專利名稱：：骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種骨修復(fù)用復(fù)合纖維膜的制備方法，具體說是生物活性聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法。
背景技術(shù)：
：骨損傷是目前常見的疾病。由于風(fēng)濕、類風(fēng)濕等各種骨關(guān)節(jié)疾病或運動創(chuàng)傷所造成的關(guān)節(jié)骨損傷給許多病人帶來了痛苦。我國每年的骨損傷患者高達約千余萬，需做關(guān)節(jié)置換術(shù)者約500萬(每位患者的目前費用是3-5萬元)，需做面部軟骨缺損修復(fù)患者近30萬。自19世紀(jì)以來，為修復(fù)由于創(chuàng)傷、腫瘤或感染所造成的大范圍骨缺損，恢復(fù)肢體功能，臨床上一直主要采用骨移植術(shù)。但無論是常用的自體骨移植還是異體骨移植，均存在著供體有限或免疫排斥反應(yīng)等問題。目前臨床上也在廣泛使用各種以金屬或陶瓷制備的人工骨替代材料，但這些材料在生物相容性、生物活性、生物可降解性及力學(xué)性能、使用壽命等方面都有各自的缺點。迄今為止，大范圍骨缺損的醫(yī)治仍未有效解決。自從Langer和Vacanti提出組織工程的概念之后，組織工程和再生醫(yī)學(xué)的方法和原理也為修復(fù)骨組織的缺損和病變提供了希望。對于骨組織工程而言，可以通過成骨細(xì)胞的生長、增殖或干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化生長成活體骨組織，從而有望促進大范圍骨缺損的修復(fù)。其中，支架材料在骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)中起著十分重要的作用。理想的支架材料要求其既具有促進細(xì)胞粘附、增殖和維持表型等功能，又能提供一定的力學(xué)強度。對于骨組織工程支架，還應(yīng)具有一定的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，這就要求其能有效地模擬骨細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)。從材料角度，骨是由羥基磷灰石納米晶體和膠原纖維構(gòu)成的納米生物復(fù)合材料；從其形成角度，骨是通過羥基磷灰石晶體在膠原纖維上自組裝礦化沉積而形成的復(fù)雜的層狀結(jié)構(gòu)。天然膠原大分子和羥基磷灰石陶瓷是骨細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分，具有良好的生物相容性和生物活性，無疑是骨組織工程支架材料的理想組分，但力學(xué)性能較差；合成高分子材料如聚(乳酸-羥基乙酸)(PLGA)雖表面疏水、缺乏細(xì)胞識別位點，但具有良好的機械強度、可降解性和加工性，可以彌補它們的缺點。在組織工程支架的制備技術(shù)中，靜電紡絲法因其得到的納米纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)類似骨細(xì)胞外基質(zhì)、有利于細(xì)胞的粘附和生長，且工藝設(shè)備簡單、適用性廣，從而具有獨特的優(yōu)勢；同時，還可結(jié)合生理體液礦化的方法在電紡纖維表面沉積羥基磷灰石，高度模擬骨組織的自組裝沉積過程，得到的生物活性復(fù)合支架有望對骨細(xì)胞的生長產(chǎn)生剌激，從而誘導(dǎo)骨的形成。因此，針對骨組織的特點，通過各材料的優(yōu)勢互補，采用靜電紡絲和礦化的方法制備出復(fù)合羥基磷灰石的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原納米纖維。該類高度仿生化的復(fù)合材料可為細(xì)胞提供與天然骨相似的微環(huán)境，符合骨組織工程的生物學(xué)要求，有望成為骨修復(fù)用的一種理想的活性支架。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高度模擬人體天然骨的組成、結(jié)構(gòu)和自組裝礦化形成過程，并為受損的骨組織提供仿生的微環(huán)境且能有效地促進骨細(xì)胞的粘附、生長、功能表達與成骨分化的骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法。本發(fā)明的骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法，包括以下步驟1)將膠原溶解于體積濃度為3%的乙酸溶液中，配制質(zhì)量濃度為0.55mg/mL膠原的乙酸溶液；2)將聚(乳酸-羥基乙酸)電紡納米纖維膜置于等離子體放電儀中，設(shè)置功率為10400W，處理530分鐘后，浸入步驟1)配制的溶液中，4t:過夜，凍干，得到表面涂層膠原的聚(乳酸_羥基乙酸)復(fù)合纖維膜；3)將步驟2)制得的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜置于l5倍濃度的模擬人體生理體液中，37t:水浴中礦化處理，每2天更換模擬體液，礦化處理128天后，取出樣品，用三蒸水洗滌多次，凍干，得到聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜。上述的1倍濃度的模擬體液是指每升三蒸水含有145.2mM氯化鈉、5mM氯化鉀、1.5mM氯化鎂、2.5mM氯化f丐、4.2mM碳酸氫鈉、lmM磷酸氫二銨、0.5mM硫酸鈉和50mM三羥甲基氨基甲烷的溶液，其pH值為7.4。本發(fā)明中，所說的聚(乳酸-羥基乙酸)電紡納米纖維膜可以按以下方法制備將聚(乳酸-羥基乙酸)溶解于體積比為1/1的四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶劑中，控制其質(zhì)量濃度為15%;將該溶液加入到注射器中進行靜電紡絲，設(shè)置流速0.52.OmL/h，電壓1215kV，室溫下鋁膜收集，收集距離1020cm，得到聚(乳酸-羥基乙酸)納米纖維膜。本發(fā)明制備方法簡單快捷、材料來源廣泛。采用等離子體處理及涂層的方法在聚(乳酸-羥基乙酸)電紡纖維中引入骨細(xì)胞外基質(zhì)成分的膠原大分子，并模擬骨自組裝形成過程的礦化方法沉積復(fù)合羥基磷灰石，得到了類骨組成和結(jié)構(gòu)的仿生化納米纖維復(fù)合膜。