專利名稱：：一種家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程抗菌蛋白的制備領(lǐng)域，具體涉及一種家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自青霉素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，各種天然、半合成及合成的化合物被大量、成功地應(yīng)用于抵抗各種微生物感染，然而，隨著環(huán)境的改變和微生物的適應(yīng)性進(jìn)化，大多數(shù)致病性微生物對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性已成為影響公眾健康的嚴(yán)重問(wèn)題(BonomoRA.Multipleantibiotic-resistantbacteriainlong-term-carefacilitiesAnemergingprobleminthepracticeofinfectiousdiseases[J].ClinInfectDis,2000,31:1414-1422.；MurindaSE,EbnerPD,NguyenLT,etal.Antimicrobialresistanceandclass1integronsinpathogenicEscherichiacolifromdairyfarms[J].FoodbornePathogDis,2005,2:348-352.；WiseR.Therelentlessriseofresistance？[J].JAntimicrobChemother,2004,54306-310.)。因此人們不斷研制新抗生素或通過(guò)改造原有抗生素來(lái)對(duì)付耐藥菌，然而抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及耐藥菌產(chǎn)生的速度，且從本質(zhì)上并沒(méi)有超越原有抗生素的殺菌機(jī)制。針對(duì)此，“無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性”是新一代抗菌制劑的發(fā)展趨勢(shì)和要求。抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一種具有抗菌作用的陽(yáng)離子小肽，是生物先天性免疫的重要組成成分，不但具有廣譜抗菌性，能抑殺耐藥性菌株，而且它的殺菌機(jī)制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性突變，從而成為最具開(kāi)發(fā)前景的抗生素替代品之一，為解決細(xì)菌耐藥性這一棘手難題提供了新途徑(KisichKOHM,BoguniewiczM,etal.TheconstitutivecapacityofhumankeratinocytestokillStaphylococcusaureusisdependentonbeta-defensin3[J],JInvestDermatol,2007,1272368-2380.；LiuPT,ModlinRL.HumanmacrophagehostdefenseagainstMycobacteriumtuberculosis[J].CurrOpinImmunol,2008,20371-376.)。天蠶素(Cecropin)是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一類抗菌肽，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，且對(duì)革蘭氏陰性菌活性更強(qiáng)，而對(duì)高等動(dòng)物機(jī)體的正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有作用(ArcidiaconoS,SoaresJWiMeehanAM,etal.MembranepermeabilityandantimicrobialkineticsofcecropinPlagainstEscherichiacoli[J].JPeptSci，2009，15:398-403.)。研究表明其殺菌機(jī)制為，首先在靜電作用下與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞表面結(jié)合，疏水的C端插入細(xì)菌細(xì)胞膜中的疏水區(qū)域，隨著Cecropin分子在細(xì)菌細(xì)胞膜上的集聚，使得膜外正電荷增多，兩側(cè)膜電位升高，最終改變了細(xì)胞膜的構(gòu)象，多個(gè)Cecropin分子聚合在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成離子通道，造成細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和細(xì)菌死亡(ParkY，HahmKS.Antimicrobialpeptides(AMPs):peptidestructureandmodeofaction[J].JBiochemMolBiol,2005,38507-516.；FerreR，MeloMN,CorreiaAD,etal.Synergisticeffectsofthemembraneactionsofcecropin—melittinantimicrobialhybridpeptideBPlOO[J].BiophysJ,2009,961815-1827.