專利名稱：甲苯酚三聚體類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及苯酚三聚體類化合物以及用擴(kuò)張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006，保藏編號是CCTCC M 2010022)制備甲苯酚三聚體類化合物的方法；本 發(fā)明還涉及該類化合物在制備細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術(shù)：
關(guān)于甲苯酚三聚體類化合物的研究尚未見報(bào)道，有研究者在2007年報(bào)道了新穎 的甲苯酚二聚體，他們是從昆蟲致病性真菌Cordyc印s sp. BCC 1861分到該類化合物，顯 示了 良好的細(xì)胞毒禾口抗病毒活性(Rukachaisirikul, V ；Kaeobamrung, J ；Panwiriyarat, ff；Saitai, P ；Sukpondma, Y ；Phongpaichit, S ；Sakayaroj, J. New Diphenyl Ethers from the Insect Pathogenic Fungus Cordyceps sp.BCC 1861.Chem. Pharm. Bull. 2007,55(2) 304-307)。而關(guān)于甲苯酚三聚體及其生物活性未見任何報(bào)道。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張青霉 菌 091006 (Penicillium expansum 091006，保藏編號是CCTCC M 2010022)的液體發(fā)酵產(chǎn) 物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細(xì)胞周期抑制活性，遂對其活性成分進(jìn)行了研究，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)了 6個(gè)新的甲苯酚三聚體類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見任何對這6個(gè)化合物 的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有細(xì)胞增值抑制以及直接殺傷癌細(xì)胞等抗腫 瘤活性的新化合物。本發(fā)明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細(xì) 胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。本發(fā)明首次從發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的甲苯酚三聚體類化合物，如式I、式II、 式III所示 其結(jié)構(gòu)特征是式I、式II、式III化合物的基本骨架為甲苯酚三聚體，其中隊(duì)為 氫、烴基、酰基，r2、R3為氫、烴基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。優(yōu)選的本發(fā)明化合物是所述的式I化合物1 4及式II化合物5、6的Ri、R2均為 氫，R3分別為
上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物是由紅樹植物(海漆)共生真菌一擴(kuò)張青霉 091006 (Penicillium expansum091006)的液體發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚、石油 醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫。氯仿-甲醇98 2的洗脫物，再經(jīng)S印hadex LH-20(氯仿-甲醇1 1)，再經(jīng)制備HPLC，以甲醇-水85 15洗脫分別得到化合物1 6。本發(fā)明采用MTT法測試了式I、式II化合物對HL-60、和A549細(xì)胞株的抗腫瘤活 性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，式I、式II化合物對HL-60腫瘤細(xì)胞有較好的增殖抑制作用，對A549也有一 定增殖抑制作用。因此本發(fā)明的式I、式II、式III化合物可用作細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷 劑。式I、式II、式III化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗 腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。式I、式II、式III化合物還可作為抑制細(xì)胞增殖的低分子生物探針用于生命科學(xué) 研究，作為探針應(yīng)用時(shí)，式I、式II、式III化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二 甲基亞砜的含水溶液中加以應(yīng)用。本發(fā)明的式I、式II、式III化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離 純化而得到；也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)修飾方法合成獲得。需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I、式II、式III化合物的方法 可采用其它任何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為 生產(chǎn)菌用于制備式I、式II、式III化合物。本發(fā)明的實(shí)施例中列舉了利用擴(kuò)張青霉菌 (Penicillium expansum)091006制備本發(fā)明式I、式II、式III的優(yōu)選化合物的實(shí)例，但本 發(fā)明制備的新化合物不只局限于本實(shí)施例中該化合物的制備方法和應(yīng)用實(shí)例。該擴(kuò)張青霉菌(Penicillium expansum)091006系從海南文昌頭苑紅樹植物海漆 的根部分離得到的一株共生真菌，并經(jīng)分類學(xué)研究鑒定為擴(kuò)張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)。該菌株已于2010年01月21日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保 藏編號:CCTCC M 2010022)。該擴(kuò)張青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下形態(tài)學(xué)特征菌落 平坦鋪展，粉狀，略顯絮狀，有時(shí)集成殼狀，中間稍突起，12-14天直徑3-4厘米，暗粉色， 漸轉(zhuǎn)為暗黃綠色，反面淡黃色轉(zhuǎn)為深褐色；分生孢子梗100-120X500-750微米，壁光滑， 單生，間或有成束的；掃狀枝長而排列不松散，一般在下部分枝1-2次；間枝3-6個(gè)，一般 10-15 X 2-3為微米，梗基3-5微米，小梗5-7，3-6微米，一般不做披針形；分生孢子橢圓形， 3-5微米，孢子結(jié)成鏈珠狀，長而糾結(jié)。