專利名稱：一種降糖中藥組合物及滴丸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降糖中藥組合物及其滴丸。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes mellitus)是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，是由于體內(nèi)胰島素缺乏或不能正常發(fā)揮生理作用引起糖代謝紊亂，繼而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂肪、水、電解質(zhì)等多種物質(zhì)代謝紊亂的一種綜合病證，以高血糖為主要特征。該病常伴隨多種慢性并發(fā)癥，造成多器官、多系統(tǒng)的廣泛損傷，具有較高的致殘率。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全球糖尿病患者數(shù)量已超過1.5億人，而中國現(xiàn)有糖尿病者總量已接近4000萬人，其中90％為非胰島素依賴型糖尿病(II型)。
糖尿病的危害不僅僅在于疾病本身也就是內(nèi)分泌異常的影響，最嚴(yán)重的在于糖尿病所帶來的并發(fā)癥，如心血管系統(tǒng)疾病，肝腎損害以及周圍神經(jīng)病變等等，它已成為繼心血管疾病和癌癥以后第三大病因。
糖尿病治療方面西醫(yī)上主要采用手術(shù)治療和降糖藥物治療兩種方法。近年來應(yīng)用中藥及其制劑防治糖尿病的研究取得不少新的進(jìn)展，尤其是中藥能夠克服化學(xué)合成藥在降血糖的同時(shí)產(chǎn)生副作用或誘發(fā)并發(fā)癥的事實(shí)，倍受醫(yī)藥界和廣大患者的重視。因此，研究中藥降血糖作用機(jī)理，開發(fā)速效、高效、長效、低毒的降血糖中藥新藥，對于防治糖尿病及其并發(fā)癥具有重要的社會價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種用于治療糖尿病的降糖中藥組合物、提取物及其滴丸。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種降糖中藥組合物，由質(zhì)量組成如下的組分組成(以干重計(jì)) 絞股藍(lán)10～20份 梔子 5～15份 山藥 10～30份 玉竹 10～30份。
所述組合物質(zhì)量組成如下 絞股藍(lán)15份 梔子 10份 山藥 20份 玉竹 20份。
本發(fā)明組合物主要由絞股藍(lán)、梔子、山藥、玉竹等組成。本方中絞股藍(lán)益氣養(yǎng)陰，兼能生津止渴，清熱，梔子清熱涼血，輔以玉竹滋陰清熱，山藥補(bǔ)脾肺之氣陰的作用，四者均符合中醫(yī)藥理論依據(jù)，遵循君臣佐使原則。中醫(yī)藥理論認(rèn)為，糖尿病癥屬于陰虛熱盛所致氣陰兩虛之癥，本虛主要指腎陰虧虛，標(biāo)實(shí)是指肺胃燥熱。故治療要兼顧滋陰清熱，重點(diǎn)辨虛實(shí)，隨癥分型，依法立方，據(jù)方選藥，靈活運(yùn)用。
現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)的主要藥效成分為絞股藍(lán)皂苷，據(jù)報(bào)道絞股藍(lán)皂苷對神經(jīng)、血液、循環(huán)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等多方面疾病具有防治作用。觀察絞股藍(lán)皂苷對鏈脲佐菌素造型的糖尿病大鼠血糖的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷能抑制血清中膽固醇、過氧化脂質(zhì)的增加，有助于血糖降低。采用絞股藍(lán)皂苷治療自由基損傷模型大鼠，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷能抑制肝臟和血漿脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，明顯提高自由基損傷模型大鼠和老年大鼠的紅細(xì)胞過氧化物歧化酶(SOD)的活力，具有降低氧化和殺死自由基損傷的作用。觀察絞股藍(lán)皂苷對小鼠、大鼠抗應(yīng)激能力的影響，發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷可使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性升高，加速體內(nèi)自由基的清除速度，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)免遭破壞，同時(shí)可改善紅細(xì)胞運(yùn)氧功能，降低血乳酸積累，從而提高了應(yīng)對缺氧的能力。
山藥具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)肺益腎的功效，可用于治療脾虛久瀉、慢性腸炎、慢性胃炎、肺虛咳喘、糖尿病、遺精和遺尿滯下等癥。既是食用的滋補(bǔ)保健佳品，又是常用的藥材。山藥多糖是山藥多糖是目前公認(rèn)的山藥主要活性成分。據(jù)報(bào)道，山藥多糖具有降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的作用，促進(jìn)糖尿病小鼠體重的恢復(fù)。其作用機(jī)制可能與增加胰島素分泌、改善受損壞的胰島β細(xì)胞功能及清除過多自由基等有關(guān)。此外，山藥多糖還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗衰老、抗氧化的作用。