；GregorySM,CavenaughA,JourniganV,etal.Aquantitativemodelfortheall—or—nonepermeabi1izationofphospholipidvesiclesbytheantimicrobialpeptidececropinA[J],JFoodProt，2008，94:1667-1680.)。人溶菌酶是存在于正常體液和組織中的一類非特異性免疫因子，具有較強(qiáng)的殺菌活性尤其是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌活性更強(qiáng)，而且對(duì)人體沒(méi)有毒副作用。一般認(rèn)為溶菌酶可以通過(guò)其活性中心破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的口_1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。此外研究還發(fā)現(xiàn)抗菌肽天蠶素與溶菌酶之間存在著協(xié)同甚至是加強(qiáng)作用(ChalkR，TownsonH,NatoriS,etal.Purificationofaninsectdefensinfromthemosquito,Aedesaegypti[J],InsectBiochemMolBiol,1994,24403-410.；YoeSM,KangCS,HanSS,etal.CharacterizationandcDNAcloningofhinnavinII，acecropinfamilyantibacterialpeptidefromthecabbagebutterfly,Artogeiarapae[J].CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol,2006，144:199_205.)。為了尋找具有更高抗菌活性或更廣抗菌譜的肽類抗菌藥物，國(guó)內(nèi)外研究主要通過(guò)改變肽鏈長(zhǎng)度、電荷、增強(qiáng)螺旋度，通過(guò)氨基酸替換改變其氨基酸的組成，以及融合相同或不同的抗菌肽或抗菌蛋白等方式來(lái)進(jìn)行肽類抗菌藥物分子設(shè)計(jì)。其中融合技術(shù)較為常用，目前國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于新型融合抗菌蛋白研究開(kāi)發(fā)的報(bào)道。通過(guò)將兩種或多種抗菌蛋白或其功能域或其它分子融合成一種新的蛋白，可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，發(fā)揮其綜合效應(yīng)，或使其某些活性顯著提高，出現(xiàn)抗菌蛋白簡(jiǎn)單合用所不具備的生物學(xué)效應(yīng)。如將CecropinA的第廣8位氨基酸與Melittin的第廣12位氨基酸進(jìn)行融合組成新的雜交肽(hybridpeptideCA-ME)，不僅保持了CecropinA的廣譜抗菌活性，而且獲得一些Melittin的抗舌個(gè)生Melittin白勺個(gè)生(Rodriguez-HernandezMJ,SaugarJ,Docobo-PerezF,etal.StudiesontheantimicrobialactivityofcecropinA—melittinhybridpeptidesincolistin-resistantclinicalisolatesofAcinetobacterbaumannii[J].JAntimicrobChemother,2006,58:95-100.)。Schmitt等MCecropinAR^^)ψ列相連構(gòu)成的雙層肽(CECdir-CECret)具有比天然CecropinA單體更高的抗菌活性Ψ.Γ^iiKMXm(SchmittP,MercadoL,DiazΜ,etal.(2008)Characterizationandfunctionalrecoveryofanovelantimicrobialpeptide(CECdir-CECret)frominclusionbodiesafterexpressioninEscherichiacoli[J].Peptides,2008,29512-519.)。將來(lái)源不同的Cecropin片段連接起來(lái)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CecropinA(廣ll)_CecropinD(1237)比CecropinA具有更強(qiáng)的抗菌活性，其中對(duì)Bacillussubtilis的活性是CecropinA的6倍,對(duì)Streptococcusfaecalis的活性是CecropinA的9倍(PlunkettRM,MurraySi,LowenbergerCA,etal.Generationandcharacterizationoftheantibacterialactivityofanovelhybridantimicrobialpeptidecomprisingfunctionaldomainsfromdifferentinsectcecropins[J].CanJMicrobiol,2009,55(5):p.520—8.)。此夕卜，研究發(fā)現(xiàn)Cecropins禾口Magainins對(duì)Staphylococcusaureus禾口Staphylococcuspyogenes的活性較弱，而其雜合月太CecropinA(l"8)-Magainin2(112)活性更強(qiáng)(XuX,JinF,YuX,etal.High-levelexpressionoftherecombinanthybridpeptidececropinA(1-8)_magainin2(1-12)withanubiquitinfusionpartnerinEscherichiacoli[J].ProteinExprPurif，2007，55:175-182.)