專利名稱：一種含有抗真菌脂肽的皮膚擦劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種微生物發(fā)酵生產抗真菌脂肽的菌種，及其提 取該抗真菌脂肽制備皮膚擦劑方法。該菌種是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的一株能有效生產抗真菌脂肽的 新菌株，用該菌株發(fā)酵生產抗真菌脂肽可以有效的用于治療皮膚癬病。
背景技術：
脂肽是革蘭氏陽性芽孢桿菌產生的一種次生代謝產物。脂肽的分子是由親水的肽 鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結構，具有生物表 面活性劑的特性，在醫(yī)藥、農業(yè)、食品及化妝品、石油開采和環(huán)境治理等領域有重要的應用 前景，已引起廣泛的關注。另外，大多脂肽數(shù)具有抗微生物作用，也被稱為抗生素。目前發(fā)現(xiàn) 的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬薺素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和 桿菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷月旨菌素(plipstatin)等。1968年Arima等首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B. subtilis)能夠產生抗菌脂肽 surfactin以來，抗菌脂肽產生菌的篩選主要集中在枯草芽孢桿菌的不同菌株之間。近 年來，進一步的研究表明，除枯草芽孢桿菌外，淀粉液化桿菌(B.amyloliquefaciens)、短 小芽孢桿菌(B. pumilus)、地衣芽孢桿菌(B. lichemformis)、蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)、 Bacillusthruingiensis、類芽f包桿菌(Paenibacillus)禾口環(huán)#芽f包桿菌(B. circulan)等 也能產生抗菌脂肽。不同種的菌株可以產生不同或相同的抗菌脂肽，同一種細菌的不同菌 株也能產生幾種不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢桿菌的某些菌株只能產生surfactin，而有些 菌株去口會邑同時產生 surfactin、fengycin 禾口 iturin 或 bacillomycin 禾口 plipastatin。而 且，即使同一種菌株產生的同一種抗菌脂肽也不是純的單一化合物，而是由幾個或許多結 構類似的同系物組成。抗菌肽是通過在細胞膜上形成離子通道造成內容物大量外泄而致細胞死亡。 Christeson等認為，抗菌肽首先通過靜電作用被吸引到膜表面，然后疏水尾部插入細胞膜 中的疏水區(qū)域，通過改變膜構象，多個抗菌肽聚合在膜上形成離子通道，造成細胞內容物 泄露致細胞死亡。Fink等認為只有C端的疏水螺旋插入膜中，而N端的雙親螺旋只結合 在膜表面。JuVVadi(1997)推測抗菌作用的第1步是抗菌肽的陽離子與膜上磷脂基團的 陰離子之間相互作用，再與膜上碳氫化合物互作，然后疏水螺旋插入膜上，聚合形成孔道。 Park(1997)發(fā)現(xiàn)蛙的1種抗菌肽Buforin具有完全不同的抗菌機理，它不裂解細胞膜，而 是穿過膜后與DNA、RNA結合，快速導致細胞死亡。此外，人們還發(fā)現(xiàn)抗菌肽可通過抑制細胞 呼吸、抑制細胞外膜蛋白的合成或抑制細胞壁的形成等機制來殺死細菌。目前對抗菌肽抗 真菌的機理研究較少，Cavallarin (1998)發(fā)現(xiàn)位于Cecropins衍生物N末端螺旋區(qū)域的11 個氨基酸順序與抗真菌活力有關；Lee等(1989)則觀察到真菌受抗菌肽作用后，細胞膜上 有空洞形成，推測其與抑殺細菌的機理類同。本發(fā)明的抗真菌脂肽的殺菌機理主要是使細 胞膜形成離子通道破壞膜結構導致細胞死亡。皮膚癬病皮膚癬屬于致病真菌感染的皮膚疾病，癥狀是皮膚非常痕癢，出現(xiàn)紅疹或小紅斑塊，越搔皮膚越發(fā)紅瘁，患處范圍會進一步擴大。癬患處經常出現(xiàn)在出汗較多的地 方，如腳部、大腿內側等。皮膚癬病和甲癬是常見的淺部真菌病，其中包括足癬、體癬、股 癬、手癬和花斑癬等；甲癬俗稱“灰指(趾)甲”，以上疾病都是由真菌感染引起的，主要是 白色念球菌、紅毛癬菌和須毛癬菌。在我們生活的環(huán)境中和我們的皮膚上都有包括真菌在 內的數(shù)百萬計的微生物的存在，一旦天氣轉暖，有適于真菌生長的條件時，真菌便會乘虛而 入，侵害我們的皮膚，引起皮膚癬病。據(jù)統(tǒng)計，世界上約有1/4的人受到皮膚癬病的困擾。皮 膚癬病還會在人與人之間相互傳染，甚至可以在同一人的不同身體部位間傳染。目前對皮 膚癬病的治療藥物是含酮康唑或克霉唑的軟膏劑，屬于化學合成類藥物，長期使用導致致 病真菌的耐藥性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種微生物發(fā)酵生產抗真菌脂肽的菌種，其分類屬枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl，保藏號為 CGMCCNo. 