專利名稱：一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種口服生物制劑，特別是一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑。
背景技術：
對蟲下白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV，對蟲下白斑病)引起世 界范圍內養(yǎng)殖對蝦的急性、致死性傳染病，造成對蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大經濟損失，在我國這種情 況尤為嚴重，已成為威脅我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一。1995年，國際獸疫局(0IE)、聯 合國糧農組織(FA0)以及亞太地區(qū)水產養(yǎng)殖發(fā)展網絡中心(NACA)將其列為需要報告的水 生動物病毒性疫病之一。白斑綜合征至今尚無有效的防治措施，是國際上試圖通過攻關重 點解決的技術難題之一。 傳統(tǒng)的早期預防主要針對病原體、蝦體和環(huán)境三因素，從改善養(yǎng)殖環(huán)境、投喂免疫 增強劑提高對蝦抵抗力、切斷可能的傳播途徑等方面著手預防WSSV感染。近年來發(fā)現，無 脊椎動物同樣具有獲得性免疫系統(tǒng)(Kurtz&Franz，2003)，為基于對蝦記憶性免疫的WSSV 防治的探索研究工作奠定了基礎。利用已鑒定的病毒囊膜蛋白設計生物制劑是WSSV防治 的思路之一。Witteveldt et al. (2004)在大腸桿菌中分別構建了 WSSV囊膜蛋白VP19和 VP28重組菌，通過純化注射和混合口服方式免疫健康對蟲下，然后在免疫后不同時間通過浸 泡的方式進行感染，觀測感染后對蝦的死亡情況，發(fā)現VP19、 VP28都具有一定的免疫效果 和抗WSSV持久力，VP28的免疫效果更佳。以家蠶作為生物反應器生產WSSV囊膜蛋白VP19 和VP28，經口免疫動物模型克氏原螯!l!下(Procambarus clarkii)，攻毒后相對存活率分別可 達89. 5%和94. 7% (Xu et al. ，2006)。 Du et al. (2006)利用昆蟲桿狀病毒作為載體在 BmN昆蟲細胞中表達VP28蛋白，對螯蝦進行注射免疫保護效果可達92% 。囊膜蛋白VP19、 VP28在畢赤酵母中表達后將工程菌直接口服免疫螯蝦，其相對死亡率也得到一定程度的降 低，同時以工程菌經口免疫在生產實際中具有一定的可行性(Jha et al. ，2007)。由此， WSSV囊膜蛋白的保護效果比較理想，尤其以VP28設計的重組生物制劑效果最佳。
然而在規(guī)模化養(yǎng)殖水環(huán)境下，重組蛋白保護效果卻不盡人意，尤其通過口服途徑， 抗原在消化道降解、吸收率低等原因造成保護劑量的不足。 近年來，枯草芽孢桿菌逐漸用于藥用蛋白、抗原蛋白的生產，其優(yōu)勢體現為1)高 分泌能力，使得重組表達的藥用蛋白不需要經過下游的純化和分離，也使得分泌的抗原蛋 白能有效遞呈至宿主的免疫系統(tǒng)引起免疫應答；2)將抗原蛋白展示于芽孢外表面，可作為 口服疫苗的應用；3)芽孢耐熱、耐酸及耐鹽的特性，能耐受胃腸道環(huán)境且更利于保存；4)快 速、簡捷的發(fā)酵和生產技術；5)本身為益生菌，若作為疫苗載體可起到佐劑的作用。
VP28重組枯草芽孢桿菌的制備方法在Ling Lin Fu， Wei Fen Li, Hua Hua Du， Wei Dai， Zi Rong Xu. Oral vaccination with envelope protein VP28 against white spot syndromevirus in Procambarus clarkii using Bacillus subtilis as delivery vehicles. LettA卯l Microbiol. 2008,46(5) :581-586 (傅玲琳，對蟲下白斑綜合征病毒囊膜 蛋白VP28枯草工程菌的構建與VP28卵黃抗體的制備及其抗病性研究.浙江大學博士論文，2008)被公開。 殼聚糖也有相關文章告知其有防治對蝦白斑病的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種使用安全且能有效防治對蝦白斑綜合征的 口服生物制劑。 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑，該制 劑的組分和重量含量為1 10%表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和5 50%殼聚糖，其余 為作為載體的玉米淀粉。 