。國(guó)內(nèi)蘇志堅(jiān)等構(gòu)建和表達(dá)了一種帶有凝血酶切割位點(diǎn)的Cecropin雜合肽AD和人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子突變體的融合蛋白S，從而開(kāi)發(fā)出一種既能殺菌又能促進(jìn)傷口愈合的新型藥物(蘇志堅(jiān)，吳曉萍，鄭青等，抗菌肽和人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及其活性鑒定[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36(1):ρ·63-68·)。融合蛋白技術(shù)不僅可以用于進(jìn)一步探討融合蛋白的生物學(xué)效應(yīng)、結(jié)構(gòu)和功能、受體信號(hào)傳導(dǎo)等理論研究，而且為開(kāi)發(fā)臨床抗感染新藥開(kāi)辟新的道路。然而，大多數(shù)類似的實(shí)驗(yàn)都是基于融合作用機(jī)理相同或相似(即均以細(xì)胞膜為作用靶目標(biāo))的蛋白/肽，如上述的CA-ME、(CECdir-CECret)、CecropinA(Tll)-CecropinD(1237)、CecropinA(Γ8)-Magainin2(Γ2)等，有關(guān)將作用機(jī)制不同且具有協(xié)同作用的抗菌蛋白進(jìn)行融合的報(bào)道還很少。從目前的研究進(jìn)展來(lái)看，雖然Cecropin類抗菌肽、人溶菌酶等肽類抗菌物質(zhì)在耐藥性日益嚴(yán)重的情況下顯示出了良好的應(yīng)用前景，但是肽類抗菌物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用還存在很多問(wèn)題需要解決。首先是和傳統(tǒng)抗生素相比，目前所發(fā)現(xiàn)的肽類抗菌物質(zhì)抗菌活性還不太理想，如Cecropin類抗菌肽對(duì)不同的微生物的殺滅作用并非完全相同；而溶菌酶的抗菌譜還不廣泛，若單獨(dú)使用則對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用并不明顯；其次是大量低成本生產(chǎn)肽類抗菌物質(zhì)，只有獲得一定質(zhì)和量的純品，才能滿足結(jié)構(gòu)活性、毒理試驗(yàn)，乃至治療等大規(guī)模應(yīng)用的要求。因此進(jìn)一步研究抗菌蛋白結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、篩選新的高效抗菌蛋白和設(shè)計(jì)改造已有抗菌蛋白的工作以及尋找低成本大量獲得肽類抗菌物質(zhì)的方法顯的尤為重要。從天然資源中提取肽類抗菌物質(zhì)，成本高、得率低、工序繁瑣；固相合成肽又價(jià)格相當(dāng)昂貴，不適合我國(guó)國(guó)情，都難以應(yīng)用于實(shí)際臨床。通過(guò)基因工程方法進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)肽類抗菌物質(zhì)則更切實(shí)可行，具有實(shí)際意義(MaiWJ,HuCQ.Molecularcloning,characterization,expressionandantibacterialanalysisofalysozymehomologuefromFenneropenaeusmerguiensis[J].MolBiolRep,2008,361587-1595.；XuX,JinF,YuX,etal.Expressionandpurificationofarecombinantantibacterialpeptide,cecropin,fromEscherichiacoli[J].ProteinExprPurif,2007,53293-301.；HuangL,LeongSSJ,JiangRR.Solublefusionexpressionandcharacterizationofbioactivehumanbeta-defensin26and27[J],ApplMicrobiolBiotechnol，2009，84:301_308·)。肽類抗菌物質(zhì)和其它蛋白質(zhì)藥物一樣，可以通過(guò)降解、排泄以及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等作用方式被清除，因而不會(huì)在體內(nèi)蓄積，對(duì)人體無(wú)毒副作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有肽類抗菌物質(zhì)中存在的成本高、抗菌譜不廣泛、抑菌作用不明顯等問(wèn)題，提供一種新的、具有多重作用機(jī)制的家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白。本發(fā)明另一目的在于提供上述家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白包含家蠅天蠶素的成熟肽序列，多肽接頭序列和人溶菌酶的成熟肽序列。其中，所述多肽接頭序列為(GGGGS)n，其中η是大于或等于1的整數(shù)，G表示甘氨酸殘基，S表示絲氨酸殘基。