專利名稱：核糖核酸酶和青蒿素的聯用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療領域，尤其涉及核糖核酸酶和青蒿素的聯用。
背景技術：
Onconase是北方豹蛙(Rana pipiens)卵或早期胚胎中的一種核糖核酸酶。它由 104個氨基酸殘基構成，分子量約12，000道爾頓。它是RNase A(牛胰核糖核酸酶A)超家族的一員，其一級結構與RNase A有30%相同，它們的三級結構也頗為相似。Onconase可以抑制多種腫瘤的生長。Onconase雖然是蛋白質藥物，但免疫原性很低，在臨床上可以應用多個療程。它的副反應不大，且具有抗多重耐藥性的能力。青蒿素(Artemisinin)是中國科學家發(fā)現和開發(fā)的一種新的抗瘧疾藥。鑒于傳統(tǒng)的奎寧類藥物普遍遇到抗藥性問題，青蒿素和它的衍生物目前已取代它們成為世界上抗瘧疾的主流藥物。青蒿素是從我國藥用植物黃花蒿的葉中提取的一種倍半烯萜內酯化合物。它的大環(huán)上有一個內過氧化物橋，在亞鐵離子或亞鐵血紅素的催化下，會放出以碳為中心的自由基。細胞內的蛋白質和核酸被這些自由基烷化后，細胞可能死亡。瘧原蟲寄生在紅血球內，含有大量來自血紅蛋白的亞鐵血紅素，因而青蒿素很易被活化，進而將瘧原蟲殺死。青蒿素和它的衍生物，如二氫青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚及青蒿琥酯等已廣泛應用于瘧疾治療。更多的青蒿素衍生物正在研制中。近年來，國內外科學家相繼發(fā)現，青蒿素也能抗癌。 青蒿素和它的衍生物呈現廣譜的抗癌效應。將這兩類獨特的藥物，核糖核酸酶和青蒿素衍生物結合起來治療腫瘤，會產生怎樣的效果呢，卻是本領域未知，但卻迫切需要了解的。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供核糖核酸酶和青蒿素及其衍生物聯用抗腫瘤的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種藥盒，所述藥盒包括—含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑；一含有核糖核酸酶的制劑；和一說明書。所述藥盒中所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑選自片劑、膠囊、栓劑、或靜脈注射液；所述的含有核糖核酸酶的制劑是靜脈注射液。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種體外非治療性抑制腫瘤細胞生長的方法，所述的方法包括步驟(1)將腫瘤細胞(每孔2000-4000個細胞，優(yōu)選每孔2500-3500個細胞，更優(yōu)選每孔3000個細胞)和核糖核酸酶混合培養(yǎng)20-30小時；(2)加入青蒿素或青蒿素衍生物繼續(xù)培養(yǎng)20-50小時；和(3)用MTT法測定細胞毒性；以腫瘤細胞和核糖核酸酶的混合物的總體積計，核糖核酸酶濃度為0. 12-0. 6 μ mol/L;以腫瘤細胞、核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物的混合物的總體積計，青蒿素或青蒿素衍生物的濃度為2-10 μ mol/L。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種試驗性的腫瘤的治療方法，所述的方法包括步驟(a)先給皮下接種腫瘤的裸鼠靜脈注射含有核糖核酸酶的制劑，如用Onconase， 劑量為 0. 5-5mg/kg ；(b)步驟(a)的20-30小時后，給所述腫瘤患者施用含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑，如用DHA，劑量為5-50mg/kg ；(c)步驟(b)的40-60小時后，重復步驟(a)；和(d)步驟(c)的20-30小時后，重復步驟(b)。所述治療方法中，所述的含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑選自片劑、膠囊、栓劑、或靜脈注射液；所述的含有核糖核酸酶的制劑是靜脈注射液。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種使核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物合用充分發(fā)揮藥效的方法，所述的方法包括步驟在使用有效劑量核糖核酸酶20-30小時后再使用有效劑量青蒿素或青蒿素衍生物。據此，本發(fā)明顯示核糖核酸酶和青蒿素衍生物聯合治療腫瘤具有顯著的協同效應。兩藥均為低毒，低免疫原性和廣譜的抗癌藥物。兩藥合用增強了它們的抗癌能力，并進一步降低了它們的副反應，是一種非常有前途的新的腫瘤治療方式。


圖1顯示了 Onc與DHA對于惡性間皮細胞瘤MST0-211H的聯合抗腫瘤效應；其中 a是“蛋白濃度-細胞存活率”曲線；b是Onc和DHA對每孔3000個MST0-211H腫瘤細胞聯用72小時的等效應分析情況。圖2顯示了 Onc與DHA協同給藥可以顯著降低MST0-211H荷瘤裸小鼠腫瘤體積； 其中(a)和(b)是給藥后腫瘤體積抑制情況以及相應時間的小鼠體重變化。圖3顯示了荷瘤裸小鼠血液生化指標分析結果；其中a是柱狀圖，生理鹽水組 (Saline, η = 6)，One 給藥組(One = 1. 5mg/kg, η = 5)，聯合給藥組(Oncl. 5mg/kg+DHA 20mg/kg，η = 5)，DHA給藥組(DHA = 20mg/kg, η = 5)；各指標Y軸的單位分別為 CRE-μmol/L ；BUN-mmol/L ；TP-g/L ；GL0B-g/L ；T-BIL-μ mol/L；ALT-U/L ；AST-U/L ；ALB-g/ L ；b是各個指標對應中文名稱。
具體實施例方式發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，發(fā)現核糖核酸酶和青蒿素或其衍生物聯合使用抗腫瘤，無論體內還是體外，都可以產生明顯的協同效應。具體地是豹蛙卵核糖核酸酶和雙氫青蒿素，并且豹蛙卵核糖核酸酶必須先于雙氫青蒿素使用。在此基礎上，完成了本發(fā)明。如本文所用，“核糖核酸酶”是指一種具有細胞毒性的核糖核酸酶，包括豹蛙卵核糖核酸酶(Onconase，One或Ranpirnase)、牛蛙或林蛙的RNases，牛精管RNase，人嗜曙紅細胞衍生的神經毒素等以及由基因工程改造過的牛胰或人胰RNases等；優(yōu)選One。
