τ.，禾口 Haurum，J. S. PhosphorylatedPeptides Can Be Transported by TAP Molecules，Presented by Class IMHC Molecules，and Recognized by Phosphopeptide-Specific CTL. J. Immunol.，163 :3812_3818，1999.14. McCutcheon，Μ.，Wehner, N.，Wensky, Α.，Kushner, Μ.，Doan, S.，Hsiao，L， Calabresi，P.，Ha, T.，Tran, Τ. V.，Tate, K. Μ.，Winkelhake, J.，禾口 Spack，Ε. G. A sensitive ELISPOT assay to detect low-frequency humanT lymphocytes. J. Immunol. Methods, 210 :149-166，1997.15. Pass，H. A.，Schwarz, S. L.，Wunderlich, J. R.， 禾口 Rosenberg， S. A. Immuη i ζ at i on of patients with melanoma peptide vaccines immunologicassessment using the ELISPOT assay. Cancer J. Sci. Am. A 316-323,1998.16. Berke, Z.，Andersen，M. H.，Pedersen，M.，F(xiàn)ugger, L，Zeuthen, J.，禾口 Haurum， J. S.Peptides spanning the junctional region of both the abl/bcrand the bcr/abl fusion proteins bind common HLA class I molecules. Leukemia，14 :419_426，2000.17. Falk, K.，Rotzschke, 0.，Stevanovic, S.，Jung，G.， 禾口 Rammensee， H. G. Allele—specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted fromMHC molecules. Nature,351 :290_296，1991.18. Cornel ison, T. L. Human papillomavirus genotype 16 vaecines forcervical cancer prophylaxis and treatment. Curr. Opin. Oncol. , 12 :466-473,2000.19. Lee, S. P.，Chan，A. T.，Cheung，S. T.，Thomas，W. A.，CroomCarter, D.，Dawson, C. W.，Tsai，C. H.，Leung，S. F.，Johnson, P. J.，禾口 Huang，D. P. CTL control of EBV in naso-pharyngal carcinoma(NPC) :EBV_specificCTL responses in the blood and tumors of NPC patients and theantigen-processing function of the tumor cells. J. Immunol.，165 :573_582，2000.20. Swana, H. S.，Grossman, D.，Anthony, J. N.，Weiss, R. Μ.，禾口 Altier，D. C. Tumor content of the antiapoptosis molecule survivin and recurrence ofbladder cancer. N. Engl. J. Med.，341 :452_453，1999.21. Salgaller, Μ. L，Afshar, Α.，Marincola，F(xiàn). Μ.，Rivoltini，L，Kawakami, Y.， 禾口Rosen-berg，S. A. Recognition of multiple epitopes in the humanmelanoma antigen gaplOO by peripheral blood lymphocytes stimulated invitro with synthetic peptides. Cancer Res.，55 :4972_4979，1995.22. Salgaller，Μ. L.，Marincola，F(xiàn). Μ.，Cormier，J. N.，禾口 Rosenberg， S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gapIOOfollowing patient immunization with synthetic peptides. Cancer Res.，56 :4749_4757，1996.23. Valmori，D.，F(xiàn)onteneau，J. F.，Lizana，C. M.，Gervois，N.，Lienard，D.， Rimoldi，D.，Jongeneel，V.，Jotereau，F(xiàn).，Cerottini，J. C.， 禾口 Romero，P.Enhanced generation of specific tumor-reactive CTL in vitro by seIectedMeIan-A/MART-1 immunodominant peptide analogues. J. Immunol·，160 :1750_1758，1998·24. Pardol 1, D. M. Cancer vaccines. Nat. Med.，4 :525_531，1998.
