專利名稱：迷迭香酸-楊梅黃酮藥物配方及其在治療帕金森病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種迷迭香酸-楊梅黃酮藥物配方及其在治療帕金森病中的應(yīng)用，尤
其是涉及迷迭香酸-楊梅黃酮復(fù)合制劑藥物配方及其在治療帕金森病中對(duì)多巴胺能神經(jīng) 元起神經(jīng)保護(hù)作用的應(yīng)用。屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性疾病是困擾現(xiàn)代社會(huì)中老年人群的重大腦疾病，帕金森病(PD)以發(fā) 病率僅次于居首位的老年癡呆病排列第二。無論是從社會(huì)學(xué)角度還是從市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)角度， PD已經(jīng)成為影響我國乃至世界人口健康水平和生活質(zhì)量，阻礙經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展的重大社會(huì)問 題。PD主要病理變化為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失，多巴胺遞質(zhì)含量減少。雖然PD的可能致 病因素很多，但確切機(jī)制還不清楚。更為嚴(yán)重的是，至今尚無成熟有效的藥物或方法能阻止 或逆轉(zhuǎn)PD病情的發(fā)展。目前PD的治療仍以藥物治療為主。左旋多巴——作為治療PD的 經(jīng)典藥物，長(zhǎng)期應(yīng)用后大部分患者會(huì)出現(xiàn)多動(dòng)癥、療效波動(dòng)和開關(guān)現(xiàn)象，其用藥副作用不僅 嚴(yán)重影響病人的生活，而且難以糾治。因此人們一直致力于從分子、細(xì)胞和整體水平上，多 層次、多角度研究PD的發(fā)病機(jī)理，以尋求有效的預(yù)防和治療的藥物及方法。開發(fā)新型的能 夠防治PD及具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物尤其是天然提取物將對(duì)保護(hù)人類健康具有重要的現(xiàn) 實(shí)社會(huì)意義和應(yīng)用經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)是一種水溶性的含多酚羥基的酸，其化學(xué)名稱為 [R(E)] a-[[3-(3，4-二羥基苯基)-l-氧代-2-丙烯基]氧基]-3，4-二羥基苯丙酸。1958 年首次從迷迭香植物中分離提取而得名。迷迭香酸為天然抗氧化劑，有抗氧化、抗炎、免疫 抑制等多種活性。楊梅黃酮(Myricetin)是一種脂溶性的黃酮類植物提取物，其化學(xué)名稱 為3， 5， 7-三羥基-2- (3， 4， 5-三羥基苯基)-4H-1-苯并呋喃_4_酮，具有抗炎、抗腫瘤、抗 突變、預(yù)防齲齒、抗氧化性、消除體內(nèi)自由基等多種藥理活性，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保 健品和化妝品等領(lǐng)域，并可作為添加劑用作治療、預(yù)防關(guān)節(jié)炎和其它各種炎癥。目前迷迭 香酸已有多項(xiàng)相關(guān)專利用于抑制血糖水平升高，預(yù)防、控制或治療糖尿病或肥胖癥；制備治 療或預(yù)防冠心病、心絞痛、腦損傷；治療或預(yù)防急慢性腎功能衰竭；升高白細(xì)胞及血小板等 等；楊梅黃酮已有保健酒的相關(guān)專利。 迷迭香酸和楊梅黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，結(jié)構(gòu)式分別為
3<formula>formula see original document page 4</formula> 迷迭香酸 楊梅黃酮 本發(fā)明人從事迷迭香酸和楊梅黃酮的綜合開發(fā)利用研究，長(zhǎng)期研究和大量試驗(yàn)結(jié) 果表明，作為結(jié)構(gòu)明確的天然植物提取物，迷迭香酸和楊梅黃酮來源豐富，配比使用毒性 低，副作用小，足以其作為藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)。其在PD中是否具有防治作用未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前傳統(tǒng)的抗PD藥物都有一些不良反應(yīng)，嚴(yán)重地限制了 其應(yīng)用和推廣的缺點(diǎn)，旨在提供一種迷迭香酸_楊梅黃酮復(fù)合制劑的藥物配方及其在治療 帕金森病中的應(yīng)用。本發(fā)明人通過長(zhǎng)期研究和大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸與楊梅黃酮復(fù)合制 劑具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，其發(fā)揮作用的濃度無任何毒副作用，故在治療PD和神經(jīng)保護(hù) 方面有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，迷迭香酸與楊梅黃酮復(fù)合制劑作為結(jié)構(gòu)明確的天然植物提 取物，來源豐富，毒性低，具有良好的神經(jīng)保護(hù)及抗氧化應(yīng)激作用，有著巨大的新藥開發(fā)價(jià) 值。 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的迷迭香酸-楊梅黃酮復(fù)合制劑的藥物配方是 迷迭香酸與楊梅黃酮的摩爾濃度配比為10 : 1。迷迭香酸和楊梅黃酮均為天然植物提取 物。迷迭香酸可以從迷迭香植物如紫蘇中提取獲得。 本發(fā)明的迷迭香酸-楊梅黃酮藥物在治療帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于該復(fù)合
