專利名稱：以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞,體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程化軟骨體外構(gòu)建的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以兔膝關(guān)節(jié)軟骨 單位為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗方法。
背景技術(shù)：
在組織工程化軟骨體外構(gòu)建過程中，理想種子細(xì)胞的選擇最為關(guān)鍵，也是目前研 究的難點。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中，最為常用的關(guān)節(jié)軟骨組織工程的種子細(xì)胞為軟骨細(xì) 胞。其體外常規(guī)酶解消化方法為0. 4% Pronase酶按12mLDMEM_F12培養(yǎng)液/g軟骨37°C 消化90分鐘，更換培養(yǎng)液后，0.025% II型膠原酶過夜消化，獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。但軟骨 細(xì)胞體外培養(yǎng)及傳代過程中，黏彈性逐漸降低，脆性增加，軟骨細(xì)胞功能退變比較快，體內(nèi) 修復(fù)軟骨缺損過程中形不成符合正常軟骨特性的透明軟骨組織，成為制約組織工程技術(shù)發(fā) 展的最大障礙之一。軟骨單位(Chondron)作為近年來才逐漸重視的關(guān)節(jié)軟骨功能結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞周基 質(zhì)及包裹在一個或幾個軟骨細(xì)胞共同構(gòu)成，其在軟骨細(xì)胞代謝及力學(xué)環(huán)境維持方面發(fā)揮了 重要作用。我們試圖在體外成功酶解消化獲取兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位的基礎(chǔ)上，以其為種子細(xì) 胞，建立體外體外構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的實驗方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有以軟骨細(xì)胞為組織工程化軟骨種子細(xì)胞的不足，提出一 種新的關(guān)節(jié)軟骨組織工程的種子細(xì)胞——軟骨單位(Chondron)的體外獲取方法及其體外 組織工程化軟骨的構(gòu)建技術(shù)。具體是一種兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外酶解消化、分離方法的基 礎(chǔ)上，以軟骨單位為種子細(xì)胞，以海藻酸鈉凝膠為載體，建立體外構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨 的實驗方法。本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案實現(xiàn)一種以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞，體外構(gòu) 建組織工程軟骨的實驗方法，其特征在于步驟如下(1)、無菌條件下留取兔膝關(guān)節(jié)，在超凈工作臺內(nèi)將膝關(guān)節(jié)打開，刮取膝關(guān)節(jié)股骨 和脛骨平臺全層軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨反復(fù)剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重， 放置于無菌錐形瓶備用；(2)、采用dispase酶和II型膠原酶按12mL DMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨加入上述錐 形瓶內(nèi)，即每克軟骨加入DMEM-F12培養(yǎng)液12mL，DMEM-F12培養(yǎng)液中含有質(zhì)量/體積濃度為 0. 3%的dispase酶和質(zhì)量/體積濃度為0. 2%的II型膠原酶，上述兩種酶均采用無菌DMEM-F12培養(yǎng)液溶解，經(jīng)過0. 22 μ m —次性過濾器過濾、 除菌，加入培養(yǎng)液的錐形瓶放置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進(jìn)行 聯(lián)合酶解攪拌消化3h，形成消化懸液；
(3)、將上述消化懸液用10(^111細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于離心管中，1200印111離心51^11，棄 上清，然后IOmL無菌DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗、離心3次，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液10mL， 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液包括DMEM-F12培養(yǎng)基9mL及肽牛血清lmL，制成無菌的軟骨單位懸液， 即獲得了種子細(xì)胞——軟骨單位；(4)、上述獲得的軟骨單位進(jìn)行海藻酸鈉凝膠立體培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程軟骨， 步驟如下①、將120mg海藻酸鈉粉劑溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振蕩，混勻，0. 45 μ m—次 性過濾器過濾、除菌備用，②、將軟骨單位懸液計數(shù)、離心，棄上清，按4X IO6個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合， 用無菌吸管反復(fù)吹打均勻，③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl2 溶液，靜置5 10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球，0. 9% NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養(yǎng)，每 孔接種4粒凝膠球，加入原代培養(yǎng)基3mL，原代培養(yǎng)基包括DMEM-F12培養(yǎng)基2. 7mL及肽牛血 清 0. 3mL。④、將培養(yǎng)板放置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，2 3日更換1次培養(yǎng)液，使關(guān) 節(jié)軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩(wěn)定生長。
本發(fā)明利用軟骨單位作為組織工程化軟骨種子細(xì)胞，相對現(xiàn)有技術(shù)具有如下有益 效果(1)、利用dispase酶和II型膠原酶聯(lián)合酶解攪拌消化3小時可以成功獲取兔膝 關(guān)節(jié)軟骨單位，獲取方法簡單，重復(fù)性好。(2)、酶解消化獲得的軟骨單位包括完整的細(xì)胞周基質(zhì)及包裹在內(nèi)的一個或幾個 軟骨細(xì)胞，使得軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)及構(gòu)建組織工程化軟骨過程中更加符合軟骨細(xì)胞在體 內(nèi)的生長環(huán)境及生物學(xué)特性。(3)、通過微管吸吮生物力學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，急性消化軟骨單位平衡 模量(1.573 士 0. 151kPa)、瞬時模量(6. 850 士 0. 607kPa)以及黏彈性指數(shù) (13.423±1.027kPa*S)明顯高于單純軟骨細(xì)胞平衡模量(0. 370士0. 013kPa)、瞬時模量 (0. 672士0. 015kPa)以及黏彈性指數(shù)(6. 293士0. 134kPa-s)。說明關(guān)節(jié)軟骨單位較單純細(xì) 胞相比生物力學(xué)特性明顯提高，改善了軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞生物力學(xué)特性較差的缺點。(4)、與軟骨細(xì)胞相比，軟骨單位體外長期培養(yǎng)過程中形態(tài)、增殖情況穩(wěn)定，分泌II 型膠原等基質(zhì)成分生理學(xué)功能提高，有望促進(jìn)組織工程法修復(fù)軟骨損傷的效果。