3412。本發(fā)明的另一個目的是公開了采用CGMCC No. 3412菌種制備抗真菌脂肽的方法。本發(fā)明還一個目的是公開了的采用CGMCC No. 3412菌種發(fā)酵生產的抗真菌脂肽在 抗真菌方面的應用。本發(fā)明還一個目的是公開了采用CGMCC No. 3412菌株制備的抗真菌脂肽提取物。本發(fā)明還一個目的是公開了采用CGMCC No. 3412菌株制備的抗真菌脂肽提取物制 備的涂膜劑。本發(fā)明還一個目的是公開了抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量的測定方法。為 實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開的技術內容如下一種抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) BI1，保藏號為CGMCC No. 3412。本發(fā)明提供的CGMCC No. 3412菌株是一株能生產抗真菌脂 肽的新菌株，用該菌株發(fā)酵糖質原料生產抗真菌脂肽?？拐婢奈⑸锇l(fā)酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(BaCillUSSUbtiliS)BIl，保 藏號為CGMCC No. 3412，保藏日期2009年11月6日。保藏地點中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心。該菌細胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，產生芽孢。在肉湯培 養(yǎng)基平板上菌落呈圓形或不規(guī)則狀，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色。在液體靜止培 養(yǎng)時有菌膜形成。本發(fā)明所述采用CGMCC No. 3412菌株制備的抗真菌脂肽提取物，其特征在于(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質原料5 50g，氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgS04 7H200. 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g， pH 7. 0 7. 2 ;(2)發(fā)酵培養(yǎng)按-10% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培 養(yǎng)溫度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉 /分鐘，發(fā)酵時間30 60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在 6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。發(fā)酵液4°C，10000r/min離心20min去 菌體，得到的除菌發(fā)酵液用6mol/L的HC1調pH至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，10000r/min 離心，20min得到沉淀，處理后得到抗真菌脂肽提取物。
本發(fā)明所述的提取物，其中糖質原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀 粉糖化液、玉米粉糖化液或麩皮糖化液。本發(fā)明所述的提取物，其中氮源原料包括硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰蛋 白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。本發(fā)明公開了一種用于治療真菌病的藥物皮膚擦劑，該皮膚擦劑由抗真菌脂肽提 取物以及藥學上可接受的載體組成。其中的藥物皮膚擦劑為外用皮膚擦劑、乳膏劑、涂膜劑 或酊劑。其中涂膜劑由下列成分組成抗真菌脂肽提取物50 150mg ；藥用乙醇5_15mL ；羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠 漿70 90mL ；藥用甘油5 15mL ；其中的藥用乙醇為無水乙醇。軟膏劑由下列成分組成單甘酯50 150g，硬脂酸50 150g，十八醇50 150g，液狀石蠟50 70mL，丙 三醇40 60mL，三乙醇胺6 10g，抗真菌脂肽0. 5 1. 5g，羥苯乙酯0. 5 1. 5g，蒸餾水 400 650mL ；酊劑由下列成分組成抗真菌脂肽提取物500mg，無水乙醇100mL，藥用甘油25 35mL，氮酮1 2mL，蒸 餾水20 45mL。本發(fā)明同時公開了述治療真菌病涂膜劑的制備方法，其特征在于將抗真菌脂肽lg 溶于100mL藥用乙醇中，取該乙醇溶液5 15mL，加入到70 90mL羧甲基纖維素鈉和海藻 酸鈉膠漿中，攪拌均勻，再加入藥用甘油5 15mL，攪拌均勻即可；其中羧甲基纖維素鈉和 海藻酸鈉膠漿的制備在容器中加入100 200mL無菌蒸餾水，然后加入1 2g羧甲基纖 維素鈉和2 4g海藻酸鈉，攪拌，加熱至60°C 80°C，在轉速為60 120rpm的條件下攪 拌至羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉完全溶解，最后冷卻至室溫，得到羧甲基纖維素鈉和海藻 酸鈉膠漿。