45
25. Kugler, A.，Stuhler, G.，Walden, P.，Zoller, G.，Zobywalski, A.，Brossart, P.，Trefzer, U.，Ullrich，S.，Muller, C. A.，Becker，V.，Gross，A. J.，Hemmerlein，B.， Kanz, L ；Muller, G. Α.，禾口 Ringert，R. H. Regression ofhuman metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumorce11-dendritic cell hybrids. Nat. Med. ,6 332-336，2000.26. Becker，J. C.，Guldberg，P.，Zeuthen，J.，Brocker, Ε. B.，禾口 thor Straten， P. Accumula-tion of identical T cells in melanoma and vitiligo-likeleukoderma. J.Invest. Dermatol.，113 :1033_1038，1999.27. Rohayem, J.，Diestelkoetter, P.，Weigle, B.，Oehmichen，Α.，Schmitz, Μ.， Mehlhorn，J.，Conrad，K.，禾口 Rieber，Ε. P. Antibody response to thetumor-associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients. Cancer Res. 2000. Apr. 1. ；60. (7.) :1815· _7·，60 :1815_1817·28. Adida, C.，Haioun，C.，Gaulard，P.，Lepage，Ε.，Morel，P.，Briere，J.， Dombret, H.，Reyes, F.，Diebold，J.，Gisselbrecht，C.，Salles，G.，Altieri，D. C.，禾口 Molina, Τ. J. Prognostic significance of survivin expression indiffuse large B-cell lymphomas. Blood,96 :1921-1925，2000.29. Islam，A.，Kageyama, H.，Takada, N.，Kawamoto, Τ.，Takayasu, H.，Isogai，Ε.， Ohira，Μ.，Hashizume，K.，Kobayashi，H.，Kaneko, Y.，禾口 Nakagawara，A. High expression of Survivin, mapped to 17q25， issignificantly associated with poor prognostic factors and promotes cellsurvival in human neuroblastoma. Oncogene，19 :617_623， 2000.30. Kawasaki, H.，Altier, D. C.，Lu，C. D.，Toyoda, Μ.，Tenjo，Τ.，禾口 Tanigawa， N.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survivalrates in colorectal cancer. Cancer Res.，58 :5071_5074，1998.31. Schmitz , M.，Diestelkoetter，P.，Weigle, B.，Schmacht enb erg, F.，Stevanovic, S.，Ockert, D.，Rammensee，H. G.， 禾口 Rieber，Ε. P. Generationof survivin-specific CD8+T effector cells by dendritic cells pulsed withprotein or selected peptides. Cancer Res.，60 :4845_4849，2000.32. Andersen，Μ. H.，Pedersen，L. 0.，Becker，J. C.，禾口 thor Straten, P. Identification of a Cytotoxic T Lymphocyte Response to the ApoptoseInhibitor Protein Survivin in Cancer Patients. Cancer Res.，61 :869_872，200L33. Lee, K. H. ， Panelli, Μ. C. ， Kim, C. J. ， Riker, Α. I. ， Bettinotti, Μ. P.， Roden, Μ. Μ.，F(xiàn)etsch，P.，Abati, Α.，Rosenberg，S. Α.，禾口 Marincola，F(xiàn). Μ. Functional dissociation between local and systemic immune responseduring anti-melanoma peptide vaccination. J. Immunol.，161 :4183_4194，1998.34. Rosenberg，S. Α.，Yang，J. C.，Schwartzentruber, D. J.，Hwu, P.，Marincola， F. Μ.，Topalian，S. L.，Restifo，N. P.，Dudley, Μ. Ε.，Schwarz, S. L.，Spiess，P. J.， Wunderlich, J. R.，Parkhurst, Μ. R.，Kawakami, Y.，Seipp，C. Α.，Einhorn，J. H.，禾口 White， D.Ε.Immunologic and therapeuticevaluation of a synthetic peptide vaccine forthe treatment of patients withmetastatic melanoma. Nat. Med. ,4 :321-327,1998.35. Altman，J. D.，Moss，P. A.，Goulder, P. J. R.，Barouch，D. H.， McHeyzerWilliams, Μ. G.，Bell，J. L，McMichael, A. J.，禾口 Davis，M. M. Phenotypicanalysis of antigen-specific T lymphocytes. Science, 274 94~96,1996.36. Schrama, D.，Andersen，Μ. H.