專利名稱：：奧沙利鉑殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬奧沙利鉬靶向制劑的制備與應(yīng)用，具體涉及奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：化學(xué)療法是目前治療癌癥的一種重要手段。然而大多數(shù)化學(xué)治療藥物都缺乏體內(nèi)特異的生物分布，由此導(dǎo)致對(duì)正常的細(xì)胞及器官造成毒副作用，從而使它們的臨床應(yīng)用受到限制。此外，腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性以及多藥耐藥性也成為導(dǎo)致腫瘤化療失敗的一個(gè)很重要的因素。鉬類藥物是一種具有光譜抗癌活性的化療藥物，也被稱為DNA烷化劑。奧沙利鉬是第三代鉬類抗腫瘤藥物，它通過使DNA交叉連接及抑制DNA合成達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的。然而奧沙利鉬本身缺乏對(duì)腫瘤組織的靶向性，在腫瘤組織中的藥物分布量很少，而且與紅細(xì)胞之間的有高度隔離，使得其治療效力大大降低，同時(shí)也導(dǎo)致了高發(fā)性的藥物毒副反應(yīng)如末梢的感覺神經(jīng)病變以及血小板減少癥等，從而限制了奧沙利鉬的臨床應(yīng)用。此外，在治療過程中腫瘤組織對(duì)奧沙利鉬耐受性的產(chǎn)生也成為導(dǎo)致其化療失敗的一個(gè)主要原因。因此，開發(fā)具有靶向性的新型藥物傳遞系統(tǒng)就顯得尤為重要。過去十幾年里已有關(guān)于脂質(zhì)體、納米顆粒等作為藥物載體的報(bào)導(dǎo)，值得一提的是近年來新發(fā)展起來的聚合物膠束，被認(rèn)為是一種具有很大潛力的新型藥物載體。聚合物膠團(tuán)(polymericmicelles,PMs)由兩親性的聚合物在水性環(huán)境中自發(fā)形成，它以疏水性嵌段作為內(nèi)核，親水性嵌段作為外殼，具有獨(dú)特的核-殼結(jié)構(gòu)。其內(nèi)核可為難溶性藥物提供儲(chǔ)庫，親水性外殼可使得它在水性環(huán)境中很好地分散，并可對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)修飾從而得到我們所期望的特性。聚合物膠束由于其疏水性表面以及較小的粒徑(IO-IOOnm)，可以逃避單核巨噬細(xì)胞的吞噬。聚合物膠團(tuán)自身可通過“增強(qiáng)的滲透及滯留效應(yīng)”(enhancedpermeabilityandretentioneffect)即EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向，將藥物聚集到腫瘤組織。聚合物膠團(tuán)還可以通過配體修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的主動(dòng)靶向。目前，已有將聚合物膠束作為奧沙利鉬藥物載體的報(bào)道。Cabral等制備了聚乙二醇和聚谷氨酸的嵌段共聚物[PEG-b-P(Glu)]，用其包裹奧沙利鉬得到的載藥膠團(tuán)，其體內(nèi)抗腫瘤活性結(jié)果顯示，與游離藥物相比，該載藥膠團(tuán)大大提高了藥物的抗腫瘤活性，并且具有很好的對(duì)腫瘤組織的分布，其在腫瘤組織中的藥物濃度與游離藥物相比提高了20倍。由于奧沙利鉬具有一定的水溶性，用聚合物膠束進(jìn)行包裹還存在一些困難，關(guān)于這方面的報(bào)道并不是很多。殼聚糖是一種具有低毒、高生物相容性、可體內(nèi)降解的陽離子型載體材料。將硬脂酸(stearicacid,SA)嫁接到殼聚糖(chitosan，CS0)的主鏈上，得到兩親性殼聚糖-硬脂酸嫁接物(stearicacid-graftedchitosanoligosaccharide，CSO-SA)。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖_硬脂酸嫁接物可在水性介質(zhì)中通過自聚集形成膠束，并具有快速細(xì)胞攝取的功能。本發(fā)明采用殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束包封第三代鉬類抗腫瘤藥物奧沙利鉬，制備奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束細(xì)胞內(nèi)給藥制劑，通過提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，提高細(xì)胞毒性并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，為提高奧沙利鉬的臨床抗腫瘤效力提供可能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束，是為分子靶標(biāo)位于細(xì)胞內(nèi)的奧沙利鉬，提供一種靶向給藥載體材料，由殼聚糖-硬脂酸嫁接物、奧沙利鉬、卵磷脂和水所組成，其中殼聚糖-硬脂酸嫁接物占總重量的0.5%、奧沙利鉬占總重量的0.009-0.02%、卵磷脂占總重量的0-0.2%、水占總重量的99.27-99.49%；殼聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD51kD的低分子量殼聚糖，與CltlC22的脂肪酸化學(xué)嫁接形成，殼聚糖-硬脂酸嫁接物中殼寡糖的氨基取代度為50%。當(dāng)殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度超過臨界膠束濃度時(shí)，在水性介質(zhì)中可自發(fā)形成嫁接物膠束，膠束具備被細(xì)胞快速攝取的功能。本發(fā)明的嫁接物膠束的組成已為專利“表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物給藥膠團(tuán)及其制備方法”(專利號(hào)ZL200610051601.0)所涵蓋。本發(fā)明的奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束通過以下制備方法獲得首先采用專利號(hào)ZL200610051601.0的方法合成殼聚糖-硬脂酸嫁接物取殼聚糖0.5g,精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫(25°C)，將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。然后通過下述三種方法分別制備奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束(1)探頭超聲法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入5mL去離子水，冰浴探頭超聲10次(400w，工作2s停3s)，得5mg/mL的膠束溶液。加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液。冰浴條件下探頭超聲50次(400W，工作2s停3s)，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。(2)薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴探頭超聲(同a)溶解后加入0.75mL無水乙醇溶液。