該擴(kuò)張青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下生理生化特征菌株 可以同化葡(萄)糖胺、D-樹膠醛醣、樹膠醛醣、楊梅苷、赤藻糖醇、葡(萄)糖酸、葡萄糖 磷酸鹽、葡(萄)糖醛酸、丙三醇、葡(萄)糖酸、L-鼠李糖、核糖、柳醇、D-戊醛糖、氨基-丁酸、羥基丁酸、羥基丁酸、對羥苯基乙酸、金雞納酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、 L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸、L-天(門)冬氨酸、L-谷氨酸、L-鳥氨酸、 L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、2-氨基乙醇。該擴(kuò)張青霉(Penicillium expansum)菌株091006具有如下分子生物學(xué)特征其 18S rRNA基因序列信息為(基因的GenBank號為DQ401105)CTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCAGACCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAATGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGGGTCATCATAGAATCCCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTATCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGATTCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCGTTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCTGAAGTCGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCCTTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTAAT(KBr)vmax :3300、2960、2850、1600、1580、1508、1460、1380、1285、1100、1015、985、 840cm—1 ；1H及13C NMR數(shù)據(jù)分別見表1和表2?；衔?，無色油狀物，HRESIMS :m/z 469. 2357 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm(log e ) 272(4. 15)nm ；IR(KBr) vmax :3300、2958、2850、1590、1500、1445、1385、255、1165、1072、980、 845CHT1 ；1H及13C_NMR數(shù)據(jù)分別見表1和表2?；衔?，無色油狀物，HRESIMS :m/z 469. 2351 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm (log e ) 272(3. 56) ；IR(KBr)vmax :3360、2980、2850、1600、1505、1430、1385、1255、1160、1005、950、 840CHT1 ；H及13C-NMR數(shù)據(jù)分別見表1和表2?；衔?，無色油狀物，HRESIMS m/z 469. 2350 [M+Na]+ ；UV A max (MeOH) nm(log e ) 272(3. 88) ；IR(KBr)vmax :3350、2960、2910、1595、1500、1440、1380、1287、1166、1019、980、 850cm"1 ；1H及13C-NMR數(shù)據(jù)分別見表1和表2。
表1.化合物1 6的1H NMR婁t據(jù)(600MHzin CH3COCH3"d6)
aRecorded inCDC13
表2.化合物1 6的13C匪Ri改據(jù)(150MHzin CH3COCH3"d6)
Recorded in CDC具體實(shí)施例方式在如下的實(shí)施例中所指的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué) 結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)式I、式II化合物，其中氏為氫、烴基、酰基，R2、R3為氫、烴基、氨基、 羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
式I式II其中式I化合物1 4和式II化合物4、5的禮、R2均為氫，R3分別為實(shí)施例1化合物1 6的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，擴(kuò)張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)適量，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。取斜面培養(yǎng)4天的擴(kuò)張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)適量，接 種到裝有150mL培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成甘露醇2.0%、麥芽糖2.0%、葡萄糖1.0%、KH2P04 0. 05%,MgS047H20 0. 03%、酵母膏 0. 3%、味精 1. 0%、玉米漿0. 1%、海水素 3. 3%、pH 6. 5) 的500mL錐型瓶中，在28°C、120轉(zhuǎn)/分條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時(shí)，獲得種子培養(yǎng)液。將該種 子培養(yǎng)液按5%接種量分別接種于裝有300毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成同上)的1000mL 三角燒瓶中，于25°C靜置，進(jìn)行為期30天的生產(chǎn)發(fā)酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮， 所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減 壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共20克。3化合物的分離精制浸膏(20克)甲醇溶解后，加60克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn) 品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進(jìn) 行梯度洗脫，分為9個(gè)流份。組分5 (氯仿-甲醇98 2洗脫物)，經(jīng)S印hadex LH-20 (氯 仿-甲醇1 1)，再經(jīng)HPLC，以甲醇-水85 15洗脫得化合物1 6?；衔?，無色油狀物，[a ]2°D+4. 3(c 0. 09, MeOH) ；HRESIMS :m/z 501. 2636[M+Na]+ ；UV(MeOH)入 max(log e ) :274(3. 55)nm ；IR(KBr)vmax :3380、2950、2850、 1600、1508、1476、1380、1268、1154、1101、980011-1 ；1H 及 13C NMR 數(shù)據(jù)分別見表 1 和表 2。化合物2，無色油狀物，[a ]2°D+7. 3(c 0. 03, MeOH) ；HRESIMS :m/z 487. 2442[M+Na]+ ； UV (MeOH)入 max(log e ) :272(4. 00) nm ； IR(KBr)vmax :3400、2980、2860、 1595、1500、1470、1385、1287、1100、980、85001^ ；1H and 13C_NMR 數(shù)據(jù)分別見表 1 和表 2?；衔?，無色油狀物，HRESIMS m/z 469. 2359 [M+Na]+;UV 入 max(Me0H)nm(log ￡ ) 272(3. 76) ；IR
