專利名稱：一種具抑菌活性的中華絨螯蟹乳清酸蛋白的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中華絨螯蟹乳清酸蛋白(Es-WAP)基因的體外重組表達(dá)技術(shù)及其功能 鑒定。本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了中華絨螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP，該重組蛋白對(duì) 畢赤酵母GSl 15，平滑假絲酵母和鰻弧菌具有抗菌作用，在開(kāi)發(fā)抗菌類藥物和飼料添加劑等 方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
生物的免疫機(jī)制可分為兩大類，固有免疫和獲得性免疫。無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏獲得性 免疫機(jī)制只能依靠固有免疫來(lái)抵御病害侵害。近年來(lái)在動(dòng)物的乳清中發(fā)現(xiàn)一種乳清酸蛋 白，它具有一個(gè)或多個(gè)乳清酸蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域，該蛋白具有蛋白酶抑制活性，抗菌活性， ATP酶抑制活性以及細(xì)胞增殖調(diào)控等重要生物學(xué)作用。在對(duì)蝦，中華絨螯蟹等甲殼動(dòng)物中 已報(bào)道多種單一 WAP結(jié)構(gòu)域殼質(zhì)素抗菌肽，具有抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的活 性，目前在無(wú)脊椎動(dòng)物凡納濱對(duì)蝦中首次發(fā)現(xiàn)兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域蛋白，具有蛋白酶抑制活性。2008年全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量為5170萬(wàn)噸，產(chǎn)值788億美元，其中甲殼類養(yǎng)殖產(chǎn) 量為450萬(wàn)噸，產(chǎn)值143. 61億美元。中華絨鰲蟹(Eriocheir sinensis)屬于甲殼動(dòng)物，是 我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。然而，與其它甲殼類養(yǎng)殖品種一樣，病害發(fā)生日益頻繁，尤 其是病毒、細(xì)菌、真菌等微生物引起的傳染性疾病，每年均造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙 了甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前，蟹病防治主要是采用抗生素藥物防治，但長(zhǎng)期盲目濫用藥 物，造成抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，非但難以有效地控制病情，反而帶來(lái)資金的浪費(fèi)，蟹品質(zhì)的 下降，環(huán)境污染及對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅等不良后果。因此，開(kāi)展中華絨螯蟹免疫機(jī)制研 究，為蟹病的防治尋找更科學(xué)有效的途徑，以期通過(guò)蟹自身免疫抵抗力的提高來(lái)防止和減 少蟹病的發(fā)生，具有十分重要的理論與實(shí)踐意義。中華絨螯蟹乳清酸蛋白的編碼區(qū)有一個(gè) 22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明中華絨螯蟹乳清酸蛋白是一種分泌蛋白，可 能在蟹免疫防御中發(fā)揮著非常重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增乳清酸蛋白成熟肽編碼區(qū)基因片段進(jìn)行了原核重 組表達(dá)。為確認(rèn)其蛋白功能，深入研究重組蛋白(rEs-WAP)對(duì)畢赤酵母GS115，平滑假絲酵 母和鰻弧菌的抑菌能力，為抗菌藥物的篩選提供指導(dǎo)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是采用技術(shù)PCR擴(kuò)增含兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域 的編碼區(qū)基因片段，將其克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體中，獲得重組載體pET-32a(+)-WAP， 隨后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞BL21(DE3)Plys中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表達(dá)。經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠純化獲得 EsWAP重組蛋白，透析復(fù)性后，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?22yg mL—1時(shí)，對(duì)畢赤酵母GS115，平滑假絲 酵母有顯著的抑菌作用，對(duì)鰻弧菌的生長(zhǎng)有極顯著的抑菌作用(附圖1所示)，蛋白濃度 經(jīng)梯度吸收后，重組蛋白對(duì)畢赤酵母GS115、平滑假絲酵母、鰻弧菌的最小抑菌濃度分別為 7. 0μ g mr\27. 8μ g mr\55. 5μ g mL_1 (附圖 2 所示)


圖1. 222 μ g mL-lEs-WAP重組蛋白產(chǎn)物的抑菌活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖2.不同濃度梯度的Es-WAP重組蛋白對(duì)畢赤酵母GS115的抑菌效果 圖3.不同濃度梯度的Es-WAP重組蛋白對(duì)平滑肌假絲酵母的抑菌效果
圖4.不同濃度梯度的Es-WAP重組蛋白對(duì)鰻弧菌的抑菌效果
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明的中華絨螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP基因編碼區(qū)體外原核重組表達(dá)，包括下 列步驟1、重組載體的構(gòu)建本發(fā)明中采用的重組載體為Novagen公司的pET32a(+)原核表達(dá)載體。通過(guò)PCR 技術(shù)，使用5’末端分別添加了 EcoR I和XohI特定酶切位點(diǎn)的基因特異性引物Pl (5’-GAA TTCCTGGGGAAGGGGCATGGACACGGGT-3，)和 P2(5，-CTCGAGGAATGGCTTAGTGCACTGGT-3，)擴(kuò)增 中華絨螯蟹乳清酸蛋白(Gene bank登陸號(hào)GU002539)Es-WAP基因含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū) 片段。反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，68°C退火 30秒，72°C延伸30秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收，與 PMD18-T載體連接。轉(zhuǎn)化后菌落PCR篩選并測(cè)序，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；使用EcoRI和XohI雙 酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對(duì)酶切產(chǎn)生的目的片 段純化回收；回收目的片段與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-32a連接，完成載體的構(gòu)建。2、重組蛋白的表達(dá)本研究中使用的重組表達(dá)菌株為BL21(DE3)_plysS。