45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。(3)卵磷脂介導(dǎo)薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入溶度為10mg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL。45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。尤其在在制備抗乳腺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、白血病藥物中的應(yīng)用。與奧沙利鉬溶液劑相比，通過奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束給藥，可顯著提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，提高細(xì)胞毒性并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。本發(fā)明的有益之處是殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束具有聚合物膠束體內(nèi)的被動(dòng)靶向和腫瘤細(xì)胞的快速攝取功能，通過殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束對(duì)奧沙利鉬的包封，可大大提高分子靶標(biāo)位于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的奧沙利鉬的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，提高細(xì)胞毒性并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，為提高奧沙利鉬的臨床抗腫瘤效力提供可能。附圖表說明圖1為奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線。圖2為敏感和耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的經(jīng)時(shí)變化。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一1)低分子量殼聚糖的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的鹽酸水溶液中，5560°C溫度條件下，溶漲2小時(shí)后，加入5%的纖維素酶(w/w)，在5560°C溫度條件下進(jìn)行降解。控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，得低分子量殼聚糖。所得降解反應(yīng)液，使用50Kda和IOKda超濾膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超濾分級(jí)后，取分子量1050Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測(cè)定殼聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色譜柱，0.lmol/L醋酸鈉(ρΗ6·0)為流動(dòng)相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖標(biāo)樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計(jì)算殼聚糖分子量。經(jīng)測(cè)定所得殼聚糖的重均分子量為18.OkDa02)殼聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺伍005.58，攪拌溶解溶于17!^無水乙醇溶液中，加熱至801。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫(25°C)，將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的殼聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去離子水定容，即得到lmg/ml的殼聚糖儲(chǔ)備液，分別取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去離子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氫納2.Oml和0.1%三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，利用紫外分光光度計(jì)在344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密稱定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去離子水定容。取300μ1，同法操作，測(cè)定344nm處的吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算聚合物的氨基取代度為6.89%采用芘熒光法測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠束濃度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的試管中，50°C下?lián)]干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同濃度的嫁接物溶液，分別取5ml加入到上述試管中(芘終濃度為7X10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定在374nm和385nm熒光強(qiáng)度，并以測(cè)定1375/1385傾斜率的突然變化確定該嫁接物的臨界膠束濃度為0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面電位分析儀，測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位。經(jīng)測(cè)定，lmg/mL的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位分別為34.Snm和50.8mV03)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入5mL去離子水，冰浴探頭超聲10次(400w,工作2s停3s)，得5mg/mL的膠束溶液。加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液。冰浴條件下探頭超聲50(400W,工作2s停3s)，得奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束溶液。lmg/mL殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度的奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、電位及通過電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)得的藥物包封率和載藥量結(jié)果見表1。