，Terheyden，P.，Schroder，L，Pedersen，L 0.， thor Straten，P.，禾口 Becker，J. C. Oligoclonal T-Cell Receptor UsageOf Melanocyte Differentiation Antigen-reactive T Cells in Stage IVMelanoma Patients. Cancer Res.，61 :493-496，2001.37. Luxembourg, A. T.，Borrow, P.，Teyton, L，Brunmark, Α. B.，Peterson，P. Α.， 禾口 Jackson，Μ· R. Biomagnetic isolation of antigen-specific CD8+T cells usable in immunotherapy. Nat. Biotechnol.，16 :281_285，1998.38. Kirkin, Α. F.，Reichert Petersen, Τ. , Olsen, Α. C.，Li，L，thor Straten, P.， 禾口 Zeuthen，J. Generation of human-melanoma specific T lymphocyteclones defining novel cytolytic targets with panels of newly establishedmelanoma cell lines. Cancer Immunol. Immunother.，41 :71_81，1995·39. Scheibenbogen，C.，Lee, K. H.，Mayer, S.，Stevanovic, S.，Moebius，U.，Herr, W.，Rammensee, H. G.，禾口 Keilholz，U. A sensitive ELISPOT assayfor detection of CD8+T lymphocytes specific for HLA class I—bindingpeptide epitopes derived from influenza proteins in the blood of healthydonors and melanoma patients. Clin. Cancer Res. ，3 :221_226，1997.40. thor Straten, P.，Guldberg，P.，Grnb k，K.，Zeuthen，J.，禾口 Becker，J. C. In Situ T-Cell Responses against Melanoma Comprise High Numbers ofLocally Expanded T-Cell Clonotypes. J. Immunol.，163 :443_447，1999.41. Kessler, J. H. , Beekman, N. J. , Bres-Vloemans, S. A. , Verdi jk, P.，vanVeelen， P. A.，Kloosterman-Joosten, A. M.，Vissers，D. C.，ten Bosch, G. J.，Kester, Μ. G.，Si jts， A. ,Wouter,D. J.，Ossendorp，F(xiàn). , Offringa, R.，禾口 Melief，C. J. Efficient identification of novel HLA-A ( *)0201-presentedcytotoxic T lymphocyte epitopes in the widely expressed tumor antigenPRAME by proteasome-mediated digestion analysis. J. Exp. Med.，193 :73_88，2001.42. de Vries, T. J. ,Fourkour, A. ,Wobbes, T.，Verkroost，G.，Ruiter，D. J.，禾口 van Muijen，G. N. Heterogeneous expression of immunotherapycandidate proteins gap100, MART-I, and tyrosinase in human melanomacell lines and in human melanocytic lesions.Cancer Res. ，57 :3223_3229，1997.43. Jager，Ε. ，Ringhoffer，Μ. ，Karbach，J. ，Arand，Μ. ，Oesch，F(xiàn).，禾口 Knuth, A. Inverse re — lationship of melanocyte differentiation antigen expressionin melanoma tissues and CD8+cytotoxic-T-cell responses :evidence forimmunoseIection of antigen-loss variants in vivo. Int. J. Cancer, 66 :470-476, 1996.44. Cormier，J. N.，Abati, Α.，F(xiàn)etsch，P.，Hi jazi，Y. M.，Rosenberg，S. A.，Marincola, F. M.，禾口 Topalian，S. L. Comparative analysis of the in vivoexpression of tyrosinase, MART-I/Me1an-A, and gaplOO in metastaticmelanoma lesions implications for immunotherapy. J. Immunother.，21 :27_31，1998·45. Riker, Α.，Cormier，J.，Panelli，Μ· , Kammula, U. ,Wang, Ε.，Abati，A.，F(xiàn)etsch， P.，Lee, K. H.，Steinberg，S.，Rosenberg，S.，禾口 Marincola，F(xiàn). Immune selection after antigen-specific immunotherapy of melanoma. Surgery, 126 -Λ12-120,1999.46. Maeurer, M. J.，Gollin，S. M.，Martin，D.，Swaney, W.，Bryant, J.，Castelli， C.，Robbins，P.，Parmiani，G.，Storkus，W. J.