梔子苦、性寒，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的作用。梔子主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類(梔子苷類)、黃酮類(梔子素類)等。從梔子中提取得到的梔子苷具有降低血糖的作用。此外，梔子苷的抗炎作用強(qiáng)。梔子生品的抗炎作用最強(qiáng)，可明顯抑制巴豆油所致的小鼠耳殼炎癥，降低醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性。
玉竹性甘，微寒，歸肺、胃經(jīng)，能養(yǎng)陰潤肺，益胃生津。玉竹中含有多糖、鞣質(zhì)、粘液質(zhì)、強(qiáng)心苷等。國內(nèi)也有學(xué)者研究表明玉竹水提取物對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖有明顯的降低。潘興瑜等經(jīng)多年研究證明玉竹提取物具有抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，抑制IL-2、TNF-α炎癥介子產(chǎn)生的作用。玉竹提取物的降糖機(jī)制與阻斷胰島β細(xì)胞自身免疫反應(yīng)過程，抑制Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的，包括分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ在內(nèi)的自身免疫反應(yīng)，激活局部Th2型反應(yīng)，進(jìn)而分泌IL-4、IL-10等Th2型細(xì)胞因子有關(guān)。
一種用于制備治療糖尿病的藥物的中藥提取物，制備所述中藥提取物的中藥原料為質(zhì)量比為10～20∶5～15∶10～30∶10～30的絞股藍(lán)、梔子、山藥和玉竹，所述中藥提取物由水提取物和乙醇提取物組成，所述的水提取物和乙醇提取物分別按如下方法制備 (1)水提取物稱取配方量的山藥和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍質(zhì)量(以山藥和玉竹干重之和計(jì))的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取溫度為95～100℃，過濾除去藥渣，合并濾液，濃縮，加入乙醇至乙醇體積濃度為80％～90％，放置24h后，抽濾，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末； (2)乙醇提取物稱取配方量的梔子和絞股藍(lán)，浸泡0.5～2h，加8～12倍質(zhì)量(以梔子和絞股藍(lán)干重之和計(jì))的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，過濾除去藥渣，合并濾液，回收乙醇、濃縮，濃縮液過濾，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末。
本發(fā)明還涉及利用所述中藥組合物制得的降糖滴丸(以下稱復(fù)方降糖滴丸)，所述滴丸由如下方法制得 (1)水提取物制備稱取配方量的山藥和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍質(zhì)量的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取溫度為95～100℃，過濾除去藥渣，合并濾液，濃縮，加入乙醇至乙醇體積濃度為80％～90％，放置24h后，抽濾，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末； (2)乙醇提取物制備稱取配方量的梔子和絞股藍(lán)，浸泡0.5～2h，加8～12倍質(zhì)量的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，過濾除去藥渣，合并濾液，回收乙醇、濃縮，濃縮液過濾，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末； (3)滴丸制備取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入基質(zhì)攪拌混勻，70～100℃下倒入滴丸機(jī)中，滴入冷凝劑中，冷卻，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸。
復(fù)方降糖滴丸具有深厚的臨床積淀，主要由絞股藍(lán)、梔子、山藥、玉竹等組成。方中絞股藍(lán)益氣養(yǎng)陰，兼能生津止渴，清熱，梔子清熱涼血，輔以玉竹滋陰清熱，山藥補(bǔ)脾肺之氣陰的作用。以上諸藥合用達(dá)到益氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效。
所述步驟(3)中冷凝劑為甲基硅油和液體石蠟質(zhì)量比0.5～5∶1的混合物。
所述步驟(3)中基質(zhì)為PEGE6000，質(zhì)量用量為水提取物粉末和乙醇提取物粉末總質(zhì)量的8～12倍。