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的數(shù)均粒徑為30.4nm,電位為50.3mV，藥物包封率為18.1%，藥物負(fù)載量為1.78%。實(shí)施例二1)低分子量殼聚糖的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的鹽酸水溶液中，5560°C溫度條件下，溶漲2小時(shí)后，加入5%的纖維素酶(w/w)，在5560°C溫度條件下進(jìn)行降解?？刂品磻?yīng)溫度和時(shí)間，得低分子量殼聚糖。所得降解反應(yīng)液，使用50Kda和IOKda超濾膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超濾分級(jí)后，取分子量1050Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測(cè)定殼聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色譜柱，0.lmol/L醋酸鈉(ρΗ6·0)為流動(dòng)相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖標(biāo)樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計(jì)算殼聚糖分子量。經(jīng)測(cè)定所得殼聚糖的重均分子量為18.OkDa02)殼聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫(25°C)，將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的殼聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去離子水定容，即得到lmg/ml的殼聚糖儲(chǔ)備液，分別取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去離子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氫納2.Oml和0.三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，利用紫外分光光度計(jì)在344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密稱定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去離子水定容。取300μ1，同法操作，測(cè)定344nm處的吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算聚合物的氨基取代度為6.89%采用芘熒光法測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠束濃度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的試管中，50°C下?lián)]干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同濃度的嫁接物溶液，分別取5ml加入到上述試管中(芘終濃度為7X10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定在374nm和385nm熒光強(qiáng)度，并以測(cè)定1375/1385傾斜率的突然變化確定該嫁接物的臨界膠束濃度為0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面電位分析儀，測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位。經(jīng)測(cè)定，lmg/mL的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位分別為34.Snm和50.8mV03)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入0.75mL無水乙醇溶液。45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。lmg/mL殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度的奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、電位及通過電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)得的藥物包封率和載藥量結(jié)果見表1。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的數(shù)均粒徑為44.9nm,電位為51.8mV,藥物包封率為41.3%，藥物負(fù)載量為3.97%。實(shí)施例三1)低分子量殼聚糖的制備取市售分子量為450kDa的殼聚糖(脫乙酰度為95%)90g，加至3000mLl.25%(ν/ν)的鹽酸水溶液中，5560°C溫度條件下，溶漲2小時(shí)后，加入5%的纖維素酶(w/w)，在5560°C溫度條件下進(jìn)行降解。控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，得低分子量殼聚糖。所得降解反應(yīng)液，使用50Kda和IOKda超濾膜(Biomax-10,MilliporeCo.，USA)超濾分級(jí)后，取分子量1050Kda超濾液冷凍干燥。凝膠滲透色譜法測(cè)定殼聚糖分子量，采用TSK-gelG3000SW色譜柱，0.lmol/L醋酸鈉(ρΗ6·0)為流動(dòng)相，以分子量0.73，5.9，11.8，47.3，212.0，788.OKda的葡聚糖標(biāo)樣制備洗脫曲線，用該洗脫曲線計(jì)算殼聚糖分子量。經(jīng)測(cè)定所得殼聚糖的重均分子量為18.OkDa02)殼聚糖_硬脂酸嫁接物合成取上述殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫(25°C)，將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖_硬脂酸嫁接物。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)法測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度(substitutiondegree,SD)。取同分子量的殼聚糖10mg，置于IOml的容量瓶中，用去離子水定容，即得到lmg/ml的殼聚糖儲(chǔ)備液，分別取0、10、50、100、200、300、400、500μ1，用去離子水定容至2.0ml，加入4%碳酸氫納2.Oml和0.1%三硝基苯磺酸2.0ml，于37°C水浴孵育2h。加入2.Omol/L鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，利用紫外分光光度計(jì)在344nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密稱定嫁接物10mg，置于IOml容量瓶中，去離子水定容。