所得的復(fù)合纖維膜具有生物相容性好、綜合性能優(yōu)良和使用方便等優(yōu)點，可以有效地促進成骨細(xì)胞和干細(xì)胞的粘附、生長與分化，具有良好的表達成骨功能和誘導(dǎo)分化的能力。圖1是聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜隨等離子體處理時間的接觸角變化曲線；圖2是等離子體處理前后的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜的掃描電鏡照片，其中a)是未處理的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，b)f)是等離子體處理時間分別為5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘和30分鐘的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，g)1)分別是a)f)的放大照片；圖3是聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜經(jīng)等離子體處理15分鐘再涂層膠原后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，其中a)和b)是掃描電鏡照片，b)是a)的放大照片，c)是X-射線能譜圖；圖4是聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜在37t:的5倍濃度的模擬體液(5XSBF)中礦化后的掃描電鏡照片；其中a)f)是礦化時間分別為l天、2天、3天、6天、9天和13天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜；g)是礦化13天的纖維膜的內(nèi)層；圖5是聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜在37°C的5XSBF中礦化前后的斷面的掃描電鏡照片，其中a)是聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，b)e)是礦化時間分別為2天、6天、9天和13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖6是纖維膜斷面的透射電鏡照片，其中a)是聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，b)是聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜，c)g)是礦化時間分別為1天、2天、6天、9天和13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖7是從礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜上分離的羥基磷灰石礦物顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，其中a)和b)是透射電鏡照片，b)是a)的放大照片，c)是X-射線電子衍射環(huán)圖案；圖8是聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜、聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜、礦化9天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜和礦化13天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線；圖9是MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)24小時和7天后的MTT活性圖，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)培養(yǎng)板，b)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，c)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)f)礦化時間分別為l天、3天、9天和13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖10是MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)7天后的細(xì)胞骨架的激光共聚焦顯微鏡照片，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)培養(yǎng)板，b)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，c)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)f)礦化時間分別為l天、9天和13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖11是MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)7天后的掃描電鏡照片，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，b)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，c)礦化l天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)f)分別是a)c)的放大照片；圖12是MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)7天和14天后的堿性磷酸酶(ALP)含量圖，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)培養(yǎng)板，b)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，c)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)f)礦化時間分別為l天、