本發(fā)明家蠅天蠶素(Mdc)-人溶菌酶(Hly)融合蛋白的制備方法包括如下步驟設(shè)計(jì)引物，序列如SEQIDNO:2飛所示，擴(kuò)增后的序列通過(guò)重疊延伸拼接(SOE)法得到融合蛋白基因(Mdc-hly)序列以構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)融合蛋白的工程菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)和分離純化，得到家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白的制備方法包括如下步驟(1)家蠅天蠶素和人溶菌酶成熟肽序列的克隆設(shè)計(jì)引物，序列如SEQIDNO:6、所示，前兩段引物擴(kuò)增家蠅天蠶素成熟肽基因序列，后兩段引物擴(kuò)增人溶菌酶成熟肽基因序列，將所得兩段序列分別克隆入PMD20-T載體，得到相應(yīng)的家蠅天蠶素重組質(zhì)粒和人溶菌酶重組質(zhì)粒；(2)融合基因重組分別以步驟(1)所述兩個(gè)重組質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物序列如SEQIDNO:2飛所示，用兩對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物通過(guò)重疊延伸拼接(SOE)法得到融合蛋白基因序列，將該序列克隆入pMD20-T載體，得到重組質(zhì)粒，所述融合蛋白基因全序列如SEQIDNO10所示；(3)將步驟(2)所得重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pET32a經(jīng)酶切連接后，得到家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白基因重組表達(dá)質(zhì)粒；(4)將家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選，挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，經(jīng)分離純化，得到家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白。本發(fā)明家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白可以用于制備抗菌藥物、抑菌藥物或防腐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明通過(guò)融合家蠅抗菌肽cecropin及人溶菌酶，優(yōu)化所融合的兩種蛋白的性能，拓展抗菌肽及溶菌酶的抗菌譜，增強(qiáng)二者的抗菌活性，降低細(xì)菌的耐受機(jī)率，甚至產(chǎn)生新功能。本發(fā)明融合抗菌蛋白技術(shù)不僅可以用于進(jìn)一步探討抗菌肽的生物學(xué)效應(yīng)、結(jié)構(gòu)和功能、受體信號(hào)傳導(dǎo)等理論研究，而且為開(kāi)發(fā)臨床抗感染新藥開(kāi)辟新的道路；(2)本發(fā)明可大量生產(chǎn)本發(fā)明用基因工程方法，利用原核表達(dá)系統(tǒng)以融合方式進(jìn)行微生物發(fā)酵使抗菌融合蛋白獲得大量表達(dá)，克服了由于抗菌肽分子量過(guò)小導(dǎo)致表達(dá)過(guò)程中降解等問(wèn)題，并且根據(jù)大腸桿菌偏好密碼子，對(duì)抗菌肽基因修飾和密碼子優(yōu)化，不僅提高了抗菌融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)效率，還可以避免部分專利的限制，與傳統(tǒng)的多肽合成方法及從天然資源提取多肽的方法相比，本發(fā)明的制備方法突破了以往僅從天然資源中提取多肽或以氨基酸合成方法獲得抗菌肽的禁錮，使得大批量、低成本的規(guī)模生產(chǎn)成為可能，具有很好的應(yīng)用前景；(3)本發(fā)明研制的基因工程抗菌融合蛋白生產(chǎn)成本低廉，所用的表達(dá)載體帶有HIS標(biāo)簽，為進(jìn)一步純化重組蛋白提供了極大的方便。所需要的培養(yǎng)基和發(fā)酵用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備均具有價(jià)格低廉和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，十分適于推廣；(4)許多資料顯示，抗菌肽具有廣譜抗菌活性且不會(huì)向抗生素一樣產(chǎn)生耐藥性同時(shí)無(wú)殘留，因?yàn)榭咕氖堑鞍踪|(zhì)藥物，而抗生素是化學(xué)藥物，使其在食品防腐和動(dòng)物飼料添加劑等方面具有很好的應(yīng)用前景。圖1是Mdc和Hly基因的獲得及融合基因Mdc-hly的重組，其中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，1為MdcPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為Mdc-LinkerPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為HlyPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為L(zhǎng)inker-HlyPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為重組的融合基因Mdc-hly；圖2是pET32a載體的物理圖譜；圖3是原核表達(dá)質(zhì)粒Mdc-hly/pET32a構(gòu)建示意圖；圖4是重組質(zhì)粒Mdc-