取300μ1，同法操作，測(cè)定344nm處的吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算聚合物的氨基取代度為6.89%采用芘熒光法測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物的臨界膠束濃度。取0.0012mg/ml芘的丙酮溶液0.5ml放入IOml的試管中，50°C下?lián)]干丙酮。配制0.00lmg/mllmg/ml不同濃度的嫁接物溶液，分別取5ml加入到上述試管中(芘終濃度為7X10-7mol/L)，室溫水浴超聲30min。掃描芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，測(cè)定在374nm和385nm熒光強(qiáng)度，并以測(cè)定1375/1385傾斜率的突然變化確定該嫁接物的臨界膠束濃度為0.119mg/mL。采用微粒粒度及表面電位分析儀，測(cè)定殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位。經(jīng)測(cè)定，lmg/mL的殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑和表面電位分別為34.Snm和50.8mV03)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備及其理化性質(zhì)測(cè)定取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入溶度為lOmg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL。45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液。lmg/mL殼聚糖-硬脂酸嫁接物濃度的奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的粒徑、電位及通過電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)得的藥物包封率和載藥量結(jié)果見表1。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的數(shù)均粒徑為95.7nm,電位為51.8mV，藥物包封率為47.2%,藥物負(fù)載量為3.50%。4)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束在抗腫瘤治療中的應(yīng)用采用大腸癌(SGC-7901)細(xì)胞、卵巢(SK0V3)癌細(xì)胞、肝癌(BEL-7402)細(xì)胞、白血病(K562)細(xì)胞、乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞和耐阿霉素乳腺癌(MCF-7/Adr)細(xì)胞為模型細(xì)胞，以游離藥物作對(duì)照，通過四唑鹽比色法(MTT法)考察奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的抗腫瘤活性。細(xì)胞以含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中，置于37°C培養(yǎng)箱中，通入5%C02(相對(duì)濕度為95%)，2天換一次培養(yǎng)液，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合時(shí)，用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞按10000/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗一遍，然后加入新鮮的培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入不同濃度的奧沙利鉬載藥膠團(tuán)及游離奧沙利鉬溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，并設(shè)陰性對(duì)照孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔中加入5mg/mlMTT水溶液20μ1，再培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔中再加入DMSOlOOy1溶解紫色結(jié)晶產(chǎn)物，37°C振搖30min后，用酶標(biāo)儀在570nm測(cè)定吸光度。細(xì)胞毒性結(jié)果見表2和圖1。結(jié)果顯示，通過嫁接物膠束介導(dǎo)可顯著增加奧沙利鉬藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，并可以實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)耐藥，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為5.72倍。圖IA中，SGC-7901細(xì)胞()游離藥物和()實(shí)施例三載藥膠束；SK0V3細(xì)胞(■)游離藥物和(□)實(shí)施例三載藥膠束；BEL-7402細(xì)胞(▲)游離藥物和(Δ)實(shí)施例三載藥膠束；Κ562細(xì)胞(·)游離藥物和(〇)實(shí)施例三載藥膠束。圖IB中，MCF-7細(xì)胞(■)游離藥物和(口)實(shí)施例三載藥膠束；MCF-7/Adr細(xì)胞(·)游離藥物和(〇)實(shí)施例三載藥膠束。LogC表示藥物濃度的對(duì)數(shù)。5)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束的細(xì)胞內(nèi)經(jīng)時(shí)藥物濃度測(cè)定當(dāng)MCF-7和MCF-7/Adr細(xì)胞成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，把他們按100，000/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，向其中加入奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束膠團(tuán)(恒定藥物濃度為20μg/ml)，并以同濃度的游離藥物作對(duì)照，于37°C分別孵育2h、4h、6h、8h、12h后，棄去原培養(yǎng)液，用冰PBS(pH7.4)沖洗3次，終止藥物的攝取和除去粘附在細(xì)胞膜上的藥物。向細(xì)胞中加入50μ1胰酶，將粘附在培養(yǎng)板上的細(xì)胞消化下來，然后向其中加入950μ1PBS，收集細(xì)胞懸液，用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)奧沙利鉬的濃度。細(xì)胞懸液中蛋白濃度校正取上述細(xì)胞懸液20uL，加入96孔培養(yǎng)板中，加入200uL的BCA工作液，37°C下放置30min以上。