3天、9天和13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖13是兔源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天、3天和7天后的MTT活性圖，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)培養(yǎng)板，b)聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜，c)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)f)礦化時間分別為l天、3天、9天和13天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖14是干細(xì)胞在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后的掃描電鏡照片，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，b)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，c)礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和d)礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖15是干細(xì)胞在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后堿性磷酸酶染色的普通光學(xué)照片，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)培養(yǎng)板，b)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，c)聚(乳5酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)礦化1天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜；圖16是鈣化結(jié)節(jié)茜素紅S染色照片，其中a)和b)是未培養(yǎng)細(xì)胞的空白聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜和礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，c)和d)是種植干細(xì)胞后在加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后的聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜和礦化1天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，al)dl)是普通光學(xué)照片，a)d)是分別是al)dl)相應(yīng)的光學(xué)顯微鏡照片；圖17是鈣化結(jié)節(jié)yonKossa染色的普通光學(xué)照片，其中al)dl)分別是未培養(yǎng)細(xì)胞的空白聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜、聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜、礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜；a2)d2)和el)分別是種植干細(xì)胞后在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜、聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜、礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜、礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和培養(yǎng)板；a3)d3)和e2)分別是種植干細(xì)胞后在加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后的聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜、聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜、礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜、礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和培養(yǎng)板；圖18是干細(xì)胞分別在未加骨誘導(dǎo)液和加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后的鈣化結(jié)節(jié)的鈣含量圖，其中細(xì)胞培養(yǎng)的基體分別為a)培養(yǎng)板，b)聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜，c)聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜，d)礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和e)礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜。具體實施例方式以下結(jié)合實例進一步說明本發(fā)明，但這些實例并不用來限制本發(fā)明。實例1:1)將1.5g聚(乳酸-羥基乙酸)溶解于10mL體積比為1/1的四氫呋喃/二甲基甲酰胺的混合溶劑中，即質(zhì)量濃度為15%，將該溶液加入到20mL的注射器中進行靜電紡絲，設(shè)置流速1.OmL/h，電壓12kV，室溫下鋁膜收集，收集距離15cm。