制劑用于神經(jīng)保護(hù)，其機(jī)制與抗氧化應(yīng)激有關(guān) 1、10—、q1/L迷迭香酸與10—10 mol/L楊梅黃酮配比使用時(shí)，可以明顯減輕神經(jīng)毒素
6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的MES23. 5多巴胺能細(xì)胞存活率的下降； 2、10—、q1/L迷迭香酸與10—"mol/L楊梅黃酮配比使用時(shí)，可以明顯減輕神經(jīng)毒素
6-0HDA誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的下降和活性氧物質(zhì)的生成，具有抗氧化應(yīng)激作用。 本發(fā)明的迷迭香酸-楊梅黃酮復(fù)合制劑藥物配方在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)迷迭香酸_楊
梅黃酮配比使用能夠保護(hù)MES23. 5多巴胺能細(xì)胞免受神經(jīng)毒素6-0HDA的損傷，其保護(hù)作用
與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。通過迷迭香酸-楊梅黃酮復(fù)合制劑藥物在體外的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)其
發(fā)揮保護(hù)作用的濃度不具有毒性。本發(fā)明對(duì)于開發(fā)成為一種新型的國家I類抗PD天然新
藥具有重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。 實(shí)施例1 :迷迭香酸_楊梅黃酮藥物配方在MES23. 5多巴胺能細(xì)胞上發(fā)揮神經(jīng)保 護(hù)作用實(shí)驗(yàn)
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—、實(shí)驗(yàn)材料
( — )細(xì)胞 MES23. 5多巴胺能細(xì)胞由美國休斯敦貝勒醫(yī)學(xué)院樂衛(wèi)東教授惠贈(zèng)。置371:，5%0)2
培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 (二)藥品及試劑 迷迭香酸由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室李榮貴教授提供(李榮貴，中國專利CN1796362，紫蘇迷迭香酸的生產(chǎn)工藝)，以Dulbecco ' s modification of Eagle' smedium/F12(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基/F12，DMEM/F12)培養(yǎng)液(Gibco公司)溶解后以10—^Ql/L儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋為所需濃度10—9mol/L。楊梅黃酮為Sigma公司產(chǎn)品，以二甲亞砜(DMS0)溶解后以10—^Ql/L儲(chǔ)存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋為所需濃度10—1Qm0l/L。 DMS0，2，7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉0y)CF-DA)，6-0HDA，羅丹明123，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品。
(三)儀器 酶標(biāo)儀R-T-2100C，深圳雷杜公司。超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備工程有限公司。C02培養(yǎng)箱美國熱電公司。倒置生物光學(xué)顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。流式細(xì)胞儀
美國BD Biosciences公司。
二、實(shí)驗(yàn)方法 1、 MTT測(cè)定細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MES23. 5多巴胺能細(xì)胞，吹打制成單細(xì)胞懸液后離心，用完全培養(yǎng)基稀釋成2X 105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，每孔200 Pl接種于96孔板，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁后加入迷迭香酸(10—9mol/L)和楊梅黃酮(10—10mol/L)預(yù)孵育12h后，與6-0HDA(100 y mol/L)共培養(yǎng)24h ;之后每孔加入5mg/ml的MTT 20iU，37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h ;棄上清后每孔加入匿SO 200 yl，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(主波長(zhǎng)573nm，次波長(zhǎng)630nm)，測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算各組MES23. 