本發(fā)明也可以分步進行即首先采用CGMCC No. 3412菌株制備抗真菌脂肽，然后 再制備抗真菌脂肽提取物同時測定抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽的含量，具體包括(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質原料5 50g，氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgS04 7H200. 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g， pH 7. 0 7. 2 ;(2)發(fā)酵培養(yǎng)按-10% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培 養(yǎng)溫度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉 /分鐘，發(fā)酵時間30 60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在 6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。(3)將進一步控制發(fā)酵液溫度在4°C，10000r/min,離心20min去菌體，得到的除菌 發(fā)酵液用6mol/L的HC1調pH至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，lOOOOr/min離心，20min得 到沉淀，將沉淀刮下與適量的甲醇，充分抽提，蒸發(fā)去掉甲醇，得到的褐色油狀固體即為抗 真菌脂肽提取物。本發(fā)明進一步公開了抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量的檢測方法將1克抗真菌脂肽提取物溶于100mL無水乙醇中，10000r/min離心20min棄去沉淀，上清液用0.45 iim的濾膜過濾除去雜質。利用Hydrosphere C18分析柱 (4. 6mmX 250mm)，流動相A為含有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液，流動相比例A B = 45 55(體積比)；流速0. 5mL/min ；檢測波長265nm ； 每次進量為10 y L，測定抗真菌脂肽提取物中真菌脂肽的含量；測定結果表明抗真菌脂肽 提取物中真菌脂肽純度為85% -98% (w/v)。本發(fā)明進一步還公開了抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株在發(fā)酵生產抗真菌脂肽用于 制備治療皮膚癬病方面的應用。本發(fā)明更加詳細的描述如下(1)微生物菌株的篩選與鑒定本發(fā)明中，建立了一個快速有效的篩選高產抗真菌脂肽菌株的方法，根據(jù)產抗真 菌脂肽菌株的細胞產物特點，設計以白色念球菌為指示菌的YEPD平板，挑選抑菌圈直徑大 的菌株，即為產抗真菌脂肽較好的菌株。本發(fā)明從從青貯秸稈飼料中取樣，采用肉湯培養(yǎng)基30°C富集培養(yǎng)2-3次，再涂布 于白色念球菌為指示菌的YEPD選擇性平板，挑選抑菌圈直徑大的菌株，經過對多個青貯秸 稈飼料樣品的大量菌株篩選工作，從分離出來的近數(shù)百株細菌中初步篩選出近30株具有 抗白色念球菌的菌株，最后復篩得到抑菌圈直徑達2cm以上，經15次傳代后遺傳穩(wěn)定性好 的菌株BI1菌株。本發(fā)明篩選得到的能抑制白色念球菌的菌株BI1，經16S rDNA基因序列測定與以 公布的枯草芽孢桿菌16S rDNA基因序列相似性達99.7%，BI1菌株能氧化葡萄糖產酸，需 氧，V-P反應呈陽性，能還原硝酸鹽和水解淀粉(表1)，BI1菌株的生理生化特征均與布坎 南和吉本斯等(1984)編著的《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和東秀珠、蔡妙英(2001)編著的 《常見細菌鑒定手冊》中描述的枯草芽孢桿菌相同。認為屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)，芽 孢桿菌屬(Bacillus)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl專利保存號CGMCC3412。 該菌細胞為桿狀，革蘭染色均勻，且為陽性，產生芽孢。在肉湯培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形或 不規(guī)則狀，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色。在液體靜止培養(yǎng)時有菌膜形成。表1芽孢桿菌BI1和標準枯草芽孢桿菌生理生化特征比較 注“ + ”代表陽性，“ _ ”代表陰性本發(fā)明菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BIl的抑菌圖譜見表2。表2BI1的抑菌譜