hly/pET32a的核苷酸測(cè)序圖；圖5是目的蛋白Trx-6His-Mdc_hly的表達(dá)、純化、酶切和融合蛋白Mdc-hly的獲得，其中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；廣2為E.C0liBL21/pET32a-MdC-hly誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后全菌蛋白，3為E.coliBL21/pET32a-Mdc-hly超聲破菌后包涵體，4為純化后目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly,5為目的蛋白Trx-6His-Mdc_hly酶切后混合物，6為Trx-6His-Mdc_hly酶切后純化的Mdc-hly蛋白，7為Trx-6HiS-Mdc-hly酶切后洗脫液中的Trx標(biāo)簽；圖6是目的蛋白Trx-6His-Mdc_hly的Western-blotting鑒定，其中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為E.coliBL21/pET32a-Mdc-hly誘導(dǎo)前全菌蛋白，2為E.coliBL21/pET32a-Mdc-hly誘導(dǎo)后全菌蛋白。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件進(jìn)行，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。實(shí)施例1本方案利用Novagen公司的pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)融合基因Mdc_hly，pET32a(+)質(zhì)粒為表達(dá)載體，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。1家蠅天蠶素(Mdc)和人溶菌酶(Hly)成熟肽序列的克隆(參見(jiàn)圖1)參照TrizolReagent使用說(shuō)明分別提取家蠅三齡幼蟲(chóng)和人胎盤組織總RNA，根據(jù)Genebank公布的天蠶素(Genebank登錄號(hào)EF175878)和人溶菌酶(Genebank登錄號(hào)J0380DcDNA序列，用PrimerPremier5.O生物軟件設(shè)計(jì)4條特異引物，P1P4，引物序列如SEQIDNO:69所示。引物PI、P2擴(kuò)增Cecropin成熟肽序列，其中上游Pl引入NcoI酶切位點(diǎn)，下游P2去掉終止密碼子，增加一個(gè)天冬酰氨密碼子AAC并引入BamHI酶切位點(diǎn)；引物P3、P4擴(kuò)增人溶菌酶成熟肽序列，上游P3含BamHI酶切位點(diǎn)，下游P4含HindIII酶切位點(diǎn)。利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到家蠅天蠶素和人溶菌酶成熟肽基因的編碼區(qū)序列，分別將目的片段克隆入PMD20-T載體，得到家蠅天蠶素重組質(zhì)粒Mdc/pMD20-T和人溶菌酶重組質(zhì)粒Hly/pMD20-T，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5□，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR鑒定、酶切鑒定及DNA測(cè)序分析后，表明獲得與Genebank公布一致的天蠶素和人溶菌酶成熟肽序列。2融合基因重組(圖1)利用Gene-SOEing技術(shù)構(gòu)建融合基因，具體方法如下(1)引物設(shè)計(jì)分別以pMD20-T/Mdc和pMD20-T/H1y重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性弓I物P58，序列如SEQIDNO25所示，引物(P5)5‘-CATGCCATGGCGATGGGCTGGTTGAAAAAAATCGGCAAGAA-3‘，(P6)5‘-CCACTACCCCCCCCGCCGCTTCCACCGCCACCGTTACCCTTTAAT-3‘(劃線部分為NcoI酶切位點(diǎn)，斜體為疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3的重疊DNA序列部分)用于擴(kuò)增帶Linker的天蠶素的成熟肽序列。引物(P7)5'“GCGGCGGGGGGGGTAGTGOCGGTGGCGGCAGCAAGGTCTTTGAAA-3‘，(P8)5'-CCCAAGCTTATTACACTCCACMCCTTGAACATACTGACGGACAT-3‘(劃線部分為Hind111酶切位點(diǎn)，斜體為疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3的重疊DNA序列部分)用于擴(kuò)增帶Linker的溶菌酶的成熟肽序列。(2)PCR擴(kuò)增Mdc-Linker以質(zhì)粒Mdc/pMD20-T為模板，用引物P5和P6擴(kuò)增Mdc-Linker特異片段。向0.2mlEppendorf管中逐項(xiàng)加入下表所列成分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Eppendorf管置入DNA擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為98°C10sec，68°C30sec，循環(huán)30次。采用北京TIANGEN公司的TIANgelMidiPurificationKit純化PCR產(chǎn)物。