5多巴胺能細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(陰性對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)。 2、細(xì)胞線粒體跨膜電位的檢測(cè)細(xì)胞按上述處理后加入熒光染料羅丹明123(終濃度為5 ii mol/L) 37。C避光負(fù)載30min ;用N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)緩沖液(20mmol/L HEPES， 150mmol/L NaCl，pH = 7. 4)洗3次后再用lml緩沖液重懸；以激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)523nm測(cè)定，CELLQuest Pro分析系統(tǒng)分析每組細(xì)胞羅丹明123的熒光強(qiáng)度。 3、細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)(R0S)檢測(cè)細(xì)胞按上述處理后加入熒光染料H2DCF_DA(終濃度為5 ii mol/L) 37。C避光負(fù)載30min ;用HEPES緩沖液洗3次后再用lml緩沖液重懸；以激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)523nm測(cè)定，CELLQuest Pro分析系統(tǒng)分析每組細(xì)胞H2DCF_DA的熒光強(qiáng)度。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行處理，均數(shù)的比較采用單因素方差分析(0ne-wayAN0VA)進(jìn)行比較，繼以Student-Newman-Keuls進(jìn)行兩兩均數(shù)間的比較。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果( — )迷迭香酸-楊梅黃酮藥物配方對(duì)神經(jīng)毒素6-0HDA處理的MES23. 5多巴胺能細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用
從表1可以看出，MTT法顯示當(dāng)只加入6-0HDA時(shí)，細(xì)胞的存活率明顯下降，而用迷迭香酸(10—9mol/L)和楊梅黃酮(10— q1/L)預(yù)孵育后，細(xì)胞的存活率均有上升，與6-0HDA單獨(dú)作用組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明迷迭香酸和楊梅黃酮在體外配比使用可以對(duì)神經(jīng)毒素?fù)p傷的MES23. 5多巴胺能細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。 表l迷迭香酸-楊梅黃酮配比使用減輕神經(jīng)毒素6-0HDA誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率的下降
Cell via隨yControl1.000±0.000
6-OHDA0.595±0.092*
RA+Myricetin+6-OHDA0.949±0.028， *P < 0. 05， compared with the control ;#P < 0. 05， compared with 6-0HDA
( 二 )迷迭香酸_楊梅黃酮復(fù)合制劑的抗氧化應(yīng)激作用
1.細(xì)胞線粒體跨膜電位(A VM)的檢測(cè) 6-0HDA處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位出現(xiàn)明顯的下降，10—9mol/L迷迭香酸與10—"mol/L楊梅黃酮配比使用可以明顯恢復(fù)線粒體跨膜電位，與6-0HDA單獨(dú)作用組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。 2.細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)(R0S)的檢測(cè) 6-0HDA處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的明顯增加，10—9mol/L迷迭香酸與10—"mol/L楊梅黃酮配比使用可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)水平，與6-0HDA單獨(dú)作用組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。 表2迷迭香酸_楊梅黃酮配比使用對(duì)細(xì)胞線粒體跨膜電位和R0S的影響
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實(shí)施例2 :迷迭香酸_楊梅黃酮復(fù)合制劑藥物配方的體外毒性實(shí)驗(yàn) —、實(shí)驗(yàn)材料( — )藥品和試劑 MTT， DMSO。