2小時后停止注射，即可在鋁膜上收集到聚(乳酸_羥基乙酸)納米纖維膜；2)將0.lg膠原溶解于100mL體積濃度3%的乙酸溶液中，配制質(zhì)量濃度為lmg/mL膠原的乙酸溶液；3)取步驟1)制備的電紡纖維膜5片，置于等離子體放電儀中，設(shè)置功率為400W，分別處理5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘。將處理15分鐘后的纖維膜馬上浸入到步驟2)制得的lmg/mL膠原的乙酸溶液中，4t:過夜，凍干24h，得到表面涂層膠原的聚(乳酸-羥基乙酸)復(fù)合纖維膜。圖l和圖2分別是聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜隨等離子體處理時間的接觸角變化曲線和形貌變化圖；由圖可知，未經(jīng)處理的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜比較疏水，隨著等離子體處理時間的延長，親水性先逐漸提高而后又有所下降；同時纖維表面逐漸變得粗糙。選取處理時間為15分鐘的纖維膜用于后續(xù)的膠原涂層。圖3是聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜經(jīng)等離子體處理15分鐘再涂層膠原后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；涂層膠原的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜仍保持了原有的連續(xù)且相互交叉的納米纖維結(jié)構(gòu)，且纖維之間纏繞著很多更小納米尺度的膠原纖維，能譜圖中證實了N元素的存在，這表明經(jīng)等離子體和涂層處理后，成功制備了聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜/膠原復(fù)合纖維膜；同時，用紫外吸收測蛋白法測得復(fù)合纖維膜上的膠原含量為323.3±67.OPg/cn^，且其親水性大大提高，表觀接觸角為零，這為后續(xù)對其進行礦化處理提供了便利。4)將步驟3)得到的聚(乳酸_羥基乙酸)纖維/膠原復(fù)合纖維膜置于每升三蒸水中含有726mM氯化鈉、25mM氯化鉀、7.5mM氯化鎂、12.5mM氯化鈣、21mM碳酸氫鈉、5mM磷酸氫二銨、2.5mM硫酸鈉和50mM三羥甲基氨基甲烷所配制的5倍濃度的模擬人體生理體液(5XSBF)中，37°C水浴中分別礦化1天、2天、3天、6天、9天和13天，每2天換液以保證模擬體液的活性。取出樣品，用三蒸水洗滌多次，凍干得到羥基磷灰石礦物沉積的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜。圖4是聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜在模擬體液中礦化后的掃描電鏡照片；礦化1天的纖維膜上開始出現(xiàn)礦物顆粒，纖維絲形成了串珠狀的結(jié)構(gòu)；隨著礦化時間的延長，礦物顆粒不斷長大和增多，并堆積成聚集體，逐漸覆蓋纖維膜表面；同時在纖維膜內(nèi)部也均勻生長有礦物顆粒。圖5和圖6分別是纖維膜斷面的掃描電鏡和透射電鏡照片；由圖可知，相對于未礦化的聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜和聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜較為"干凈"的斷面，礦化后的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜在礦化早期生長出"半球狀"的礦物顆粒，并逐步長大成完整的球形，包裹著纖維表面成"花朵狀"的結(jié)構(gòu)；同時觀察到一個顆粒其實是由很多細(xì)小針狀的礦物構(gòu)成，其形態(tài)與市售的針狀羥基磷灰石晶體相似。圖7是從礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜上分離的羥基磷灰石礦物顆粒的透射電鏡照片和X-射線電子衍射環(huán)圖案；可以發(fā)現(xiàn)，礦物顆粒的尺寸大致在23ym，與圖5的掃描電鏡形貌相吻合；放大照片顯示一個顆粒確實是有多個針狀羥基磷灰石聚集而成，與圖6的透射電鏡形貌也相符；電子衍射圖案中由很多單晶構(gòu)成了(300)，(112)，(310)，(002)，(301)，(321)禾P(502)的晶面，與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石相似；綜合以上結(jié)果，表明通過模擬人體生理體液礦化的方法成功制備了聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石仿生化復(fù)合纖維膜。圖8是不同纖維膜的應(yīng)力_應(yīng)變曲線圖；表1是由圖11曲線測得的不同纖維膜的拉伸模量和拉伸強度；表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由圖11和表i可知，聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線中沒有屈服點；膠原涂層的纖維膜的曲線中出現(xiàn)了明顯的屈服點，且拉伸模量急劇增大，這顯示了力學(xué)性能的增強；而羥基磷灰石的沉積對纖維膜的力學(xué)增強作用更為顯著，這將有利于其作為骨組織工程支架的應(yīng)用。5)將聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜、聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜和礦化制備的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜切成直徑為7mm的圓片，用75%的酒精浸泡，紫外光照射過夜滅菌，用無菌的PBS緩沖液置換去除其中的酒精后，將纖維膜薄片放入96孔培養(yǎng)板中。用0.25%胰酶/PBS溶液將新生小鼠顱骨源性的成骨樣細(xì)胞系(MC3T3-E1細(xì)胞)從培養(yǎng)盤消化，離心(1200rpm)10分鐘，棄去上清夜，加入含10%胎牛血清的新鮮匿EM培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度，控制每孔的種植密度為2.5XIOV孔(即6.5X10Vcm2)，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至所需時間。