芽孢桿菌BI1對絲狀真菌均有拮抗作用，而對細菌及非絲狀的酵母菌沒有作用。 表明BI1對絲狀真菌有專一性的抑制作用。
(2)微生物菌株的培養(yǎng)與生產抗真菌脂肽的發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10. 0，牛肉膏5. 0，NaCl 5. 0，pH7. 2 7. 4 ；固體培養(yǎng)基 需加20. 0瓊脂。YEPD培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨20. 0，酵母粉10. 0，葡萄糖20. 0 ；固體培養(yǎng)基需加20. 0瓊脂。斜面和種子培養(yǎng)基的組成(g/L):葡萄糖1 3，胰蛋白胨5 10，酵母浸出粉 3 6，NaCl 6 12，去離子水配制，pH 7. 2 7. 5 ；固體培養(yǎng)基需加15g瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)糖質原料5 50g，氮源2 20g，檸檬酸鈉1 3g， MgS04 7H200. 1 0. 2g, K2HP042 6g，KH2P043 9g，pH 7. 0 7. 2。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培 養(yǎng)基的滅菌溫度為113 121°C，20min。將該菌株BI1自斜面接菌于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30 40°C、 140r/min搖床培養(yǎng)12 16h。按(v/v)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培 養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m3/h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度 100-150轉/分鐘，發(fā)酵時間30 60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā) 酵液pH在6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。純度為85% 98% (w/v) 0(3)抗真菌脂肽的提取將發(fā)酵液4°C，10000r/min離心20min去菌體，得到的除菌發(fā)酵液用6mol/L的HC1 調pH至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，10000r/min離心20min得到沉淀，將沉淀刮下與適量 的甲醇，充分抽提，蒸發(fā)去掉甲醇，得到的褐色油狀固體即為抗真菌脂肽提取物。(4)抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽的含量測定將1克抗真菌脂肽提取物溶于lOOmL無水乙醇中，10000r/min離心20min 棄去沉淀，上清液用0.45 iim的濾膜過濾除去雜質。利用Hydrosphere C18分析柱 (4. 6mmX 250mm)，流動相A為含有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液，流動相比例A B = 45 55(體積比)；流速0. 5mL/min ；檢測波長265nm ； 每次進量為10PL，測定結果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽純度為85% 98% (w/ v) o本發(fā)明用于發(fā)酵的糖質原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉、麩皮 糖化液。本發(fā)明用于發(fā)酵的氮源可以是硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋 白胨、酵母粉、牛肉膏、大豆粉。(5)含抗真菌脂肽的涂膜劑制備羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿的制備在容器中加入100 200mL無菌蒸餾水， 然后加入1 2g羧甲基纖維素鈉和2 4g海藻酸鈉，放在磁力攪拌器中加熱至60°C 80°C，在轉速為60 120rpm的條件下攪拌至羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉完全溶解，最后冷 卻至室溫，得到羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿。配制成品將抗真菌脂肽含量為85% 90% (w/v)的抗真菌脂肽提取物lg溶于 100mL無水乙醇中，取該乙醇溶液5 15mL，加入到70 90mL羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉 膠漿中，再加入藥用甘油5 15mL，攪拌均勻即可。本發(fā)明進一步公開了采用CGMCC No. 3412菌種發(fā)酵生產的抗真菌脂肽在抗真菌方面的應用以及不同原料糖化液發(fā)酵產脂肽的情況。