實(shí)施例2抗腫瘤活性的測試1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實(shí)施例1中分離精制的純品化合物1、2、3、 5。準(zhǔn)確稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供活性測試。細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)活性測試采用A549和HL-60細(xì)胞系。各種細(xì)胞均用含 10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37°C通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細(xì)胞增殖抑制活性測試方法(MTT法)本發(fā)明采用MTT法，測試評價(jià)了被測試樣品對癌細(xì)胞增殖的抑制活性。活細(xì)胞 線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5_ 二甲基噻唑)-2，5_ 二苯基四氮唑?yàn)?藍(lán)紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通過酶標(biāo)儀測定其吸收度求得。由于 formazan的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細(xì)胞的數(shù)目，從而了解藥物抑 制或殺傷腫瘤細(xì)胞的能力?；钚詼y試時(shí)，取對數(shù)生長期的A549和HL60細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制 成密度為每毫升5 X 104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200 u L接種于96孔板中，在37°C下培 養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入2 y L不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。然后加入20y L含 MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培養(yǎng)4小時(shí)，移出150 y L培養(yǎng)液后加入150 u L DMS0溶 解formazan，在540nm處測定其吸收度。按照IR%= (0D s自對照-0D樣)/0D s自對照X 100 % 式計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR% )。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3.化合物1 3、5的對人腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性(IC5(1，u M) a由于量的原因，化合物4、6未進(jìn)行活性測試。3 結(jié)論化合物1、2、3、5對人來源的癌細(xì)胞具有抗腫瘤作用。其中化合物2對HL-60、A549 細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，因此，本發(fā)明的式I、式II、式III化合物可作為抗腫瘤劑(即 抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細(xì)胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現(xiàn) 象本質(zhì)的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中。
權(quán)利要求
式I、式II、式III化合物其中R1為氫、烴基、?；琑2、R3為氫、烴基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。FSA00000035960800011.tif
2.權(quán)利要求1所述的式I化合物，其中化合物1-4的禮、R2均為氧，R3分別為
3.權(quán)利要求1所述的式II化合物，其中化合物5、6的禮、R2均為氧，R3分別為
4.權(quán)利要求1所述的式III化合物。
5.權(quán)利要求2、3、4所述式I、式II、式III化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)擴(kuò)張 青霉真菌(Penicilliumexpansum) 091006，獲取含有上述式I、II化合物的發(fā)酵物，然后從 發(fā)酵物中分離純化出式I化合物1 4，式II化合物5、6。
6.權(quán)利要求5所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚、石油 醚-氯仿、氯仿-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，氯仿-甲醇98 2的洗脫物，再經(jīng)S印hadex LH-20柱層析，氯仿-甲醇1 1洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水85 15洗 脫分別得到化合物1 6。
7.權(quán)利要求6所述式I、II、III化合物的制備方法，其中所述甲苯酚三聚體類類化合 物的生產(chǎn)菌是擴(kuò)張青霉菌091006 (Penicillium expansum 091006)，其保藏號為CCTCC M 2010022，其 18S rRNA 基因的 GenBank 號為 DQ401105。
8.權(quán)利要求1所述的式I、II、III化合物在制備細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑中 的用途。
9.權(quán)利要求1所述的式I、II、III化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
10.權(quán)利要求10所述的菌株用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的式I、II、III化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及甲苯酚三聚體類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明用從紅樹植物海漆根部樣品中分離得到的共生真菌-擴(kuò)張青霉(Penicillium expansum)091006生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的上述類型的化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類化合物可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號A61K31/09GK101875601SQ20101012717
公開日2010年11月3日 申請日期2010年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月22日
發(fā)明者付鵬, 劉培培, 盧圳域, 莊以彬, 張志華, 朱偉明, 林海鵬, 洪葵, 王乂 申請人:中國海洋大學(xué);中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所