優(yōu)選的，制備所述滴丸的中藥原料為質(zhì)量比為15∶10∶20∶20的絞股藍(lán)、梔子、山藥和玉竹，所述滴丸由如下方法制得 (1)水提取物制備稱取配方量的山藥和玉竹，浸泡1h，加6倍質(zhì)量的水回流提取3次，每次2h，提取溫度為100℃，過濾除去藥渣，合并濾液，濃縮至相對密度為1.15，加入乙醇至乙醇體積濃度為90％，放置24h后，抽濾，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末； (2)乙醇提取物制備稱取配方量的梔子和絞股藍(lán)，浸泡1h，加10倍質(zhì)量的65％乙醇回流提取2次，每次2h，過濾除去藥渣，合并濾液，回收乙醇、濃縮至對密度為1.12，濃縮液過濾，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末； (3)滴丸制備取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入質(zhì)量為粉末質(zhì)量10倍的PEGE6000、攪拌混勻，100℃下倒入滴丸機(jī)中，滴入冷凝劑中，冷卻，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸；所述冷凝劑為甲基硅油和液體石蠟質(zhì)量比2∶1的混合物。
經(jīng)藥理學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，復(fù)方降糖滴丸可明顯提高四氧嘧啶所引起的糖尿病小鼠模型的體重，降低血糖，療效顯著，與模型對照組相比，具有極顯著性差異(P＜0.01)；且其藥效接近于原有處方湯藥。復(fù)方降糖滴丸可提高糖尿病性小鼠血清胰島素水平，提示可能復(fù)方降糖滴丸能保護(hù)四氧嘧啶對小鼠胰島β細(xì)胞的破壞有關(guān)，可在一定程度上刺激模型小鼠胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島細(xì)胞的再生而釋放胰島素。復(fù)方降糖滴丸可減少組織中的氧化產(chǎn)物MDA含量，提高SOD的含量，效果顯著，具有極顯著性差異(P＜0.01)；充分體現(xiàn)該處方不僅具有改善血糖的優(yōu)勢，更具有提高個(gè)體抗氧化，抗應(yīng)激能力，綜合治療糖尿病。
小鼠急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在藥液最大濃度灌胃動物，沒有引起小鼠任何可見的毒性反應(yīng)。表明制劑無法測出LD50，改用最大給藥量試驗(yàn)測定其單次口服急性毒性。正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠灌胃后部分小鼠有洗臉狀，2h后觀察大多小鼠均有輕度腹瀉，小鼠尾尖肛門環(huán)周濕，可見有藥液狀液體排泄物，小鼠不時(shí)有舔尾狀，分析原因可能是小鼠禁食時(shí)間太久，藥液濃度以及灌胃量太大，引起短時(shí)間的胃腸道刺激反應(yīng)。給藥24h觀察小鼠上述癥狀消失，狀態(tài)恢復(fù)正常。
觀察期間小鼠體重正常增加，行動敏捷，活動自如；眼部無異常癥狀；皮膚毛色光亮；大小便狀態(tài)正常。從飲食曲線看，藥物組和空白組小鼠飲食均有降低并最終趨向平穩(wěn)，這尚不能斷定是有藥物引起，需要做進(jìn)一步長期毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組小鼠均無死亡。本實(shí)驗(yàn)條件下，綜合結(jié)果表明復(fù)方降糖滴丸的安全性良好。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種降糖效果顯著、安全性好的降糖中藥組合物及其滴丸，可明顯提高四氧嘧啶所引起的糖尿病小鼠模型的體重、降低血糖，可提高糖尿病性小鼠血清胰島素水平、減少組織中的氧化產(chǎn)物MDA含量，提高SOD的含量，且效果顯著；本發(fā)明降糖中藥組合物及滴丸不僅具有改善血糖的優(yōu)勢，更具有提高個(gè)體抗氧化，抗應(yīng)激能力，可綜合治療糖尿病。


圖1為復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠體重影響(n＝8)； 圖2為復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血糖影響(n＝8)； 圖3為復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠胰島素影響(n＝8)； 圖4為復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠SOD影響(n＝8)； 圖5為復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠MDA影響(n＝8)； 圖6為復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠臟器指數(shù)影響(n＝8)。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此 實(shí)施例1提取工藝研究 儀器、試劑及藥材 紫外可見分光光度計(jì)日本島津 UV-2550 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司 S.C.101型 分析天平 北京賽多利斯天平有限公司 Sartorius-BS110S 電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司AB135-型 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申生科技有限公司 R-204型 超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司 KQ5200 水浴鍋鞏義市英峪予華儀器廠 HH-S型 高效液相色譜儀Waters 510 Series，紫外檢測器(美國Waters科技有限公司)，色譜柱SinoChrom ODS-BP(4.6mm×250mm，5μm批號41021)，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站 梔子、絞股藍(lán)、玉竹、山藥四味藥材均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋捷民教授鑒定，梔子為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果實(shí)，炒焦后入藥，批號070717；絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)(Gynostemma P.E.)