( 二 )儀器 酶標(biāo)儀R-T-2100C，深圳雷杜公司。
二、實(shí)驗(yàn)方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MES23.5多巴胺能細(xì)胞，吹打制成單細(xì)胞懸液后離心，用完全培養(yǎng)基稀釋成2X 105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，每孔200 1接種于96孔板，置于37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到70-80%后換用無血清培養(yǎng)基及藥物處理，加入迷迭香酸(10—9mol/L)與楊梅黃酮(10—"mol/L)，孵育MES23. 5多巴胺能細(xì)胞24h后，陰性對(duì)照組只用無血清培養(yǎng)基替換，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入5mg/ml的MTT 20 yl，37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h;棄上清后每孔加入匿S0 200 iU，自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(主波長(zhǎng)573nm，次波長(zhǎng)630nm)，測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算各組MES23. 5細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值_空白組吸光度值)/(陰性對(duì)照組吸光度值_空白組吸光度值)。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示迷迭香酸(10—9mol/L)和楊梅黃酮(10—"mol/L)配比使用處理細(xì)胞24h
后，細(xì)胞存活率(0.987±0. 102)與對(duì)照組(l.OOO士O.OOO)相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明實(shí)
驗(yàn)所用濃度的迷迭香酸-楊梅黃酮復(fù)合制劑沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用。 通過以上實(shí)驗(yàn)表明，迷迭香酸-楊梅黃酮配比使用(摩爾濃度配比為10 : 1)能
對(duì)MES23. 5多巴胺能細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。該藥物配方可以明顯減輕神經(jīng)毒素6-OHDA
誘導(dǎo)的MES23. 5細(xì)胞存活率的下降；明顯減輕細(xì)胞線粒體膜電位的下降和活性氧物質(zhì)的生
成，無細(xì)胞毒性，副作用小，具有神經(jīng)保護(hù)及抗氧化應(yīng)激的作用。
權(quán)利要求
一種迷迭香酸-楊梅黃酮藥物配方，其特征在于迷迭香酸與楊梅黃酮的摩爾濃度配比為10∶1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的迷迭香酸-楊梅黃酮藥物配方，其特征在于所述的迷迭香酸和楊梅黃酮均為天然植物提取物，其中迷迭香酸從迷迭香植物紫蘇中提取獲得。
3. —種迷迭香酸_楊梅黃酮藥物在治療帕金森病中的應(yīng)用，其特征在于該復(fù)合制劑用 于神經(jīng)保護(hù)，10—9mol/L迷迭香酸與10—"mol/L楊梅黃酮配比使用時(shí)，減輕神經(jīng)毒素6-羥基 多巴胺誘導(dǎo)的MES23. 5多巴胺能細(xì)胞存活率的下降；減輕神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的細(xì) 胞線粒體膜電位的下降和活性氧物質(zhì)的生成，具有抗氧化應(yīng)激作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種迷迭香酸-楊梅黃酮藥物配方及其在治療帕金森病中的應(yīng)用。該復(fù)合制劑的藥物配方為迷迭香酸與楊梅黃酮的摩爾濃度配比為10∶1。該藥物用于神經(jīng)保護(hù)，10-9mol/L迷迭香酸與10-10mol/L楊梅黃酮配比使用時(shí)，減輕神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的MES23.5多巴胺能細(xì)胞存活率的下降；減輕神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的下降和活性氧物質(zhì)的生成，具有抗氧化應(yīng)激作用。該藥物能夠保護(hù)MES23.5多巴胺能細(xì)胞免受神經(jīng)毒素6-OHDA的損傷，安全無毒，副作用小，對(duì)于開發(fā)成為一種新型的抗帕金森病天然新藥具有重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P25/16GK101780098SQ201010125018
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月13日
發(fā)明者姜宏, 宋寧, 李榮貴, 杜婷婷, 謝俊霞 申請(qǐng)人:青島大學(xué)