具體實施例方式本發(fā)明具體步驟如下(1)、無菌條件下留取兔膝關(guān)節(jié)。在超凈工作臺內(nèi)將膝關(guān)節(jié)打開，銳刀刮取膝關(guān)節(jié) 股骨和脛骨平臺全層軟骨。用小剪刀將關(guān)節(jié)軟骨反復(fù)剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗， 棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用。(2)、采用0.3% dispase酶(一種中性裂解酶，美國Sigma公司)和0.2% II型 膠原酶(美國Sigma公司)按12mL DMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨加入上述錐形瓶內(nèi)。兩種酶 均采用無菌DMEM-F12培養(yǎng)液(美國HyClone公司)溶解，經(jīng)過0. 22 μ m —次性過濾器過濾、除菌。將加入培養(yǎng)液錐形瓶放置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進(jìn) 行聯(lián)合酶解攪拌消化3h (通過我們連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，攪拌消化3h時已肉眼看不見剩余軟骨組 織塊)。(3)、將上述消化懸液用IOOym細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于15mL離心管中，1200rpm離心 5min,棄上清，IOmL無菌DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗、離心3次。加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液 10mL(DMEM-F12培養(yǎng)基9mL及肽牛血清ImL)，制成無菌的軟骨單位懸液。(4)、上述消化獲得的軟骨單位進(jìn)行海藻酸鈉凝膠立體培養(yǎng)，步驟如下①、將120mg海藻酸鈉(美國Sigma公司)粉劑溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振 蕩，混勻，0. 45 μ m —次性過濾器過濾、除菌備用。②、將軟骨單位懸液計數(shù)、離心，棄上清。按4X IO6個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合， 用無菌吸管反復(fù)吹打均勻。③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl2 溶液，靜置5 10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球。0. 9% NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養(yǎng)， 每孔接種4粒凝膠球，加入原代培養(yǎng)基3mL (DMEM-F 12培養(yǎng)基2. 7mL及肽牛血清0. 3mL)。④、將培養(yǎng)板放置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，2 3日更換1次培養(yǎng)液，使關(guān) 節(jié)軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩(wěn)定生長。
權(quán)利要求
一種以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗方法，其特征在于步驟如下(1)、無菌條件下留取兔膝關(guān)節(jié)，在超凈工作臺內(nèi)將膝關(guān)節(jié)打開，刮取膝關(guān)節(jié)股骨和脛骨平臺全層軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨反復(fù)剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用；(2)、采用dispase酶和II型膠原酶按12mL DMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨加入上述錐形瓶內(nèi)，即每克軟骨加入DMEM-F12培養(yǎng)液12mL，DMEM-F12培養(yǎng)液中含有質(zhì)量/體積濃度為0.3％的dispase酶和質(zhì)量/體積濃度為0.2％的II型膠原酶，上述兩種酶均采用無菌DMEM-F12培養(yǎng)液溶解，經(jīng)過0.22μm一次性過濾器過濾、除菌，加入培養(yǎng)液的錐形瓶放置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進(jìn)行聯(lián)合酶解攪拌消化3h，形成消化懸液；(3)、將上述消化懸液用100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，然后10mL無菌DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗、離心3次，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液包括DMEM-F12培養(yǎng)基9mL及肽牛血清1mL，制成無菌的軟骨單位懸液，即獲得了種子細(xì)胞——軟骨單位；(4)、上述獲得的軟骨單位進(jìn)行海藻酸鈉凝膠立體培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程軟骨，步驟如下①、將120mg海藻酸鈉粉劑溶解于10mL0.9％NaCl溶液，振蕩，混勻，0.45μm一次性過濾器過濾、除菌備用，②、將軟骨單位懸液計數(shù)、離心，棄上清，按4×106個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合，用無菌吸管反復(fù)吹打均勻，③、用微量移液器吸取40μL混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl2溶液，靜置5～10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球，0.9％NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養(yǎng)，每孔接種4粒凝膠球，加入原代培養(yǎng)基3mL，原代培養(yǎng)基包括DMEM-F 12培養(yǎng)基2.7mL及肽牛血清0.3mL，④、將培養(yǎng)板放置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，2～3日更換1次培養(yǎng)液，使關(guān)節(jié)軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩(wěn)定生長。
全文摘要
本發(fā)明屬于組織工程化軟骨體外構(gòu)建的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗方法。其步驟如下留取兔膝關(guān)節(jié)，將關(guān)節(jié)軟骨反復(fù)剪成碎片組織，沖洗，棄上清，放置于無菌錐形瓶備用；采用dispase酶和II型膠原酶按12mL DMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨加入上述錐形瓶內(nèi)，攪拌，消化，形成消化懸液；將消化懸液過濾、離心，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，制成無菌的軟骨單位懸液，獲得的軟骨單位進(jìn)行海藻酸鈉凝膠立體培養(yǎng)構(gòu)建組織工程軟骨。本發(fā)明的有益效果軟骨單位體外長期培養(yǎng)過程中形態(tài)、增殖情況穩(wěn)定，分泌II型膠原等基質(zhì)成分生理學(xué)功能提高，有望促進(jìn)組織工程法修復(fù)軟骨損傷的效果。
文檔編號A61L27/20GK101829362SQ20101014694
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者衛(wèi)小春, 孫振偉, 李琦, 段王平 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院;衛(wèi)小春