的全草，批號070624；山藥為薯蕷科植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb)的干燥根莖，批號070612；玉竹為百合科植物玉竹(Polygonatum odoratum Druce)的干燥根莖，批號070511 1山藥、玉竹提取工藝考察 1.1考察指標(biāo)的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)資料，山藥和玉竹藥材中多糖成分是其重要的藥理活性成分。為了充分發(fā)揮兩味中藥中多糖成分的效用，將兩味藥材中多糖成分共同提取。一般以多糖得率為考察指標(biāo)，故將其作為多糖提取工藝的評價(jià)指標(biāo)。
1.2正交因素水平的確定 稱取1倍處方量(處方量為山藥20g、玉竹20g)的藥材，共九份，采用回流提取法，按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。提取液過濾，濃縮，按提取溶媒的考察項(xiàng)下方法進(jìn)行醇沉操作。選擇料液比，提取時(shí)間，提取次數(shù)為考察因素，每因素各取三個(gè)水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，見表1。
表1因素水平表
1.3正交試驗(yàn)驗(yàn)證 準(zhǔn)確稱取1倍處方量的藥材，按正交試驗(yàn)最佳工藝提取，平行提取三份，提取液過濾，濃縮。按提取溶媒的考察項(xiàng)下方法進(jìn)行醇沉，采用苯酚-硫酸法測定提取液中多糖的含量，考察工藝的合理性。
1.4正交醇沉工藝考察 準(zhǔn)確稱取處方量藥材，按最佳提取工藝提取，提取液合并濃縮，按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行醇沉試驗(yàn)。選擇濃縮比，醇沉濃度，靜置時(shí)間為考察因素，每因素各取三個(gè)水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表2。
表2因素水平表

1.5正交試驗(yàn)驗(yàn)證 準(zhǔn)確稱取1倍處方量的藥材，按最佳提取工藝提取，提取液合并濃縮，按正交試驗(yàn)最佳工藝醇沉，平行操作三份，按照苯酚-硫酸法測定提取液中多糖的含量，考察工藝的合理性。
1.6結(jié)果與數(shù)據(jù)處理 表3多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果L9(34)正交表
表4多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表 注F005(2，2)＝19 表5多糖提取的正交試驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3) 表6多糖醇沉試驗(yàn)L9(34)正交表
表7多糖醇沉試驗(yàn)方差分析表 注F0.10(2，2)＝9 表8多糖醇沉試驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3) 2絞股藍(lán)、梔子提取工藝考察 2.1考察指標(biāo)的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)資料，絞股藍(lán)中的皂苷成分和梔子苷藥材中黃酮成分是重要的藥理活性成分。為了充分發(fā)揮兩味中藥中活性成分的效用，將兩味藥材中共同提取，提取溶劑選擇乙醇。一般絞股藍(lán)以絞股藍(lán)皂苷含量為考察指標(biāo)，梔子以梔子苷含量為考察指標(biāo)，故將絞股藍(lán)皂苷和梔子苷作為乙醇提取工藝的評價(jià)指標(biāo)。
2.2正交提取工藝考察 稱取1倍處方量藥材(處方量絞股藍(lán)15g、梔子10g)，共九份，采用回流提取法，按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。提取液過濾，濃縮。以梔子苷含量，絞股藍(lán)皂苷含量為考察指標(biāo)，選擇提取乙醇濃度，溶媒量，提取時(shí)間，提取次數(shù)為考察因素，每因素各取三個(gè)水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表9。
表9因素水平表
2.3正交試驗(yàn)驗(yàn)證 稱取1倍處方量藥材，按正交試驗(yàn)最佳提取工藝，平行提取三份，提取液過濾，濃縮。分別測定梔子苷含量和絞股藍(lán)皂苷含量，考察工藝的合理性。準(zhǔn)確吸取制得的濃縮浸膏50mL，置恒重蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)?05℃干燥1小時(shí)，移至干燥器中冷卻30min，重復(fù)以上操作至恒重，精密稱定，計(jì)算浸膏得率。
2.4絞股藍(lán)、梔子提取工藝考察結(jié)果 表10L9(34)正交表