1.將正常的白色念珠菌和經過BIl發(fā)酵提取的抗真菌脂肽處理的白色念珠菌，用 原子力顯微鏡掃描成像，見圖1和圖2。由圖1可以看出，未被處理的白色念珠菌表面非常 光滑。而被脂肽處理過的白色念珠菌(見圖2)，在原子力顯微鏡下觀察，表面有明顯的凹 陷及穿孔。有研究表明，脂肽是作用于菌體細胞膜，使細胞膜的通透性改變而發(fā)揮抗菌活性 的。因此推測，脂肽可能改變白色念珠菌細胞膜的通透性，使細胞內物質外泄，導致菌體死 亡。2.以裸皮小白鼠于皮膚表面接種白念球菌純培養(yǎng)稀釋液，連續(xù)接種三天，每天接 種一次。觀察裸皮小白鼠皮膚接種處表面出現(xiàn)紅斑或鱗屑狀損害，用含有本發(fā)明的真菌脂 肽涂抹劑與2%克霉唑軟膏作病例治療對比試驗，早中晚3次/天涂于患處皮膚。2.將3g/L蔗糖、麥芽糖、果糖代替3g/L葡萄糖，接入培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌BIl 種子，發(fā)酵60h，提取發(fā)酵液中抗真菌脂肽。結果如表3。表3枯草芽孢桿菌以不同糖發(fā)酵產脂肽結果 3.將20g/L可溶性淀粉糖化液、玉米粉糖化液、麩皮糖化液代替3g/L葡萄糖，接入 培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌BIl種子，發(fā)酵60h，提取發(fā)酵液中抗真菌脂肽。結果如表4。表4枯草芽孢桿菌以不同原料糖化液發(fā)酵產脂肽結果 本發(fā)明公開的技術內容與現(xiàn)有技術相比所具有的積極效果表現(xiàn)在以下方面1、發(fā)現(xiàn)了一株產抗真菌脂肽的新菌枯草芽孢桿菌BI1，其代謝產物抗真菌脂肽只 對絲狀真菌有抗性，對細菌和乳酸菌沒有抑菌活性，因此作為皮膚擦劑既可以殺滅致病真 菌，又不破壞皮膚表面存在的益生細菌。2、枯草芽孢桿菌BI1，其代謝產物抗真菌脂肽產量較高達到l_2g/L。3、枯草芽孢桿菌BI1，發(fā)酵產抗真菌脂肽所需碳源和氮源較廣泛，其中多數(shù)為農產 品加工副產無，因此生產原料成本低。4、抗真菌脂肽涂膜劑制備方法簡單，無毒性。涂抹在皮膚上易成膜，附著力強，膜 彈性好且不易脫落，能使藥物長時間發(fā)生作用。


圖1為正常的白色念珠菌表面形態(tài)；圖2經脂肽處理過的白色念珠菌形態(tài)。
1具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當?shù)氖÷粤斯夹g的描述，以免那些不必要的 細節(jié)影響對本技術方案的描述。以下結合較佳實施例，對本發(fā)明做進一步的描述。實施例1(1)微生物菌株的培養(yǎng)與產抗真菌脂肽的發(fā)酵斜面和種子培養(yǎng)基的組成(g/L):葡萄糖3，胰蛋白胨5，酵母浸出粉6，NaCl 6，去 離子水配制，7. 5 ；固體培養(yǎng)基需加15g瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)糖質原料(葡萄糖)5g，氮源(硝酸銨)15g，檸檬酸鈉 lg, MgSO4 · 7Η200· 5g，K2HP042 6g，KH2P045g, pH 7· 0 7· 2。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的 滅菌溫度為115，20min。(2)將該菌株BIl自斜面接菌于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，40°C、 140r/min搖床培養(yǎng)16h。按2% (ν/ν)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度40°C，發(fā)酵通氣量為8m3/h，罐壓0. 05MPa，攪拌速度100-150轉/分鐘，發(fā)酵時間60小 時。酵過程通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液的PH在7，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為 1. 5L。(3)將進一步控制發(fā)酵液溫度在4°C，10000r/min,離心20min去菌體，得到的除菌 發(fā)酵液用6mol/L的HCl調pH至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，lOOOOr/min離心，20min得 到沉淀，將沉淀刮下與適量的甲醇，充分抽提，蒸發(fā)去掉甲醇，得到的褐色油狀固體即為抗 真菌脂肽提取物。(4)將1克抗真菌脂肽提取物溶于IOOmL無水乙醇中，10000r/min離心20min 棄去沉淀，上清液用0.45μπι的濾膜過濾除去雜質。利用Hydrosphere C18分析柱 (4. 6mmX 250mm)，流動相A為含有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液，流動相比例A B = 45 55(體積比)；流速0. 5mL/min ；檢測波長265nm ； 每次進量為10 μ L，測定結果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽純度為89% (w/v)。