， 禾口 Lotze，Μ. Τ. Tumor escape from immune recognition lethal recurrent melanoma in apatient associated with downregulation of the peptide transporter proteinTAP-1 and loss of expression of the immunodominant MART-I/MeIan-Aantigen. J. Clin. Invest,98 :1633-1641,1996.47. Grossman，D.，Kim, P. J.，Schechner, J. S.， 禾口 Altier，D. C. Inhibition ofmelanoma tumor growth in vivo by survivin targeting. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A，98 :635-640，2001.48. Tamm，I.，Wang，Y.，Sausville，E.，Scudiero，D. A.，Vigna，N.，Oltersdorf， Τ.， 禾口 Reed，J. C. IAP-family protein survivin inhibits caspaseactivity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases，andanticancer drugs. Cancer Res.， 58 :5315-5320，1998.49. Monzo, M.，Rosell，R.，F(xiàn)elip，E.，Astudillo，J.，Sanchez, J. J.，Maestre， J.，Martin，C.，F(xiàn)ont，A.，Barnadas, Α.， 禾口 Abad，A. A novel anti-apoptosisgene Re-expression of survivin messenger RNA as a prognosis marker innon—small—cell lung cancers. J. Clin. Oncol.，17 :2100_2104，1999.50. Nakagawara, A. Molecular basis of spontaneous regression ofneuroblastoma :role of neurotrophic signals and genetic abnormalities. Hum. Cell，11 :115-124，1998.51. Renkvist, N. ， Castelli， C. ， Robbins, P. F.，禾口 Parmiani， G. A listing ofhuman tumor antigens recognized by T cells. Cancer ImmunolImmunother.，50 3-15，2001.52. Melief, C. J.，Toes，R. E.，Medema，J. P.，van der Burg, S. H.，Ossendorp，F(xiàn).， 禾口Of-fringa，R. Strategies for immunotherapy of cancer. Adv. Immunol. ,75 235-82.
235-282，2000.53. Gilboa, E. The makings of a 263-270,1999.54. Li, F. , Ambrosini, G. ，Chu, Ε. Y.
tumor rejection antigen. Immunity.，11 : ，Plescia，J.，Tognin，S.，Marehisio，P. C.，
禾口 Altier，D.C. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint bysurvivin. Nature,396 :580_584，1998. 55. Zaffaroni, N.禾口 Daidone，M. G. Survivin expression and resistance toanticancertreatments !perspectives for new therapeutic interventions. Drug Resist. Updat.，5 :65_72，2002·
48
5 6 . Shinozawa，I.，Inokuchi，K.，Wakabayash i , I.， 禾口 Dan， K.Disturbedexpression of the anti—apoptosis gene， survivin, and EPR-I inhematological malignancies. Leuk. Res，24 :965_970，2000.57. Granziero, L，Ghia，P.，Circosta，P.，Gottardi，D.，Strola，G.，Geuna，Μ.， Montagna，L，Piccoli，P.，Chilosi，Μ.，禾口 Caligaris-Cappio，F(xiàn). Survivin isexpressed on CD40 stimulation and interfaces proliferation and apoptosisin B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood，97 :2777_2783，2001.58. Ambrosini, G.，Adida，C.，禾口 Altier，D. C. A novel anti-apoptosis gene， survivin, expressed in cancer and lymphom. Nat. Med. ,3 :917-921,1997.59. Altier, D. C. Validating survivin as a cancer therapeutic target. Nat. Rev. Cancer, 3 46-54, 2003.60. Olie，R. A.，Simoes-Wust，A. P.，Baumann, B.，Leech，S. H.，F(xiàn)abbro, D.， Stahel，R. A.，禾口Zangemeister_Wittke，U· A novel antisenseoligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis andsensitizes lung cancer cells to chemotherapy. Cancer Res，60 :2805_2809，2000.61. Andersen, M. H.禾口 thor Straten, P. Survivin—a universal tumorantigen. Histol.Histopathol.