注(綜合評分＝梔子苷含量*70％+絞股藍(lán)皂苷含量*30％) 表11方差分析表 注F0.10(2，2)＝9 表12驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n＝3) 提取工藝研究，經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)確定的山藥、玉竹最佳水提工藝為藥材浸泡1h，加入6倍量水回流提取3次，每次提取2h，提取溫度為100℃；最佳醇沉工藝為提取液濃縮至每毫升含生藥量為1g，加入95％乙醇至醇沉濃度達(dá)到90％，靜置24h，過濾，干燥，即得。梔子、絞股藍(lán)最佳醇提工藝為藥材浸泡1h，加入10倍量65％乙醇提取2次，每次提取2h，過濾，合并提取液，濃縮，減壓干燥，即得。
實(shí)施例2制劑成型工藝研究 1正交試驗(yàn)法優(yōu)選滴丸成型工藝 根據(jù)以上試驗(yàn)，選定藥物與基質(zhì)的比例、PEG4000與PEG6000的比例、料溫三個(gè)因素，每因素選擇三個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)對滴丸成型工藝進(jìn)行優(yōu)選，以外觀I(硬度、外形及拖尾情況)、丸重差異系數(shù)II、溶散時(shí)限III為篩選指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，綜合評分值越小越好。因素水平見表4。
表13因素水平表

評判公式[55]R＝I/Imax*100*0.4+II/IImax*100*0.3+III/IIImax*100*0.3 外觀硬度由硬到軟得分為1～3分；圓整度由圓整到不圓整得分為1～3分；拖尾情況由好到差得分為1～3分。溶散時(shí)限照中國藥典2005年版一部附錄崩解時(shí)限檢察法檢查，記錄溶散時(shí)間，即得。丸重差異系數(shù)照中國藥典2005年版一部附錄滴丸劑項(xiàng)下重量差異檢察法檢查，任取滴丸20丸，分別精密稱定每丸的重量，計(jì)算丸重差異系數(shù)(RSD)，即得。
2正交試驗(yàn)法優(yōu)選滴丸成型工藝 按正交表安排實(shí)驗(yàn)，稱取基質(zhì)，加熱熔融，加入中藥提取物粉末，攪拌、混勻，在冰水浴條件下滴制。試驗(yàn)結(jié)果見表14。
表14L9(34)正交表

試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳成型工藝為C1B3A1，即藥物與基質(zhì)比例為1∶8，液體石蠟與甲基硅油比例為1∶2，物料溫度為100℃。
3驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述最佳工藝條件，對3批樣品進(jìn)行滴制驗(yàn)證試驗(yàn)，并按下述具體方法檢查。外觀質(zhì)量大小均勻，色澤一致，圓整，有硬度，無拖尾。溶散時(shí)限按中國藥典2005年一部附錄滴丸劑項(xiàng)下的方法檢查。重量差異按中國藥典2005年一部附錄滴丸劑項(xiàng)下的方法檢查。
結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定復(fù)方降糖滴丸工藝為藥物∶基質(zhì)＝1∶10，冷卻劑為液體石蠟∶甲基硅油＝1∶2，滴制溫度為100℃。
實(shí)施例3降糖滴丸制備 處方絞股藍(lán)15g、梔子10g、山藥20g、玉竹20g 方法 (1)中藥提取物制備取處方量的山藥、玉竹，浸泡1h后，加入6倍量(240g)水回流提取3次，每次提取2h；提取液濃縮至每毫升含生藥量為1g，加入95％乙醇至乙醇體積濃度達(dá)到90％，靜置24h，過濾，干燥，即得水提取物干燥粉末；取處方量的梔子、絞股藍(lán)，浸泡1h后，加入10倍量(250g)65％乙醇提取2次，每次提取2h，過濾，合并提取液，濃縮，減壓干燥，即得乙醇提取物干燥粉末；將水提取物干燥粉末和乙醇提取物干燥粉末混合，即為所述中藥提取物； (2)稱取基質(zhì)PEGE6000，加熱熔融，加入步驟(1)中藥提取物粉末，攪拌、混勻，在冰水浴條件下滴制。中藥提取物粉末∶基質(zhì)＝1∶10，冷卻劑為液體石蠟∶甲基硅油＝1∶2，滴制物料溫度為100℃。滴丸成型率平均為98.83％。
實(shí)施例4復(fù)方降糖滴丸對ICR小鼠血糖、血清胰島素、SOD，MDA、蛋白質(zhì)和肝臟指數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)儀器、藥物與試劑 紫外可見分光光度計(jì)日本島津公司UV-2550 電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠 JA-2003型 水浴鍋鞏義市英峪予華儀器廠HH-S型 離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠 TDL80-2B型 血糖測定儀美國Lifescan公司強(qiáng)步倍加型 酶標(biāo)儀芬蘭雷勃集團(tuán)MK-3 旋渦混合器北京醫(yī)用儀器廠 XW-80A型 四氧嘧啶(購自Sigma公司) 胰島素試劑盒(品牌USCNLIFE) 超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所) 丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所) 金芪降糖片，由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠生產(chǎn)，批號0703066，規(guī)格每片重0.42g，內(nèi)服。中成藥組成黃芪，金銀花等。
復(fù)方降糖滴丸提取物(按實(shí)施例3步驟(1)方法制得)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配成所需濃度。原處方藥物組，由山藥、玉竹、絞股藍(lán)、梔子按照實(shí)施例2處方以6倍水量回流提取3次，每次2h，提取液合并濃縮至0.8g/mL。