實施例2(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖5g，氮源 硫酸銨 2g，檸檬酸鈉 3g，MgSO4 · 7H200. 2g，K2HP042g，KH2P043g，pH 7. 0 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按10% (ν/ν)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度30°C，發(fā)酵通氣量為13m3/h，罐壓0. 03MPa,攪拌速度120轉/分鐘，發(fā)酵時間30h，發(fā)酵 過程中通入無菌空氣，用氨水維持發(fā)酵液PH在7. 5，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌溫度 為12rC，20min。發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為1. 5g/L。(3)將進一步控制發(fā)酵液溫度在4°C，10000r/min,離心20min去菌體，得到的除菌 發(fā)酵液用6mol/L的HCl調pH至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，lOOOOr/min離心，20min得 到沉淀，將沉淀刮下與適量的甲醇，充分抽提，蒸發(fā)去掉甲醇，得到的褐色油狀固體即為抗 真菌脂肽提取物。(4)將1克抗真菌脂肽提取物溶于IOOmL無水乙醇中，10000r/min離心20min 棄去沉淀，上清液用0.45μπι的濾膜過濾除去雜質。利用Hydrosphere C18分析柱 (4. 6mmX 250mm)，流動相A為含有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液，流動相比例A B = 45 55(體積比)；流速0. 5mL/min ；檢測波長265nm ；每次進量為10 μ L，測定結果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量為90% (w/v)。實施例3(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):玉米粉糖化液 3. 5 氮源蛋白胨 15，檬酸鈉 1，MgSO4 · 7Η200· 8，Κ2ΗΡ044，ΚΗ2Ρ046，ρΗ 7. 2。(2)發(fā)酵培養(yǎng)按2% (ν/ν)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 300C，發(fā)酵通氣量為8m3/h，罐壓0. 05Pa,攪拌速度150轉/分鐘，發(fā)酵時間60h，發(fā)酵過程中 通入無菌空氣，用氨水維持發(fā)酵液PH在7. 2發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為1. 4g/L。(3)將進一步控制發(fā)酵液溫度在4°C，10000r/min,離心20min去菌體，得到的除菌 發(fā)酵液用6mol/L的HCl調ρΗ至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，lOOOOr/min離心，20min得 到沉淀，將沉淀刮下與適量的甲醇，充分抽提，蒸發(fā)去掉甲醇，得到的褐色油狀固體即為抗 真菌脂肽提取物。(4)將1克抗真菌脂肽提取物溶于IOOmL無水乙醇中，10000r/min離心20min 棄去沉淀，上清液用0.45μπι的濾膜過濾除去雜質。利用Hydrosphere C18分析柱 (4. 6mmX 250mm)，流動相A為含有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液，流動相比例A B = 45 55(體積比)；流速0. 5mL/min ；檢測波長265nm ； 每次進量為10 μ L，測定結果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽含量為95% (w/v)。實施例4(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCC No. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質原料(糖 化液)40g，氮源(牛肉膏)20g，檸檬酸鈉 3g，MgSO4 · 7H20. lg，K2HP045g, KH2P047g, ρΗ 7. 2 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按8% (ν/ν)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 350C，發(fā)酵通氣量為9m3/h，罐壓0. 09MPa,攪拌速度100轉/分鐘，發(fā)酵時間40小時，發(fā)酵 過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液PH在6. 5 7. 5，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基 的滅菌溫度為125°C，20min，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為2g/L。