(3)PCR擴(kuò)增Linker-Hly以質(zhì)粒Hly/pMD20_T為模板，用引物P7和P8擴(kuò)增Linker-Hly特異片段。向0.2mlEppendorf管中逐項(xiàng)加入下表所列成分<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>_Totalvolume25.0μ1_Eppendorf管置入DNA擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為98°C10sec，68°C30sec，循環(huán)30次。采用北京TIANGEN公司的TIANgelMidiPurificationKit純化PCR產(chǎn)物。(4)利用Gene-SOEing技術(shù)，通過(guò)三步法構(gòu)建融合基因，具體方法如下第一步以PCR回收產(chǎn)物Mdc-Linker、Linker-Hly為模板，由于Mdc-Linker的3，端和Linker-Hly的5’端具有部分重疊鏈，在擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸從而將兩段基因拼接起來(lái)，合成全長(zhǎng)的融合蛋白基因。第二步再以引物P5和P8進(jìn)行大量擴(kuò)增。第三步用TaKaRaTaq聚合酶為融合基因加上PolyA尾，以利于下一步的TA克隆。PCR反應(yīng)體系及條件如下向0.2mlEppendorf管中逐項(xiàng)加入下表所列成分_5XPrimeSTARBuffer(Mg2+pIus)5.Oμ1dNTPMixture(2.5mmol/Leach)2.Oμ1SterileH2O12.75μ1Mdc-Linker2.Oμ1Linker-Hly2.Oμ1PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5units/y1)0.25μ1_Totalvolume24.0μ1_Eppendorf管置入DNA擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為98°C10sec，68°C30sec，循環(huán)10次。取出Eppendorf管加入_P5Primer(10μM/L)0.5μ1_Ρ8Primer(10μM/L)0.5μ1_Eppendorf管置入DNA擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為98°C10sec，68°C40sec，循環(huán)30次。取出Eppendorf管加入_TaKaRaTaq(5units/μ1)0.125μ1_Eppendorf管置入DNA擴(kuò)增儀中，72°C延伸20min。用TIANgelMidiPurificationKit回收，純化PCR產(chǎn)物。將目的片段克隆入pMD20-T載體，得到重組質(zhì)粒Mdc-hly/pMD20-T,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5□，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR鑒定、酶切鑒定及DNA測(cè)序分析后，表明獲得融合基因中Mdc、Hly及1inker序列、拼接組合的順序及方向完全正確，說(shuō)明融合基因重組成功。3融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建(圖3、圖4)將重組質(zhì)粒Mdc-hly/pMD20-T和表達(dá)載體pET32a分別用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII進(jìn)行雙酶切，然后用T4連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε.coliBL21，轉(zhuǎn)化菌種涂于含有氨芐青霉素的平板，培養(yǎng)1618h后，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定及DNA測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明融合基因表達(dá)質(zhì)粒Mdc-hly/pET32a構(gòu)建成功。4重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物分析鑒定(參見(jiàn)圖5、圖6)將純化的Mdc_hly/pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已制備好的E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取pET32a/Mdc-hly陽(yáng)性單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中(lwt%的蛋白胨，0.5wt%的酵母抽提粉，85mmol/L的氯化鈉)，37°C、220rpm振搖812h，然后將此菌液按1100比例接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振搖至0D_約0.6時(shí)，加入終濃度為1.Ommol/L的異丙基-口-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)46h。離心收集菌細(xì)胞加入1XSDS-PAGEBuffer(50mMTris-HClpH6.8,IOOmMDTT,2wt%SDS,0.酚藍(lán)，10wt%甘油)，煮沸5min，離心，取上清加樣。