蛋白定量試劑盒-考馬斯亮蘭法(南京建成生物工程研究所)清潔級ICR小鼠70只，體重18～22g，雄性，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。動物飼料鼠用普通飼料，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。飼養(yǎng)條件溫度為18～22℃、相對濕度50％～60％。
1實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠模型建立 取雄性小鼠70只，體重18～22g，正常飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組。其余小鼠自第8天后禁食不禁水12h，按100mg/kg尾靜脈注射現(xiàn)配5％四氧嘧啶溶液，造成實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型。于72h后尾靜脈取血測空腹血糖值，以血糖值不低于11.1mmoL/L作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，刪除未造成糖尿病模型者。
2分組與給藥情況 選取造模成功的60只小鼠進(jìn)行隨機(jī)分為5組，每組12只，為模型對照組，陽性對照組，原處方湯劑組，復(fù)方降糖滴丸藥物高、低劑量組。
復(fù)方降糖滴丸藥物組分為高、低兩個(gè)劑量組。按處方生藥用量為65g/人/日，按65kg/人計(jì)算，即1.00g生藥/kg，按人與動物體表面積比值換算成小鼠生藥量，即小鼠用藥劑量為6.00g/kg，以此2倍劑量為低劑量，其8倍為高劑量，臨用前用蒸餾水分別配成濃度為2.4g/mL、0.6g/mL(以生藥計(jì))，按0.2mL/10g灌胃給藥，1次/d。
金芪降糖片組規(guī)格0.42g/片，臨床劑量8.82g(21片)/人/日，按65kg/人計(jì)算，即0.14g生藥/kg，按人與動物體表面積比值換算成小鼠生藥量，即小鼠用藥劑量為0.8g/kg，以此為對照藥劑量，用蒸餾水配置成濃度為0.4g/mL，按0.2mL/10g灌胃給藥，1次/d。
原處方湯劑組按處方生藥用量為130g/人/日，按65kg/人計(jì)算，即2.00g生藥/kg，按人與動物體表面積比值換算成小鼠生藥量，即小鼠用藥劑量12.00g/kg，臨用前用蒸餾水配成濃度為0.6g/mL，按0.2mL/10g灌胃給藥，1次/d。
正常對照組及模型對照組灌胃等體積蒸餾水，按0.2mL/10g灌胃給藥，1次/d。見表15。
表15復(fù)方降糖滴丸對糖尿病小鼠模型試驗(yàn)研究方案 3標(biāo)本采集及處理 3.1標(biāo)本采集 各組小鼠均采用灌胃給藥途徑，按表32所示給予相應(yīng)劑量的受試物，每天1次，連續(xù)給藥15天。造模成功后，每5d收集小鼠血液一次，尾靜脈采血，進(jìn)行血糖的測定，共測3次。動物處死前禁食不禁水，于眼眶取血，離心，用于測定胰島素；處死動物，摘取肝臟，稱重，并用肝組織勻漿測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。
3.210％肝組織勻漿的制備 3.2.1取肝臟組織用冷生理鹽水沖洗，除去洗液，濾汁拭干，電子天平精確稱重，放入5～10mL的小燒杯內(nèi)。
3.2.2用量筒取預(yù)冷的生理鹽水，生理鹽水的總量是組織塊的九倍，將其倒入小燒杯內(nèi)，用眼科剪刀盡快剪碎組織塊。
3.2.3將剪碎的組織全被倒入玻璃勻漿管中，用手動玻璃勻漿機(jī)充分研磨，使組織勻漿化。
3.2.4將勻漿液以4000r/min離心15分鐘。
3.2.5取上清液，保存在-20℃冰箱中待測組織內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)。
4觀察指標(biāo) 4.1檢測血糖 在試驗(yàn)期間，分別于給藥5天，10天及15后，采用美國Lifescan公司血糖儀及配套的試紙，尾靜脈取血測量血糖，并記錄取血當(dāng)天小鼠體重。
4.2測定血清胰島素 小鼠于給藥1 5天后，禁食12小時(shí)，眼眶取全血2mL，分離血清，轉(zhuǎn)速4000r/min離心10min，取血清貯存于-20℃冰箱中，采用酶聯(lián)免疫法測血清胰島素。
4.3測定SOD，MDA 取10％肝組織勻漿，按試劑盒說明操作于550nm處采用化學(xué)比色法測定肝組織中SOD活力；于532nm處采用化學(xué)比色法按照試劑盒測定MDA含量；利用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法進(jìn)行組織中蛋白質(zhì)的測定。
4.3.1SOD測定原理 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧離子自由基(O2-)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計(jì)測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時(shí)，則對超氧離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測定的吸光度低于對照管的吸光度，通過公式計(jì)算可求出被測樣品中的SOD活力。
4.3.2 MDA測定原理 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532mn處有最大吸收峰。