作為本發(fā)明的防治對蝦白斑病的口服生物制劑的改進表達VP28的重組枯草芽 孢桿菌的菌含量為109個/克。在本發(fā)明中，表達VP28的重組枯草芽孢桿菌可按照Ling Lin Fu,Wei Fen Li,Hua HuaDu， Wei Dai， Zi Rong Xu. Oral vaccination with envelope protein VP28 against whitespot syndrome virus in Procambarus clarkii using Bacillus subtilis as deliveryvehicles. Lett A卯l Microbiol. 2008， 46 (5) :581-586 (傅玲琳，對蟲下白斑綜合征 病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的構建與VP28卵黃抗體的制備及其抗病性研究.浙江大學 博士論文，2008)進行制備；也可向本發(fā)明的申請人一浙江大學索取。殼聚糖和玉米淀粉 均能通過市購的方式獲得；其中殼聚糖可選用飼料級殼聚糖，玉米淀粉能過80-200目篩。
本發(fā)明的防治對蝦白斑病的口服生物制劑的保藏條件為室溫，有效期為2年。
本發(fā)明的防治對蝦白斑病的口服生物制劑實際使用時，按照占對蝦餌料總重的 0. 1% 1%的比例加入對蟲下佴料中，均勻混合后即可喂食對蟲下。
本發(fā)明的口服生物制劑具有以下優(yōu)點
1)使用方便，可作為飼料添加劑在對蝦飼料中使用；
2)安全性好、無副作用； 3)防治效果好，顯著提高對蝦免疫力和成活率；充分發(fā)揮了表達VP28的重組枯草 芽孢桿菌和殼聚糖的協(xié)同防治作用；
4)生產工藝簡單、成本低、易貯存。
具體實施例方式
下面的實施例有助于本領域技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。 以下％均為重量％。 實施例1、一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑，其由5X的表達VP28的重組枯草 芽孢桿菌、25%的殼聚糖和70%的玉米淀粉(過80-200目篩)組成。表達VP28的重組枯 草芽孢桿菌的菌含量為109個/克。 制備方法為將上述3種成分簡單加以攪拌混合即可。 實驗1、南美白對蝦養(yǎng)殖于25± rC控溫的水泥池中，隨機分成4大組，每組3個重 復，每個重復20只，暫養(yǎng)一周。日投喂量均為對蝦體重的2 % 。 在常規(guī)的對蝦飼料中添加占對蝦飼料總重0.5%的防治對蝦白斑病的口服生物制劑(實施例1所得)喂食南美白對蝦，連續(xù)喂料30天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為試 驗組。 在常規(guī)的對蝦飼料中添加占對蝦飼料總重0. 15%的表達VP28的重組枯草芽孢桿 菌(其有效用量同試驗組中的表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和殼聚糖的用量之和)喂食 南美白對蝦，連續(xù)喂料30天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為對比組1 ;
在常規(guī)的對蟲下飼料中添加占對蟲下飼料總重O. 15%的殼聚糖(其有效用量同試驗 組中的表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和殼聚糖的用量之和)喂食南美白對蟲下，連續(xù)喂料30 天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為對比組2 ; 用常規(guī)的對蝦飼料喂食南美白對蝦33天，作為空白對照組。 33天后，將試驗組、對比組1、對比組2和空白對照組分別用對蝦白斑綜合征病毒 (WSSV) (100倍50%致死量的WSSV)浸泡攻毒，攻毒后連續(xù)觀察10天，記錄死蟲下數，并用PCR 檢測病毒。結果如下 試驗組對蟲下成活率高達96. 7% ，對比組1對蟲下成活率達75. 0% ，對比組2對蟲下成 活率達25. 0%，而空白對照組的對蝦成活率僅為16. 7%。對存活的蝦采用PCR檢測病毒， 結果為試驗組和對比組l PCR檢測病毒均為陰性，而對比組2和空白對照組PCR檢測病毒 均為陽性。 實施例2、一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑，其由10%的表達VP28的重組枯 草芽孢桿菌、50%的殼聚糖和40%的玉米淀粉(過80-200目篩)組成。表達VP28的重組 枯草芽孢桿菌的菌含量為109個/克。