每隔2天更換培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)。同樣方法將細(xì)胞直接種植在空白96孔培養(yǎng)板中用于對照。圖9是MC3T3-E1成骨細(xì)胞在培養(yǎng)板和不同纖維膜上培養(yǎng)24小時和7天后的MTT活性圖；各纖維膜上的細(xì)胞活性均低于培養(yǎng)板上的細(xì)胞活性，而聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜、聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和礦化1天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜上的細(xì)胞在培養(yǎng)7天后活性大大提高，其中后兩者的提高幅度更大。圖10和圖11是MC3T3-E1成骨細(xì)胞在培養(yǎng)板和不同纖維膜上培養(yǎng)7天后的激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡照片；由圖觀察到，培養(yǎng)板上的細(xì)胞密度很高，但微絲的鋪展程度不大；聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜上細(xì)胞數(shù)量較少，且細(xì)胞多為球形；聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜和礦化l天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜上的細(xì)胞數(shù)量相對較多，且細(xì)胞成伸展的多角形，這與MTT活性結(jié)果相吻合；特別是礦化1天的纖維膜上的細(xì)胞相互連成一片形成細(xì)胞層覆蓋在纖維表面，顯示了良好的粘附和生長狀態(tài)，且表面有更多的細(xì)胞分泌物。圖12是MC3T3-E1成骨細(xì)胞在培養(yǎng)板和不同纖維膜上培養(yǎng)7天和14天后的堿性磷酸酶含量圖；培養(yǎng)7天后，各基體上的細(xì)胞均分泌了一定含量的堿性磷酸酶，但差別不大；相對于其他基體，培養(yǎng)14天后的細(xì)胞在礦化9天和13天的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜上分泌的堿性磷酸酶含量大大提高，結(jié)合它們富含羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)，表明礦化沉積有羥基磷灰石顆粒的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜雖然保持細(xì)胞活性和增殖的能力一般，但極大地促進了成骨細(xì)胞的表型，顯示了較高的成骨活性。該類仿生化的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜具有鈣化成骨的潛力，在骨的再生修復(fù)中有一定的應(yīng)用前景。實例2:步驟1)2)同實例1中的步驟1)2)。步驟3)同實例1中的步驟3)，但等離子體處理的功率為50W。步驟4)同實例1中的步驟4)，得到聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜。步驟5)同實例1中的步驟5)，但用兔源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來評價纖維膜誘導(dǎo)成骨分化的能力，控制每孔的種植密度為6.OX103/孔(即1.6XlOVcm2)。細(xì)胞部分培養(yǎng)在含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至4周，部分先在含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7天再在加入骨誘導(dǎo)液(含100nM地塞米松、10mMP-甘油磷酸和50yg/mL維生素C抗壞血酸)的含10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至4周。圖13是干細(xì)胞在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天內(nèi)的MTT活性圖；在培養(yǎng)板和各纖維膜上的細(xì)胞活性隨著培養(yǎng)時間均有所提高，但樣品之間的差異不大。圖14是干細(xì)胞在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后的掃描電鏡照片；相對于聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜的球形的細(xì)胞形態(tài)，在聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜/膠原纖維膜和聚(乳酸_羥基乙酸)纖維膜/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜上的細(xì)胞形態(tài)更為鋪展。圖15是干細(xì)胞在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后堿性磷酸酶染色的照片；明顯發(fā)現(xiàn)，相對于培養(yǎng)板(圖15a))和未礦化的纖維膜(圖15b)和15c))，聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜(圖15d))的顏色更深，說明其上培養(yǎng)的細(xì)胞分泌了更多的堿性磷酸酶，這是干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志之一。圖16是茜素紅S染色照片；觀察到在加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后的礦化1天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜整片膜可明顯觀察到圖16d)中被染色的細(xì)胞，這說明干細(xì)胞在此材料上已發(fā)生了鈣化結(jié)節(jié)，向成骨細(xì)胞分化。