4.3.3蛋白測定原理 蛋白質(zhì)分子具有一NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的CBBZ250顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，CBBZ250染料上的陰離子與蛋白一NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過測定吸光度可計(jì)算出蛋白含量。
4.4測定肝臟指數(shù) 小鼠于給藥15天后，禁食12小時(shí)，剖腹取全肝，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。
5實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表16復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠體重影響(n＝8)
注*與模型對照組比較p＜0.05；**p＜0.01；Δ與陽性對照組比較p＜0.05；ΔΔp＜0.01； 表17復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血糖影響(n＝8)
注**與模型對照組比較P＜0.01 表18復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠胰島素影響(n＝8)
表19復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠SOD影響(n＝8)
注**與模型對照組比較P＜0.01 表20復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠MDA影響(n＝8)
注**與模型對照組比較P＜0.01 ΔΔ與陽性對照組比較P＜0.01 表21復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠臟器指數(shù)影響(n＝8)
6小結(jié) 在糖尿病動物實(shí)驗(yàn)研究中，常需要建立相應(yīng)的動物模型。目前制備動物糖尿病模型中，以化學(xué)藥物或手術(shù)切除胰腺最為常見?；瘜W(xué)藥物又以四氧嘧啶(ALLoxan，ALX)為常用，ALX制備糖尿病模型的方法已經(jīng)被用了60年了，是目前研究人類糖尿病較好的方法，其致動物糖尿病的作用機(jī)制之一是它在體內(nèi)通過影響葡萄糖激酶的活性，減少葡萄糖載體和葡萄糖激酶信使RNA的濃度，氧化生成OH、O2-自由基，使細(xì)胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，破壞胰島細(xì)胞，從而使胰島素分泌不足，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。采用的給藥方法有一次或連續(xù)腹腔注射或者靜脈注射等。給藥方式、注射劑量以及動物種屬的不同，對受試動物胰島β細(xì)胞的損傷不同。本發(fā)明參考相關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)摸索，最終確定給藥方式一次性尾靜脈注射四氧嘧啶，注射劑量為100mg/kg體重。在給藥后的第3～4天，胰島的損害較大。本實(shí)驗(yàn)中，注射四氧嘧啶的動物在注射四氧嘧啶后第三天血糖測定高于正常對照組，表明糖尿病模型成功建立。該模型穩(wěn)定性好，成功率高，對小鼠刺激較少。
6.1復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)動物血糖、胰島素的影響 高血糖是糖尿病的主要臨床特征，而改善糖代謝，控制血糖至理想水平是糖尿病治療的主要目的之一。研究結(jié)果顯示，復(fù)方降糖滴丸可改善糖尿病小鼠糖代謝，具有明顯的降血糖效應(yīng)。
無論是I型糖尿病還是II型糖尿病，長期的高血糖水平本身也可致胰島β細(xì)胞損害，而且高葡萄糖水平致胰島β細(xì)胞毒性是不可逆轉(zhuǎn)的。制造糖尿病模型的化學(xué)藥物ALX主要損傷胰島細(xì)胞，特別是胰島β細(xì)胞，可引起β細(xì)胞INS分泌功能下降，INS分泌減少。而測定血清INS是檢查胰島β細(xì)胞功能的常用指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，復(fù)方降糖滴丸高劑量組可減輕ALX對小鼠胰島β細(xì)胞分泌功能的損害。
6.2復(fù)方降糖滴丸對實(shí)驗(yàn)動物血清脂質(zhì)過氧化的影響 糖尿病患者除胰島β細(xì)胞損傷與過氧化有關(guān)外，胰島素抵抗和血管異常都與氧化應(yīng)激有關(guān)。機(jī)體內(nèi)存在的幾種抗氧化物酶可以預(yù)防氧化應(yīng)激。SOD是重要的抗氧化物酶之一，其主要功能是清除超氧游離基。在糖尿病中，血漿SOD的濃度與胰島素抵抗密切聯(lián)系，SOD能在血管特別是在動脈壁中高度表達(dá)并且能催化超氧陰離子O2-變成過氧化氫和氧氣從而減輕脂質(zhì)過氧化的損害，所以血液及組織中SOD水平是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。
MDA是脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的產(chǎn)物之一，血清中MDA含量可反應(yīng)脂質(zhì)過氧化的程度。脂質(zhì)是生物膜的主要成分，當(dāng)自由基與活性氧攻擊生物膜時(shí)，可對生物膜易造成過氧化損化，同時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。生物膜的過氧化損傷會導(dǎo)致其通透性增加、流動性下降、膜蛋白功能異常等變化，影響和破壞生物膜正常的生理功能，從而對細(xì)胞造成損傷。研究結(jié)果顯示，復(fù)方降糖滴丸對減輕糖尿病小鼠機(jī)體過氧化損傷具有顯著作用，這可能也是復(fù)方降糖滴丸對保護(hù)胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要機(jī)制之一。