所述的豹蛙卵核糖核酸酶是一種對于抑制腫瘤細胞有用的酶，其可在胞漿內選擇性地降解tRNA，抑制蛋白合成進而抑制細胞增殖和引起細胞凋亡。在本發(fā)明中，所用的豹蛙卵核糖核酸酶可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動物。此外，所述的豹蛙卵核糖核酸酶也可以是人工制備的，比如可以根據常規(guī)的基因工程重組技術來生產重組蛙卵核糖核酸酶。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的豹蛙卵核糖核酸酶。任何適合的豹蛙卵核糖核酸酶均可用于本發(fā)明。所述的豹蛙卵核糖核酸酶包括全長的豹蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列可以與SEQ ID NO 4所示的序列基本上相同。經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的豹蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。豹蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領域的公知的技術，所述技術可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版， 1987, TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。任何一種豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段都可以應用到本發(fā)明中。在這里，豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的豹蛙卵核糖核酸酶的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長蛙卵核糖核酸酶的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長豹蛙卵核糖核酸酶的 60%,70%,80%,90%,95%,99% ^ 100% 的活性。本發(fā)明也可采用經修飾或改良的豹蛙卵核糖核酸酶，比如，可采用為了延長其半衰期、改善其穩(wěn)定性或增強其殺傷腫瘤細胞能力而加以修飾或改良的豹蛙卵核糖核酸酶。 所述經過修飾或改良的豹蛙卵核糖核酸酶或者基因可以是與天然存在的豹蛙卵核糖核酸酶或基因雖然具有一定的不同點，但也能殺傷腫瘤細胞，且不會帶來其它不良影響或毒性。 也就是說，任何不影響豹蛙卵核糖核酸酶的生物活性或者說是基因的生物功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的一個實例，所述的豹蛙卵核糖核酸酶是重組表達的，所述的豹蛙卵核糖核酸酶的編碼基因全長3Mbp，編碼104個AA的一個多肽，該基因如SEQ ID NO 3所示，其編碼的蛋白如SEQ ID N0:4所示。所述的蛙卵核糖核酸酶可通過常規(guī)的基因工程方法生產，一般來說有以下步驟(1)用含有豹蛙卵核糖核酸酶編碼基因的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。如本文所用，“青蒿素或其衍生物”包括雙氫青蒿素(DHA)、青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫蒿甲醚、蒿乙醚等；優(yōu)選DHA。以下是本領域幾種已知的青蒿素和青蒿素衍生物的化學式
權利要求
1.一種藥盒，其特征在于，所述藥盒包括一含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑；一含有核糖核酸酶的制劑；和一說明書。
2.如權利要求1所述的藥盒，其特征在于，所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑選自片劑、膠囊、栓劑、或靜脈注射液；所述含有核糖核酸酶的制劑是靜脈注射液。
3.—種體外非治療性抑制腫瘤細胞生長的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將腫瘤細胞(每孔2000-4000個細胞，優(yōu)選每孔2500-3500個細胞，更優(yōu)選每孔 3000個細胞)和核糖核酸酶混合培養(yǎng)20-30小時；(2)加入青蒿素或青蒿素衍生物繼續(xù)培養(yǎng)20-50小時；和(3)用MTT法測定細胞毒性；以腫瘤細胞和核糖核酸酶的混合物的總體積計，核糖核酸酶濃度為0. 12-0. 6 μ mol/L ； 以腫瘤細胞、核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物的混合物的總體積計，青蒿素或青蒿素衍生物的濃度為2-10 μ mol/L。
4.一種試驗性的腫瘤的治療方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)先給皮下接種腫瘤的裸鼠靜脈注射含有核糖核酸酶的制劑，如用Onconase，劑量為 0. 5-5mg/kg ；(b)步驟(a)的20-30小時后，給所述腫瘤患者施用含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑，如用DHA，劑量為5-50mg/kg ；(c)步驟(b)的40-60小時后，重復步驟(a)；和(d)步驟(c)的20-30小時后，重復步驟(b)。
5.如權利要求4所述的治療方法，其特征在于，所述含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑選自片劑、膠囊、栓劑、或靜脈注射液；所述含有核糖核酸酶的制劑是靜脈注射液。
6.一種使核糖核酸酶和青蒿素或青蒿素衍生物合用充分發(fā)揮藥效的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟在使用有效劑量核糖核酸酶20-30小時后再使用有效劑量青蒿素或青蒿素衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了有關核糖核酸酶和青蒿素的聯用的技術內容。本發(fā)明公開了一種藥盒，所述藥盒包括一含有青蒿素或青蒿素衍生物的制劑；一含有核糖核酸酶的制劑；和一說明書。
文檔編號A61K38/46GK102188698SQ20101011961
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權日2010年3月8日
發(fā)明者李俊, 沈如凌, 王慶誠, 王鑄鋼, 費儉 申請人:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司