圖17是vonKossa染色的照片；相對于空白材料上含有羥基磷灰石中的鈣分布(圖17cl)和17dl))，在未加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后的礦化纖維膜(圖17c2)和17d2))上的鈣分布更多，說明了干細(xì)胞發(fā)生了鈣化結(jié)節(jié)，其效果優(yōu)于直接培養(yǎng)在培養(yǎng)板上的細(xì)胞(圖17e1));而在加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原纖維膜和聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜上的鈣分布更明顯(圖17b3)17d3))，特別是含較多羥基磷灰石的礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜整片膜(圖17d3))中深黑色部分面積最大，說明其上的細(xì)胞的鈣化結(jié)節(jié)的程度最大。圖18是干細(xì)胞培養(yǎng)4周后的鈣化結(jié)節(jié)的鈣含量圖；也同樣發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在加骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的礦化13天的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原纖維膜上分泌的鈣含量最大。以上結(jié)果基本與實例1中成骨細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果相似，說明了礦化制備的聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜具有較強的生物活性和誘導(dǎo)干細(xì)胞鈣化成骨的能力，有望最終成為骨修復(fù)用的理想支架材料。實例3:步驟1)2)同實例1中的步驟1)2)。步驟3)同實例1中的步驟3)，但聚(乳酸-羥基乙酸)纖維膜經(jīng)等離子體處理IO分鐘后涂層膠原。步驟4)同實例1中的步驟4)，得到聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜。實例4:步驟1)同實例1中的步驟1)，得到聚(乳酸_羥基乙酸)納米纖維膜。步驟2)同實例1中的步驟2)，但配制質(zhì)量濃度為5mg/mL膠原的乙酸溶液。步驟3)4)同實例1中的步驟3)4)，得到聚(乳酸_羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜。實例5:步驟l)3)同實例l中的步驟l)3)，得到聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜。步驟4)同實例1中的步驟4)，但將聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜置于1倍濃度的模擬人體生理體液(SBF，每升三蒸水含有145.2mM氯化鈉、5mM氯化鉀、1.5mM氯化鎂、2.5mM氯化f丐、4.2mM碳酸氫鈉、lmM磷酸氫二銨、0.5mM硫酸鈉和50mM三羥甲基氨基甲烷的溶液)中礦化28天，得到羥基磷灰石沉積的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜。權(quán)利要求骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法，包括以下步驟1)將膠原溶解于體積濃度為3％的乙酸溶液中，配制質(zhì)量濃度為0.5～5mg/mL膠原的乙酸溶液；2)將聚(乳酸-羥基乙酸)電紡納米纖維膜置于等離子體放電儀中，設(shè)置功率為10～400W，處理5～30分鐘后，浸入步驟1)配制的溶液中，4℃過夜，凍干，得到表面涂層膠原的聚(乳酸-羥基乙酸)復(fù)合纖維膜；3)將步驟2)制得的聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原復(fù)合纖維膜置于1～5倍濃度的模擬人體生理體液中，37℃水浴中礦化處理，每2天更換模擬體液，礦化處理1～28天后，取出樣品，用三蒸水洗滌多次，凍干，得到聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜。2.按權(quán)利要求l所述的骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法，其特征在于聚(乳酸-羥基乙酸)電紡納米纖維膜按以下方法制備將聚(乳酸-羥基乙酸)溶解于體積比為l/l的四氫呋喃/二甲基甲酰胺混合溶劑中，控制其質(zhì)量濃度為15%;將該溶液加入到注射器中進行靜電紡絲，設(shè)置流速0.52.OmL/h，電壓1215kV，室溫下鋁膜收集，收集距離1020cm，得到聚(乳酸-羥基乙酸)納米纖維膜。3.按權(quán)利要求l所述的骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法，其特征在于1倍濃度的模擬體液是指每升三蒸水含有145.2mM氯化鈉、5mM氯化鉀、1.5mM氯化鎂、2.5mM氯化鈣、4.2mM碳酸氫鈉、lmM磷酸氫二銨、0.5mM硫酸鈉和50mM三羥甲基氨基甲烷的溶液，其pH值為7.4。全文摘要本發(fā)明公開了一種骨修復(fù)用生物活性聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜的制備方法，步驟包括將聚(乳酸-羥基乙酸)電紡納米纖維膜經(jīng)等離子體處理后涂層膠原，然后將其浸入模擬人體生理體液中礦化，獲得聚(乳酸-羥基乙酸)/膠原/羥基磷灰石復(fù)合纖維膜。本發(fā)明制備方法簡單快捷、材料來源廣泛。采用等離子體處理及涂層的方法在聚(乳酸-羥基乙酸)電紡纖維中引入骨細(xì)胞外基質(zhì)成分的膠原，并將活性羥基磷灰石沉積到纖維膜上，得到了高度仿生化的納米纖維復(fù)合膜。所得的復(fù)合纖維膜綜合性能優(yōu)良、使用方便，可以有效地促進成骨細(xì)胞和干細(xì)胞的粘附、生長和鈣化成骨的能力，有望成為骨修復(fù)用的理想的活性支架。文檔編號A61L27/18GK101791438SQ201010125478公開日2010年8月4日申請日期2010年3月16日優(yōu)先權(quán)日2010年3月16日發(fā)明者勞麗紅,張裕英,朱旸,邱媛,高長有申請人:浙江大學(xué)