權(quán)利要求
1.一種降糖中藥組合物，由質(zhì)量組成如下的組分組成
絞股藍(lán) 10～20份
梔子5～15份
山藥10～30份
玉竹10～30份。
2.如權(quán)利要求1所述的降糖中藥組合物，其特征在于所述組合物質(zhì)量組成如下
絞股藍(lán) 15份
梔子10份
山藥20份
玉竹20份。
3.一種用于制備治療糖尿病的藥物的中藥提取物，制備所述中藥提取物的中藥原料為質(zhì)量比為10～20∶5～15∶10～30∶10～30的絞股藍(lán)、梔子、山藥和玉竹，所述中藥提取物由水提取物和乙醇提取物組成，所述的水提取物和乙醇提取物分別按如下方法制備
(1)水提取物稱取配方量的山藥和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍質(zhì)量的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取溫度為95～100℃，過濾除去藥渣，合并濾液，濃縮，加入乙醇至乙醇體積濃度為80％～90％，放置24h后，抽濾，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末；
(2)乙醇提取物稱取配方量的梔子和絞股藍(lán)，浸泡0.5～2h，加8～12倍質(zhì)量的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，過濾除去藥渣，合并濾液，回收乙醇、濃縮，濃縮液過濾，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末。
4.利用權(quán)利要求1所述中藥組合物制得的降糖滴丸，所述滴丸由如下方法制得
(1)水提取物制備稱取配方量的山藥和玉竹，浸泡0.5～2h，加6～8倍質(zhì)量的水回流提取1～3次，每次1～2h，提取溫度為95～100℃，過濾除去藥渣，合并濾液，濃縮，加入乙醇至乙醇體積濃度為80％～90％，放置24h后，抽濾，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末；
(2)乙醇提取物制備稱取配方量的梔子和絞股藍(lán)，浸泡0.5～2h，加8～12倍質(zhì)量的65％乙醇回流提取1～2次，每次1～2h，過濾除去藥渣，合并濾液，回收乙醇、濃縮，濃縮液過濾，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末；
(3)滴丸制備取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入基質(zhì)攪拌混勻，70～100℃下倒入滴丸機(jī)中，滴入冷凝劑中，冷卻，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸。
5.如權(quán)利要求4所述的滴丸，其特征在于所述步驟(3)中冷凝劑為甲基硅油和液體石蠟質(zhì)量比0.5～5∶1的混合物。
6.如權(quán)利要求4所述的滴丸，其特征在于所述步驟(3)中基質(zhì)為PEGE6000，質(zhì)量用量為水提取物粉末和乙醇提取物粉末總質(zhì)量的8～12倍。
7.如權(quán)利要求4所述的滴丸，其特征在于制備所述滴丸的中藥原料為質(zhì)量比為15∶10∶20∶20的絞股藍(lán)、梔子、山藥和玉竹，所述滴丸由如下方法制得
(1)水提取物制備稱取配方量的山藥和玉竹，浸泡1h，加6倍質(zhì)量的水回流提取3次，每次2h，提取溫度為100℃，過濾除去藥渣，合并濾液，濃縮至相對密度為1.15，加入乙醇至乙醇體積濃度為90％，放置24h后，抽濾，取沉淀干燥粉碎，得到水提取物粉末；
(2)乙醇提取物制備稱取配方量的梔子和絞股藍(lán)，浸泡1h，加10倍質(zhì)量的65％乙醇回流提取2次，每次2h，過濾除去藥渣，合并濾液，回收乙醇、濃縮至對密度為1.12，濃縮液過濾，取沉淀干燥粉碎，得到乙醇提取物粉末；
(3)滴丸制備取水提取物粉末和乙醇提取物粉末，加入質(zhì)量為粉末質(zhì)量10倍的PEGE6000、攪拌混勻，100℃下倒入滴丸機(jī)中，滴入冷凝劑中，冷卻，固化成丸，干燥，得到所述降糖滴丸；所述冷凝劑為甲基硅油和液體石蠟質(zhì)量比2∶1的混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療糖尿病的降糖中藥組合物、提取物及其滴丸。所述降糖中藥組合物，由質(zhì)量組成如下的組分組成絞股藍(lán)10～20份，梔子5～15份，山藥10～30份，玉竹10～30份。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種降糖效果顯著、安全性好的降糖中藥組合物及其滴丸，可明顯提高四氧嘧啶所引起的糖尿病小鼠模型的體重、降低血糖，可提高糖尿病性小鼠血清胰島素水平、減少組織中的氧化產(chǎn)物MDA含量，提高SOD的含量，且效果顯著；本發(fā)明降糖中藥組合物及滴丸不僅具有改善血糖的優(yōu)勢，更具有提高個(gè)體抗氧化，抗應(yīng)激的能力，可綜合治療糖尿病。
文檔編號A61P3/10GK101810775SQ20101014778
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者袁強(qiáng), 何嵐, 黃海靜, 李蘭, 余永華, 胡潔, 毛蕾 申請人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院