制作6體積％的濃縮膠，15體積％的分離膠，電泳電壓濃縮膠80V，分離膠120V。電泳結(jié)束后，凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色、掃描分析，因融合蛋白含187個(gè)氨基酸，理論分子量約為20.13KD，而載體pET32a具有Trx標(biāo)簽蛋白，分子量約為ISkDa因此表達(dá)的目的蛋白應(yīng)是大約38kDa。SDS-PAGE結(jié)果表明誘導(dǎo)后菌體有明顯表達(dá)條帶與預(yù)期相符，目的蛋白主要是以包涵體的形式存在于超聲裂菌后的沉淀中，約占總不溶性蛋白的82%。由于目的蛋白含有pET32a編碼的6XHis標(biāo)簽，采用鼠源His單克隆抗體為一抗進(jìn)行WesternBlotting,結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的含重組質(zhì)粒表達(dá)菌株在38kDa處有一條特異性條帶而未誘導(dǎo)的沒(méi)有，進(jìn)一步證實(shí)了表達(dá)的蛋白為帶有His標(biāo)簽的目的蛋白5分離純化融合蛋白Mdc_hly(圖5)按最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件誘導(dǎo)表達(dá)基因工程重組菌1000ml，離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破菌，4°C14000rpm離心30min，收集沉淀。用包涵體溶解液(50mmoL/LTris-HClbuffer,8mmoL/Lurea，PH8.0)溶解包涵體沉淀。由于誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白帶有6XHis標(biāo)簽，能與6XHis配體特異性結(jié)合因而可利用GEhealthcare的HisTrapHP和蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行親和層析純化。將變性液離心之后所得上清過(guò)預(yù)平衡的HisTrapHP純化柱，用Bindingbuffer洗去柱子上非特異性蛋白之后進(jìn)行線性洗脫，咪哇濃度范圍為(T500mM，洗脫總體積為柱床的10倍。經(jīng)凝膠掃描分析系統(tǒng)分析純化產(chǎn)物TrX-6HiS-Mdc-hly的純度約為95%。經(jīng)4°C下進(jìn)行梯度透析逐步去除變性劑，得到的復(fù)性蛋白用重組Enterokinase室溫下酶切16h。酶切后的蛋白混合溶液用EnterokinaseCaptureKit去除殘留腸激酶，濾液再過(guò)HisTrapHP柱去除N端Trx標(biāo)簽，收集穿透液，用U-Tubeconcentrator超濾除鹽濃縮。最終，每升發(fā)酵菌液得到純度為95%的融合蛋白Mdc-hly約21.4mg。實(shí)施例2融合蛋白Mdc-hly的抑菌活性分析采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定金黃色葡萄球菌(S.aureuS)ATCC25923，溶壁微球菌(M.lysodeikticus)CICC23645,枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ATCC6633,和大腸±矣希氏菌(E.coli)ATCC25922,銅綠假單孢菌(P.aeruginosa)ATCC27853,沙門氏菌(S.paratyphi-B)CICC21495的MIC值。將Mdc、Hly、Mdc-hly分別用sterileMilli-Qwater倍比稀釋至終濃度為200，100，75，50，25，12.5,6.25,3.121.56,0.78，and0.39uM。分別接種單菌落至MuellerHinton(簡(jiǎn)稱M_H)培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后，按1100接種于新鮮M-H培養(yǎng)液，35°C培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)數(shù)，并以M-H培養(yǎng)液調(diào)整濃度至2X106CFU/ml(colonyformingunitsperml)。取無(wú)菌96孔板，于各孔中分別加入新鮮配制的菌液100微升，再分別加入倍比稀釋的Mdc，Hly,Mdc-hly溶液100微升。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以sterileMilli-Qwater水100微升代替蛋白溶液，而陰性對(duì)照為蛋白溶液不含菌液。各藥敏板于37°C培養(yǎng)16-20h。各試驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)組無(wú)菌生長(zhǎng)的最小稀釋度所對(duì)應(yīng)的濃度為最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1融合蛋白及其親本蛋白的最小抑菌濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注a是ND(inhibitoryactivitywasnotdetected)如表1所示，Mdc對(duì)6種測(cè)試菌株的MIC范圍為0.78μM到50μΜ，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽(yáng)性菌更敏感。