(3)將進一步控制發(fā)酵液溫度在4°C，lOOOOr/min，離心20min去菌體，得到的除菌 發(fā)酵液用6mol/L的HCl調ρΗ至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，lOOOOr/min離心，20min得 到沉淀，將沉淀刮下與適量的甲醇，充分抽提，蒸發(fā)去掉甲醇，得到的褐色油狀固體即為抗 真菌脂肽提取物。(4)將1克抗真菌脂肽提取物溶于IOOmL無水乙醇中，10000r/min離心20min 棄去沉淀，上清液用0.45μπι的濾膜過濾除去雜質。利用Hydrosphere C18分析柱 (4. 6mmX 250mm)，流動相A為含有0.05%三氟乙酸(TFA)的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液，流動相比例A B = 45 55(體積比)；流速0. 5mL/min ；檢測波長265nm ； 每次進量為10 μ L，測定結果表明抗真菌脂肽提取物中抗真菌脂肽純度為90% (w/v)。實施例5治療真菌病的涂膜劑成分組成抗真菌脂肽提取物150mg ；藥用乙醇15mL;羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿90mL ；藥用甘油15mL ；其中的藥用乙醇為無水乙醇。
制備方法，將抗真菌脂肽Ig溶于IOOmL藥用乙醇中，取該乙醇溶液15mL，加入到 90mL羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿中，攪拌均勻，再加入藥用甘油15mL，攪拌均勻即可； 其中羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿的制備在容器中加入IOOmL無菌蒸餾水，然后加入 2g羧甲基纖維素鈉和4g海藻酸鈉，攪拌，加熱至80°C，在轉速為120rpm的條件下攪拌至羧 甲基纖維素鈉和海藻酸鈉完全溶解，最后冷卻至室溫，得到羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠 漿。實施例6治療真菌病的涂膜劑成分組成抗真菌脂肽提取物50mg ；藥用乙醇5mL;羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿70mL ；藥用甘油5mL;其中的藥用乙醇為無水乙醇。制備方法，將抗真菌脂肽Ig溶于IOOmL藥用乙醇中，取該乙醇溶液10mL，加入到 70mL羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿中，攪拌均勻，再加入藥用甘油15mL，攪拌均勻即可； 其中羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿的制備在容器中加入150mL無菌蒸餾水，然后加入 Ig羧甲基纖維素鈉和4g海藻酸鈉，攪拌，加熱至60°C，在轉速為IOOrpm的條件下攪拌至羧 甲基纖維素鈉和海藻酸鈉完全溶解，最后冷卻至室溫，得到羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠 漿。實施例7含抗真菌脂肽的涂膜劑制備CMC-Na和海藻酸鈉膠漿的制備在容器中加入IOOmL無菌蒸餾水，然后加入 IgCMC-Na和4g海藻酸鈉，放在磁力攪拌器中加熱至60°C，在轉速為120rpm的條件下攪拌 至CMC-Na和海藻酸鈉完全溶解，最后冷卻至室溫，得到CMC-Na和海藻酸鈉膠漿。配制成品將抗真菌脂肽含量為90% (w/v)的抗真菌脂肽提取物Ig溶于IOOmL 無水乙醇中，取該乙醇溶液15mL，加入到70mL CMC-Na和海藻酸鈉膠漿中，再加入藥用甘油 15mL，攪拌均勻即可。實施例8含抗真菌脂肽的軟膏劑制備軟膏劑配方單甘酯50g，硬脂酸150g，十八醇50g，液狀石蠟70mL，丙三醇60mL， 三乙醇胺6g，抗真菌脂肽1. 5g，羥苯乙酯1. 5g，蒸餾水400mL。配制方法油相液將硬脂酸、單甘酯、十八醇于水浴狀態(tài)加熱熔化，再加入液狀石蠟，加熱到 85 "C。水相液另將三乙醇胺、丙三醇與蒸餾水混勻然后加入抗真菌脂肽，加熱至85°C。在85°C熱水浴條件下，將水相液緩緩加入到油相液中，邊加入邊攪拌，直至乳化完 全，從水浴中拿出，放置冷卻即得。實施例9含抗真菌脂肽的酊劑制備
抗真菌脂肽提取物500mg溶于IOOmL無水乙醇中，取該乙醇溶液30 45mL，再加 入藥用甘油35mL，氮酮2mL，蒸餾水45mL，攪拌均勻即可。本發(fā)明在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在不脫 離上述申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實 施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術方案的范圍。且本發(fā)明亦不 受限于說明書中所舉實例的實施方式。
權利要求
一種抗真菌脂肽微生物發(fā)酵菌株，其分類屬枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BI1，保藏號為CGMCC No.3412。