使用構(gòu)建好的重組載體和 空載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌，并篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序確認(rèn)表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種于 50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12-16小時(shí)，然后以1 100的比例接種200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至ODGOO = 0. 5-0. 7。加入IPTG，使終濃度達(dá)到Immol/mL，繼 續(xù)培養(yǎng)4h。 4°C，5000rpm，離心lOmin，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取Iml菌液離心， 棄去上清后，加入80 μ L水和20 μ L 5Χ蛋白上樣緩沖液，100°C沸水煮沸10分鐘，稍離心， SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。3、重組蛋白的純化與復(fù)性本發(fā)明采用鎳瓊脂糖凝膠FF純化獲得了變性重組蛋白，用透析緩沖液透析復(fù)性。用具體操作步驟如下鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白(1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1.6 X 20cm，柱床體積為IOml(2)用緩沖液 1 (1. 14g L-lNaH2P04,14. 5g L_1Na2HP04, 29. 3g L^1NaCL, 480g L-1 尿 素平衡2-5個(gè)床體積，流速為2mL miiT1(3)將 20ml 細(xì)胞破碎液(50mM PBS, ρΗ7· 4,0. 5Μ NaCl)0. 45 μ m 濾膜過(guò)濾，上樣， 流速為ImL miiT1(4)用緩沖液1再洗2-5個(gè)床體積，流速為mL mirT1
(5)用分別含10、20、50、100、200、300、4001111咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速 為2mL mirT1，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的分子量大小和純度(6)用純水流洗5個(gè)柱床體積，再用20 %的乙醇流洗3個(gè)柱床體積，流速為2mL mirT1，柱子置于4°C環(huán)境中保存變性狀態(tài)下提純的重組蛋白需要在適當(dāng)?shù)膹?fù)性緩沖液中通 過(guò)透析除去尿素，使蛋白重新正確折疊，恢復(fù)正確構(gòu)象。變性純化產(chǎn)物經(jīng)2mM的還原谷胱甘 肽、0. 2mM 氧化谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris-HClUOOmM NaCl、10%甘油、1 %甘氨酸及梯 度降低的尿素透析復(fù)性，尿素濃度從起始的6M逐漸替換到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至 無(wú)尿素的透析液時(shí)不加甘油。每次在4°C透析12h。TRX蛋白的純化和復(fù)性同上。實(shí)施實(shí)例2 重組蛋白的抑菌活性分析對(duì)畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)、平滑假絲酵母菌(Candida parapsilosis)、鰻弧菌(Listonella anguillarum)的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)畢赤酵母，平滑假 絲酵母菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，鰻弧菌接種到2216E培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)至OD值= 0. 5-0. 6，用Tris-HCl稀釋OD值至0. 001，進(jìn)行抑菌活性分析。取50 μ L稀釋后的菌液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后加100 μ L的重組蛋白，空 白組加50 μ L TriS-HCl (ρΗ7. 4)，對(duì)照組加50 μ L的TRX蛋白，28°C孵育3小時(shí)，然后加 50 μ L相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，孵育24小時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)表明，空白組和對(duì)照組 對(duì)畢赤酵母GS115，平滑假絲酵母和鰻弧菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，Es-WAP蛋白對(duì)畢赤酵母 GS115，平滑假絲酵母有顯著的抑制作用，對(duì)一些革蘭氏陰性菌鰻弧菌也具有極顯著的抗菌 作用(附圖1)。重組蛋白對(duì)畢赤酵母GS115、平滑假絲酵母、鰻弧菌的最小抑菌濃度分別為 7. 0μ g ι Γ\27. 8μ g ι Γ\55. 5μ g mL_1 (附圖 2)。
權(quán)利要求
一種中華絨螯蟹乳清酸蛋白Es WAP，其特征在于含有序列表SEQID NO.1中氨基酸序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華絨螯蟹乳清酸蛋白rEs-WAP的制備方法，其特征在 于(1)將帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物Pl和P2對(duì)中華絨螯蟹WAP基因編碼區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò) 增；(2)將pET32a載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XohI雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化，測(cè)序鑒定重 組子；(3)轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3) plysS進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，超聲波破碎處理菌體收獲重組蛋 白，經(jīng)鎳柱純化，透析復(fù)性后得到具有活性的乳清酸蛋白重組蛋白rEs-WAP。
3.—種權(quán)利要求1所述的中華絨螯蟹乳清酸蛋白rEs-WAP的應(yīng)用。其特征在于中華 絨螯蟹乳清酸蛋白rEs-WAP基因的重組產(chǎn)物可作為抗菌類藥物治療真菌和細(xì)菌感染，或用 于飼料添加劑的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，中華絨螯蟹乳清酸蛋白(Es-WAP)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的體外重組表達(dá)技術(shù)及其功能鑒定。本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了中華絨螯蟹乳清酸蛋白rEs-WAP蛋白，還公開(kāi)了所述中華絨螯蟹乳清酸蛋白兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組蛋白在抗菌活性的應(yīng)用。利用本發(fā)明獲得重組蛋白可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存和藥物開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101955523SQ20101012489
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者宋林生, 李鳳梅, 王玲玲, 邱麗梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所