，17 :669_675，2002.62. Andersen，Μ. H.，Pedersen，L 0.，Capeler，B.，Brocker，E. B.，Becker，J. C.， 禾口 thor， S.P.Spontaneous cytotoxic T-cell responses againstsurvivin-derived MHC class I-restricted T-cell epitopes in situ as well as exvivo in cancer patients. Cancer Res，61 :5964_5968，2001.63. Currier，J. R.，Kuta，E. G.，Turk，E.，Earhart, L. B.，Loomis-Price，L.， Janetzki，S.，F(xiàn)errari，G.，Birx，D. L，禾口 Cox，J. H. A panel of MHC class Irestricted viral peptides for use as a quality control for vaccine trialELISPOT assays. J. Immunol. Methods,260 :157-172，2002.64. Elvin，J.，Potter，C.，Elliott，T.，Cerundolo，V.，禾口 Townsend，A. Amethod to quantify binding of unlabeled peptides to class I MHC moleculesand detect their allele specificity. J Immunol Methods，158 :161_171，1993·65. Ruppert, J. ，Sidney, J. ，Celis，E.，Kubo, R. Τ.，Grey, H. Μ.，禾口 Sette， A. Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding toHLA-A2. 1 molecules. Cell，74 :929_937，1993.66. thor Straten，P.，Barfoed，A.，Seremet，Τ.，Saeterdal，I.，Zeuthen，J.， 禾口 Guldberg，P·Detection and characterization of alpha-beta-T-cell clonalityby denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) · Biotechniques，25 :244_250，1998·67. Rammensee, H.，Bachmann, J.，Emmerich, N. P.，Bachor, 0. Α.，禾口 Stevanovic， S. SYFPEITHI :database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics，50 213-219，1999.68. Schrama, D.，Pedersen Ls, L 0.，Keikavoussi，P.，Andersen，Μ. H.，Straten, P. P.，Brocker, Ε. B.，Kampgen, Ε.，禾口 Becker，J. C. Aggregationof antigen-specific Tcells at the inoculation site of mature dendritic cells. J. Invest Dermatol. ,119 1443-1448,2002.69. Mahotka，C.，Wenzel, M.，Springer，E.，Gabbert，H. E.，禾口 Gerharz， C.D.Survivin-deltaEx3 and survivin-2B two hovel splice variants of theapoptosis inhibitor survivin with different antiapoptotic properties. CancerRes. ，59 :6097_6102，1999.70. Hicklin， D. J. ， Marincola， F. M.，禾口 Ferrone， S. HLA class I antigendownregulation in human cancers T_cel1 immunotherapy revives an oldstory. MolnMedbToday，5 :178-186，1999.71. Seliger, B.，Cabrera，T.，Garrido，F(xiàn).， 禾口 Ferrone，S. HLA class I antigenabnormalities and immune escape by malignant cells. Semin. Cancer Biol., 12 :3-13，2002.72. Sette，A.，Vitiello，A. ,Reherman ,B. ,Fowler, P.，Nayersina，R. ,Kast ,W. M.， Melief, C. J.，Oseroff, C.，Yuan，L，Ruppert, J.，and. The relationshipbetween class I binding affinity and immunogenicity of potentialcytotoxic T cell epitopes. J. Immunol.，153 :5586_5592，1994.7 3 . Moudgil，K. D. and Sercarz，E. E. Can antitumor immune responsesdiscriminate between self and nonself ？ Immunol. Today, 15 :353_355， 1994.74. Parkhurst, M. R.，Salgaller, Μ. L.，Southwood，S.，Robbins，P. F.，Sette， Α.，Rosenberg，S. Α.，禾口 Kawakami，Y. Improved induction ofmelanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gaplOOmodified at HLA—A * 0201_binding residues. J. Immunol.，157 :2539_2548，1996.75. Guichard, G.，Zerbib，Α.，Le Gal，F(xiàn). Α.，Hoebeke, J.，Connan, F.，Choppin, J.，Briand, J. P.