用酶聯(lián)檢測(cè)儀在570nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)已知濃度的牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用該曲線計(jì)算細(xì)胞懸液中的蛋白濃度。細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度經(jīng)時(shí)測(cè)定結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，通過嫁接物膠束介導(dǎo)可顯著增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度；在短時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。與腫瘤細(xì)胞共孵育12h后，MCF-7細(xì)胞中以嫁接物膠束形勢(shì)給藥的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度與以游離藥物形式給藥相比提高了4.57倍；MCF-7/Adr細(xì)胞中以嫁接物膠束形勢(shì)給藥的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度與以游離藥物形式給藥相比提高了4.77倍。表1不同方法制得的奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束理化性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PI代表數(shù)均粒徑的分散指數(shù)表2奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的IC5tl值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>IC50表示半數(shù)細(xì)胞致死濃度。權(quán)利要求一種奧沙利鉑殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束，其特征在于，由殼聚糖-硬脂酸嫁接物、奧沙利鉑、卵磷脂和水所組成，其中殼聚糖-硬脂酸嫁接物占總重量的0.5％、奧沙利鉑占總重量的0.009-0.02％、卵磷脂占總重量的0-0.2％、水占總重量的99.27-99.49％；殼聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量1.5kD～51kD的低分子量殼聚糖，與C10～C22的脂肪酸化學(xué)嫁接形成，殼聚糖-硬脂酸嫁接物中殼寡糖的氨基取代度為1％～50％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束的制備方法，其特征在于，先根據(jù)CN100417417C的公開的方法獲得殼聚糖-硬脂酸嫁接物，再通過三種方法分別制備奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束(1)殼聚糖_硬脂酸嫁接物制備取殼聚糖0.5g，精密稱量，加30mL去離子水80°C下攪拌溶解，稱取硬脂酸0.825g和碳二亞胺(EDC)5.5g，攪拌溶解溶于17mL無水乙醇溶液中，加熱至80°C。在400rpm磁力攪拌條件下將上述乙醇溶液加入殼聚糖溶液中，80°C恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，冷卻至室溫(25°C)，將終反應(yīng)液置透析袋中，蒸餾水透析3天。透析液冷凍干燥后，以無水乙醇洗滌去除殘留的硬脂酸，得殼聚糖-硬脂酸嫁接物；(2)奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束制備A.探頭超聲法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，加入5mL去離子水，冰浴探頭400w超聲10次，得5mg/mL的膠束溶液，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液，冰浴條件下探頭400W超聲50次，得奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束溶液；B.薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入0.75mL無水乙醇溶液，45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束溶液；C.卵磷脂介導(dǎo)薄膜分散法取25mg殼寡糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，加入0.5mL藥物濃度為5mg/mL的奧沙利鉬水溶液中，水浴超聲溶解后加入溶度為lOmg/mL的卵磷脂乙醇溶液0.75mL，45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到載藥膠束薄膜，將其用5mL去離子水分散，得奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種奧沙利鉬殼聚糖_硬脂酸嫁接物膠束的制備方法，其特征在于，步驟B和C中，水浴超聲的條件同A。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種奧沙利鉬殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗乳腺癌、大腸癌、肝癌、卵巢癌、白血病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種奧沙利鉑殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束，由0.5％殼聚糖-硬脂酸嫁接物、0.009-0.02％奧沙利鉑、0-0.2％卵磷脂和水所組成。通過(1)探頭超聲法(2)薄膜分散法，(3)卵磷脂介導(dǎo)薄膜分散法分別制備獲得。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束具有聚合物膠束體內(nèi)的被動(dòng)靶向和腫瘤細(xì)胞的快速攝取功能，通過殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束對(duì)奧沙利鉑的包封，可大大提高分子靶標(biāo)位于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的奧沙利鉑的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，提高細(xì)胞毒性并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，提高奧沙利鉑的臨床抗腫瘤效力?？稍谥苽淇鼓[瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P35/00GK101797220SQ20101014112公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2010年4月6日優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日發(fā)明者杜永忠,胡富強(qiáng),袁弘申請(qǐng)人:浙江大學(xué)