2.一種采用權利要求1所述菌株制備的抗真菌脂肽提取物，其特征在于(1)采用的發(fā)酵菌株為CGMCCNo. 3412，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)糖質原料5 50g， 氮源 2 20g，檸檬酸鈉 1 3g，MgSO4 · 7Η200· 1 0. 2g，K2HP042 6g，KH2P043 9g，pH 7· 0 7· 2 ；(2)發(fā)酵培養(yǎng)按-10%(ν/ν)的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度30 40°C，發(fā)酵通氣量為5 13m7h，罐壓0. 02 0. 09MPa,攪拌速度100-150轉/分鐘， 發(fā)酵時間30 60小時，發(fā)酵過程中通入無菌空氣，用氨水或液堿維持發(fā)酵液pH在6. 5 7. 5，發(fā)酵液中抗真菌脂肽產量為1 2g/L。發(fā)酵液4°C，10000r/min離心20min去菌體，得 到的除菌發(fā)酵液用6mol/L的HCl調pH至2. 0，4°C靜置過夜；次日，4°C，lOOOOr/min離心， 20min得到沉淀，處理后得到抗真菌脂肽提取物。
3.權利要求2所述的提取物，其中糖質原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性 淀粉糖化液、玉米粉糖化液或麩皮糖化液。
4.權利要求2所述的提取物，其中氮源原料包括硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胰 蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、牛肉膏或大豆粉。
5.權利要求2所述抗真菌脂肽提取物在制備治療皮膚癬病藥物方面的應用。
6.一種用于治療皮膚癬病的皮膚擦劑，該皮膚擦劑由權利要求2所述的抗真菌脂肽提 取物以及藥學上可接受的載體組成。
7.權利要求6所述的皮膚擦劑，為外用皮膚擦劑包括軟膏劑、涂膜劑或酊劑。
8.權利要求7所述的皮膚擦劑，其中軟膏劑、涂膜劑或酊劑分別由下列成分組成(1)涂膜劑由下列成分組成抗真菌脂肽提取物50 150mg ；藥用乙醇5-15mL ；羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿 70 90mL ；藥用甘油5 15mL ；其中的藥用乙醇為無水乙醇；(2)軟膏劑由下列成分組成單甘酯50 150g，硬脂酸50 150g，十八醇50 150g，液狀石蠟50 70mL，丙三醇 40 60mL，三乙醇胺6 IOg,抗真菌脂肽0. 5 1. 5g，羥苯乙酯0. 5 1. 5g，蒸餾水400 650mL ；(3)酊劑由下列成分組成抗真菌脂肽提取物500mg，無水乙醇IOOmL,藥用甘油25 35mL，氮酮1 2mL，蒸餾水 20 45mL。
9.權利要求8所述涂膜劑的制備方法，其特征在于將抗真菌脂肽Ig溶于IOOmL藥用 乙醇中，取該乙醇溶液5 15mL，加入到70 90mL羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿中，攪 拌均勻，再加入藥用甘油5 15mL，攪拌均勻即可；其中羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿的 制備在容器中加入100 200mL無菌蒸餾水，然后加入1 2g羧甲基纖維素鈉和2 4g 海藻酸鈉，攪拌，加熱至60°C 80°C，在轉速為60 120rpm的條件下攪拌至羧甲基纖維素 鈉和海藻酸鈉完全溶解，最后冷卻至室溫，得到羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉膠漿。
10.權利要求2所述抗真菌脂肽提取物含量的測定方法，其特征在于將1克抗真菌脂 肽提取物溶于IOOmL無水乙醇中，lOOOOr/min離心20min，棄去沉淀，上清液用0. 45 μ m的濾膜過濾除去雜質，用4. 6mmX250mm Hydrosphere C18分析柱檢測；其中流動相A為含 有0. 05%三氟乙酸的乙腈，流動相B為含有0. 05% TFA的水溶液；流速0. 5mL/min ；檢測 波長265nm，每次進量為10 μ L，測定抗真菌脂肽提取物中真菌脂肽的含量；其中流動相比 例A B的體積比=45 55。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產抗真菌脂肽和其抗真菌脂肽的皮膚擦劑，屬于生物技術領域。具體涉及一種發(fā)酵糖質原料生產抗真菌脂肽的微生物枯草芽孢桿菌BI1(Bacillus subtilis BI1)，保藏號為CGMCCNo.3412，同時本發(fā)明還涉及利用該微生物發(fā)酵生產的抗真菌脂肽提取物和含該提取物的涂膜劑及其涂膜劑的制備方法。采用本發(fā)明的涂膜劑治療皮膚癬病，平均治愈時間7天，治愈率達到100％，為患者治療皮膚癬病提供了一種良好的治療藥物。
文檔編號A61P17/00GK101892177SQ201010129850
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月23日 優(yōu)先權日2010年3月23日
發(fā)明者徐進, 王德培 申請人:天津科技大學