，禾口 Guillet，J. G. Melanoma peptide MART-I(27-35)analogues with enhanced binding capacity to the human class !histocompatibility molecule HLA-A2 by introduction of a beta—amino acidresidue amplications for recognition by tumor—infiltrating lymphocytes. J. Med. Chem.，43 :3803_3808，2000.76. Clay, Τ. Μ.，Custer，Μ. C.，McKee，Μ. D.，Parkhurst, Μ.，Robbins, P. F.， Kerstann，K.，Wunderlich，J.，Rosenberg，S. A.，禾口 Nishimura，Μ· I. Changes in the fine specificity of gplOO (209-217)-reactive T cells inpatients following vaccination with a peptide modified at an HLA-A2. Ianchor residue.). Immunol.，162 :1749_1755， 1999.77. Melief，C. J.，van der Burg, S. H.，Toes，R. Ε.，Ossendorp，F(xiàn).，禾口 Offringa， R.Effective therapeutic anticancer vaccines based on precisionguiding of cytolytic T lymphocytes. Immunol. Rev. ,188 177-182,2002.78. Jager, E.，Ringhoffer, Μ.，Altmannsberger，Μ.，Arand, Μ.，Karbach, J.， Jager，D.，Oesch, F.， 禾口 Knuth，A. Immunoselection in vivo independentloss of MHC class I and melanocyte differentiation antigen expression inmetastaticmelanoma. Int. J. Cancer，71 142-147，1997.79. Thurner，B.，Handle，I.，Roder, C.，Dieckmann，D.，Keikavoussi，P.， Jonuleit，H.，Bender，Α.，Maczek，C.，Schreiner, D.，von den, D. P.，Brocker, Ε. B.， Steinman，R. Μ.，Enk，Α.，Kampgen, Ε.， 禾口 Schuler，G. Vaccinationwith mage_3Al peptide-pulsed mature， monocyte-derived dendritic eellsexpands specific cytotoxic T cells and induces regression of somemetastases in advanced stage IS melanoma. J. Exp. Med.，190 :1669—1678，1999.80. Yee，C.，Thompson，J. A.，Roche，P.，Byrd，D. R.，Lee, P. P.，Piepkorn, Μ.， Kenyon, K.，Davis, Μ. Μ.，Riddell，S. R.，禾口 Greenberg，P. D. Melanocyte destruction after antigen-specific immunotherapy ofmelanoma direct evidence of t cell-mediated vitiligo. J. Exp. Med.，192 :1637_1644，2000.81. Simon, R. Μ. ， Steinberg, S. Μ. ， Hamilton, Μ. ， Hildesheim, Α. ， Khleif， S.， Kwak, L. W.，Mackall, C. L，Schlom, J.，Topalian, S. L，禾口 Berzofsky，J. A. Clinical trial designs for the early clinical development of therapeuticcancer vaccines. J. Clin. Oncol.，19 :1848_1854，2001.
權(quán)利要求
衍生自存活蛋白的MHC I類限制性表位肽，所述表位具有至少一種下列特征(i)能夠以一定親和力結(jié)合限制該表位的I類HLA分子，其中所述親和力使用HLA穩(wěn)定化測定法測定以能夠半數(shù)最大回收I類HLA分子的肽量(C50值)表示最多為50μM，(ii)能夠以每104個PBLs至少1個的頻率引發(fā)癌癥患者的PBL群體中的產(chǎn)生INF γ的細(xì)胞，所述頻率可以通過ELISPOT試驗確定，和/或(iii)能夠原位檢測腫瘤組織中與所述表位肽起反應(yīng)的CTLs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，所述肽具有選自SEQID NO 36,SEQ IDNO :6_8、18_20、22_27、 29-52,54-62 和 66-71 的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，所述肽具有選自CPTENEPDL(SEQ IDNO 6)、EPDLAQCFF (SEQ ID NO 7)、CPTENEPDY(SEQ ID NO 8)、EPDLAQCFY(SEQ ID NO 9)、LPPAffQPFL(SEQ ID NO 18)、QPFLKDHRI (SEQ ID NO 19)、QFEELTLGEF (SEQ ID NO 27)、QTEELTLGEF (SEQ ID NO 34)、FTELTLGEF(SEQ ID NO :36)、FSELTLGEF(SEQ ID NO :37)、MAEAGFIHY(SEQ ID NO :38)、 PTENEPDLAY (SEQ ID NO :39)、ELTLGEFLK (SEQ ID NO :43)、KIAKETNNK (SEQ ID NO :44)、 KIAKETNNKK (SEQ ID NO 51), TLPPAffQPK (SEQ ID NO :54)、LLQCFFCFK (SEQ ID NO :56)、 RISTFKNWPK(SEQ ID NO :58)、ILKETNNKKK(SEQ ID NO :59)、TIRRKNLRK(SEQ ID NO :60)、 LAQCFFCFK (SEQ ID NO :42)，DLAQCFFCFK (SEQ ID NO 47)的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項的肽，所述肽具有SEQID N0:36所示的肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項的肽，其具有最多為30μΜ的C5tl值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項的肽，其具有最多為20μΜ的C5tl值。