Hly對(duì)3種革蘭氏陽(yáng)性菌的MIC范圍為1.56μΜ到12.5μΜ，對(duì)3種革蘭氏陰性菌在測(cè)試濃度范圍內(nèi)均無(wú)殺菌作用。而融合蛋白對(duì)6種菌株，包括革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的殺菌活性(MIC范圍為0.39μM到25μΜ/1)，其中Ε.coli最敏感，Μ.Iysodeikticus和S.paratyphi-B其次。相比其親本蛋白，融合蛋白Mdc-hly的抗菌譜更廣，抗菌活性也有顯著增強(qiáng)。權(quán)利要求一種家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含家蠅天蠶素的成熟肽序列，多肽接頭序列和人溶菌酶的成熟肽序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述多肽接頭序列為(GGGGS)n，其中η是大于或等于1的整數(shù)，G表示甘氨酸殘基，S表示絲氨酸殘基。4.權(quán)利要求廣3所述家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟設(shè)計(jì)引物，序列如SEQIDNO:2飛所示，擴(kuò)增后的序列通過(guò)重疊延伸拼接法得到融合蛋白基因序列以構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)融合蛋白的工程菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)和分離純化，得到家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)家蠅天蠶素和人溶菌酶成熟肽序列的克隆設(shè)計(jì)引物，序列如SEQIDNO:6、所示，前兩段引物擴(kuò)增家蠅天蠶素成熟肽基因序列，后兩段引物擴(kuò)增人溶菌酶成熟肽基因序列，將所得兩段序列分別克隆入PMD20-T載體，得到相應(yīng)的家蠅天蠶素重組質(zhì)粒和人溶菌酶重組質(zhì)粒；(2)融合基因重組分別以步驟(1)所述兩個(gè)重組質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物序列如SEQIDNO:2飛所示，用兩對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物通過(guò)重疊延伸拼接法得到融合蛋白基因序列，將該序列克隆入PMD20-T載體，得到重組質(zhì)粒，所述融合蛋白基因全序列如SEQIDNO10所示；(3)將步驟(2)所得重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pET32a經(jīng)酶切連接后，得到家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白基因重組表達(dá)質(zhì)粒；(4)將家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選，挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體進(jìn)行超聲破碎，經(jīng)分離純化，得到家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白。6.權(quán)利要求廣3所述家蠅天蠶素_人溶菌酶融合蛋白在制備抗菌或抑菌藥物中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求廣3所述家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白在制備防腐劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白的序列如SEQIDNo.1所示。該融合蛋白包含家蠅天蠶素的成熟肽序列，多肽接頭序列和人溶菌酶的成熟肽序列。本發(fā)明根據(jù)家蠅天蠶素和人溶菌酶基因序列，以大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)合成引物，通過(guò)重疊延伸拼接(SOE)法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到融合蛋白基因序列以構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)融合蛋白的工程菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)和分離純化，得到本發(fā)明家蠅天蠶素-人溶菌酶融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白融合了家蠅天蠶素和人溶菌酶各自的特點(diǎn)，具有較為明顯的抑菌、抗菌活性，可用于制備抗菌或抑菌的藥物，有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K38/47GK101817883SQ20101012596公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2010年3月12日優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日發(fā)明者盧雪梅,吳強(qiáng),曾愛(ài)華,朱家勇,李小波,梅寒芳,王艷,肖明珠,褚夫江,金小寶,馬艷申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院