實驗2、 在常規(guī)的對蟲下飼料中添加占對蟲下飼料總重0. 1 %的防治對蟲下白斑病的口服生物制 劑(實施例2所得)喂食南美白對蝦，連續(xù)喂料30天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為試 驗組。 在常規(guī)的對蝦飼料中添加占對蝦飼料總重0. 06%的表達VP28的重組枯草芽孢桿 菌(其有效用量同試驗組中的表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和殼聚糖的用量之和)喂食 南美白對蝦，連續(xù)喂料30天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為對比組1 ;
在常規(guī)的對蟲下飼料中添加占對蟲下飼料總重0.06%的殼聚糖(其有效用量同試驗 組中的表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和殼聚糖的用量之和)喂食南美白對蟲下，連續(xù)喂料30 天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為對比組2 ; 用常規(guī)的對蝦飼料喂食南美白對蝦33天，作為空白對照組。
其余內容同實驗l。結果如下 試驗組對蟲下成活率高達95. 0% ，對比組1對蟲下成活率為70. 0% ，對比組2對蟲下成 活率為18. 3%，而空白對照組的對蝦成活率僅為15. 0%。對存活的蝦采用PCR檢測病毒， 結果為試驗組和對比組l的PCR檢測病毒均為陰性，而對比組2和空白對照組PCR檢測病 毒均為陽性。 實施例3、一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑，其由1X的表達VP28的重組枯草 芽孢桿菌、5%的殼聚糖和94%的玉米淀粉(過80-200目篩)組成。表達VP28的重組枯草 芽孢桿菌的菌含量為109個/克。
實驗3、
5
在常規(guī)的對蟲下飼料中添加占對蟲下飼料總重1 %的防治對蟲下白斑病的口服生物制劑 (實施例3所得)喂食南美白對蝦，連續(xù)喂料30天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為試驗組。 在常規(guī)的對蝦飼料中添加占對蝦飼料總重0. 06%的表達VP28的重組枯草芽孢桿 菌(其有效用量同試驗組中的表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和殼聚糖的用量之和)喂食 南美白對蝦，連續(xù)喂料30天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為對比組1 ;
在常規(guī)的對蟲下飼料中添加占對蟲下飼料總重0.06%的殼聚糖(其有效用量同試驗 組中的表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和殼聚糖的用量之和)喂食南美白對蟲下，連續(xù)喂料30 天，再用常規(guī)對蝦飼料喂食3天；作為對比組2 ; 用常規(guī)的對蝦飼料喂食南美白對蝦33天，作為空白對照組。
其余內容同實驗l。結果如下 試驗組對蟲下成活率高達93. 3% ，對比組1對蟲下成活率為71.7%，對比組2對蟲下成 活率為16. 7%，而對照組的對蝦成活率僅為13. 3%。對存活的蝦采用PCR檢測病毒，結果 為試驗組和對比組l PCR檢測病毒均為陰性，而對比組2和空白對照組PCR檢測病毒均為 陽性。 以上結果說明，本發(fā)明的口服生物制劑是一種防對蝦白斑病效果好、使用安全且 方便的生物制劑。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑，其特征是該制劑的組分和重量含量為1～10％表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和5～50％殼聚糖，其余為作為載體的玉米淀粉。
2. 根據權利要求1所述的防治對蝦白斑病的口服生物制劑，其特征是所述表達VP28 的重組枯草芽孢桿菌的菌含量為109個/克。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治對蝦白斑病的口服生物制劑，該制劑的組分和重量含量為1～10％表達VP28的重組枯草芽孢桿菌和5～50％殼聚糖，其余為作為載體的玉米淀粉。該制劑使用安全，且能有效防治對蝦白斑綜合癥。
文檔編號A61P31/20GK101773672SQ201010130589
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月23日 優(yōu)先權日2010年3月23日
發(fā)明者傅玲琳, 周緒霞, 李衛(wèi)芬, 林志偉, 沈文英 申請人:浙江大學;紹興文理學院