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，其含有至多20個氨基酸殘基。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，其含有至多12個氨基酸殘基。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，其含有至多10個氨基酸殘基。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，該肽為九肽或十肽。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，該肽為哺乳動物物種的存活蛋白的天然序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的肽，其衍生自人存活蛋白。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，該肽通過替換、缺失或添加至少一個氨基酸殘基 而衍生自存活蛋白的天然序列。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，其能夠以每IO4個PBLs至少10個的頻率在癌癥 患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，該肽能夠在患有表達(dá)存活蛋白的癌癥疾病患者 的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求7的肽，其中癌癥疾病選自包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和慢性髓性 白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺 癌。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任意一項的肽，該肽能夠在患有癌癥疾病的患者的PBL群體中 引發(fā)產(chǎn)生INF-Y的細(xì)胞，所述產(chǎn)生INF-Y的細(xì)胞具有針對癌細(xì)胞系的存活蛋白表達(dá)細(xì)胞 的細(xì)胞毒性效應(yīng)，所述癌細(xì)胞系包括選自乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和黑素瘤細(xì)胞系FM3的細(xì)胞 系。
18.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-17任意一項的肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，所述藥物組合物包含兩種或多種衍生自存活蛋白 的MHC I類限制性表位肽，每種表位肽與不同的HLA分子特異相互作用并且具有至少一種 下列特征(i)能夠以一定親和力結(jié)合限制該表位的I類HLA分子，其中所述親和力使用HLA穩(wěn)定 化測定法測定以能夠半數(shù)最大回收I類HLA分子的肽量(C5tl值)表示最多為50 μ Μ,(ii)能夠以每IO4個PBLs至少1個的頻率引發(fā)癌癥患者的PBL群體中的產(chǎn)生INF-γ 的細(xì)胞，所述頻率可以通過ELISP0T試驗確定，和/或(iii)能夠原位檢測腫瘤組織中與所述表位肽起反應(yīng)的CTLs。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其中每種表位肽與MHCI類HLA-A分子、MHC I類 HLA-B分子或MHC I類HLA-C分子特異相互作用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，其中所述MHCI類HLA-A分子包括HLA-Al、 HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-AlO, HLA-AlU HLA-Awl9, HLA-A23 (9)、HLA-A24 (9)、 HLA-A25 (10)、HLA-A26 (10)，、HLA-A28、HLA-A29 (wl9)、HLA-A30 (wl9)、HLA-A31 (wl9)、 HLA-A32 (wl9)、HLA_Aw33 (wl9)、HLA_Aw34 (10)、HLA_Aw36、HLA_Aw43、HLA_Aw66 (10)、 HLA-Aw68(28)、HLA—A69(28)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21任一項的藥物組合物，其中所述MHCI類HLA-B分子包括 下面的任一種HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14, HLA-Bl5, HLA-B16, HLA-Bl7, HLA-B18, HLA-B21、HLA_Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、 HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA_Bw46 和 HLA_Bw47。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22任一項的藥物組合物，其中所述MHCI類HLA-C分子包括下面 的任一種HLA-Cw 1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA_Cw5、HLA_Cw6、HLA_Cw7 和 HLA_Cwl6。
24.根據(jù)權(quán)利要求18-23任一項的藥物組合物，其中所述兩種或多種衍生自存活蛋白 的MHC I 類限制性表位肽具有選自:SEQ ID NO 36、SEQID NOs 1-10、12_20、22-27、29_52、 54-62和66-71的序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的藥物組合物，其中所述兩種或多種衍生自存活蛋白的MHC I 類限制性表位肽具有選自:FLKLDRERA (SEQ ID NO 1)、TLPPAffQPFL (SEQ ID NO :2)、 ELTLGEFLKL(SEQ ID NO :3)、LLLGEFLKL (SEQ ID NO :4)、LMLGEFLKL (SEQ ID NO :5)、 LTLGEFLKL (SEQ ID NO 10), LPPAffQPFL (SEQ ID NO 18)、CPTENEPDL (SEQ ID NO :6)、 EPDLAQCFF(SEQ ID NO :7)、CPTENEPDY (SEQ ID NO :8)、EPDLAQCFY (SEQ ID NO :9)、 QFEELTLGEF (SEQ ID NO :27)、QTEELTLGEF (SEQ ID NO :34)、FTELTLGEF (SEQ ID NO :36)、 FSELTLGEF (SEQ ID NO :37)、MAEAGFIHY (SEQ ID NO :38)、PTENEPDLAY (SEQ ID NO :39)、 ELTLGEFLK(SEQ ID NO :43)、KIAKETNNK (SEQ ID NO :44)、KIAKETNNKK(SEQ ID NO :51)、 TLPPAffQPK (SEQ ID NO :54)、LLQCFFCFK (SEQ ID NO :56)、RISTFKNWPK (SEQ ID NO :58)、 ILKETNNKKK(SEQ ID NO :59)、TIRRKNLRK(SEQ ID NO :60)、LAQCFFCFK(SEQ ID NO :42)、 DLAQCFFCFK(SEQ ID NO 47) ,LPPAffQPFL(SEQ ID NO :18)、QPFLKDHRI (SEQ ID NO 19)的序 列。
26.根據(jù)權(quán)利要求18-25任一項的藥物組合物，其還含有免疫原性蛋白質(zhì)或者肽片段， 所述蛋白質(zhì)或肽片段選自不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)或者肽片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)或肽片段是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)或其肽片段。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的藥物組合物，其中所述不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家 族的蛋白質(zhì)或其肽片段是Bcl-2或其肽片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求26或27的藥物組合物，其中所述不屬于或衍生自存活蛋白蛋白質(zhì)家 族的蛋白質(zhì)或其肽片段是IAP蛋白質(zhì)家族成員或其肽片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述IAP蛋白質(zhì)家族成員是ML-IAP。
31.根據(jù)權(quán)利要求26、27、29和30任一項的藥物組合物，其中所述不屬于或衍生自存 活蛋白蛋白質(zhì)家族的蛋白質(zhì)或其肽片段選自SEQ IDNO 75,SEQ ID NO 76、SEQ ID NO :77、 SEQ ID NO78,SEQ ID NO 79,SEQ ID NO80,SEQ ID N0:81、SEQ ID NO 82,SEQ ID NO: 83、SEQ IDNO :84、SEQ ID NO :85。
32.根據(jù)權(quán)利要求18-31任一項的藥物組合物，其包含HLAI類和HLAII類限制性表位。
33.根據(jù)權(quán)利要求18-32任一項的藥物組合物，其包含佐劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求18-32任一項的藥物組合物，其是用于先體外后體內(nèi)或原位診斷 PBLs中或腫瘤組織中存活蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的存在的組合物。
35.多表位疫苗，其包含權(quán)利要求1-17任一項的肽。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的多表位疫苗，其包括依賴于給定患者的組織類型的存活蛋白衍 生的肽表位的組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36的多表位疫苗，其中疫苗能夠引發(fā)針對其中表達(dá)存活蛋白的 癌癥疾病的免疫反應(yīng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的多表位疫苗，其中癌癥疾病選自包括慢性淋巴細(xì)胞性白血病和 慢性髓性白血病的造血惡性腫瘤、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和 前列腺癌。
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38任一項的多表位疫苗，其中疫苗在接種的受試者中引發(fā)產(chǎn)生 具有針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞。
40.權(quán)利要求1-17中任意一項所定義的肽用于制備藥物的用途，所述藥物與常規(guī)癌癥 治療如放射療法或化學(xué)療法組合用于治療癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生自腫瘤相關(guān)抗原存活蛋白的MHC I類限制性肽，此肽能夠以高親和力結(jié)合I類HLA分子，能夠在癌癥患者的PBL群體中引發(fā)產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞，并且能夠原位檢測腫瘤組織中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，還涉及含有所述肽的治療和診斷組合物和其用途。
文檔編號A61K38/00GK101906148SQ20101011956
公開日2010年12月8日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者E·P·T·施特拉騰, M·H·安諾生 申請人:蘇瓦克有限公司