專利名稱：一種高效表達抗菌肽餌料藻的構建技術與應用方法
技術領域：
本發(fā)明申請涉及一種能夠高效表達抗菌肽基因的載體的構建方法，以及由此方法得到的表達載體、轉化體以及能夠高效表達抗菌肽的轉基因藻及其應用，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
抗菌肽(antibacterial ρ印tide)最初是從免疫后的昆蟲血淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的一類活性多肽，是一類由20 60個氨基酸組成的活性肽類物質，通常含有2 3個帶正電荷的氨基酸，如精氨酸或賴氨酸，因此又稱陽性抗菌肽。抗菌肽是一種具有雙親性質結構的物質，分子中的疏水部分一般位于C端，而陽離子氨基酸部分位于N端，而且所有抗菌肽的C 末端都是酰胺化的。它的分子量一般在幾千個道爾頓(Da)之間，具有水溶性好，不易被酶水解，熱穩(wěn)定性高等特點。一般的抗菌肽都具有廣譜的抗菌性，對真菌、原生生物也能起一定的抵抗作用，有一些特殊的抗菌肽還能殺死病毒和腫瘤細胞。抗菌肽殺菌具有高效性，在濃度很低的情況下就可以發(fā)揮作用，其最小抑菌濃度一般為0. 25 4μ g/ml。1975年瑞典科學家G. Boman等將蠟狀芽孢桿菌誘導惜古比天蠶 (Hylophoracecropia)產(chǎn)生一種新的肽類物質，命名為天蠶素(cecropins)，這是第一個被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。此后，人們又在細菌、真菌、兩棲類、哺乳動物、植物和人類中相繼發(fā)現(xiàn)并分離得到了多種抗菌肽，迄今為止，已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)了 1700多種抗菌肽。近年來的研究表明，抗菌肽具有不同于一般抗生素的特殊作用機制，使細菌不容易產(chǎn)生耐藥性，有望成為新一代抗菌藥物。天蠶素Cecropin B是一種從家蠶中分離得到的昆蟲抗菌肽，具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、廣譜抗菌等優(yōu)點，更為重要的是Cecropin B對真核細胞幾乎沒有作用，僅僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，是目前已知天然抗菌肽中活力最強的一種。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)屬于綠藻門、團藻目、衣藻科，是一種單細胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(如光合作用、鞭毛組裝、趨光性和生理節(jié)律等) 的模式生物，與酵母細胞有許多共同的特征，素有“光合酵母”之稱。它的遺傳背景清楚，其基因組學研究已近完成，是目前唯一建立細胞核、葉綠體和線粒體三套遺傳轉化系統(tǒng)的生物材料。由于其生長速度快、光合效率高、可進行基因定點整合，是最適合構建轉基因光合生物反應器的單細胞真核生物，具有非常廣闊的應用前景。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)日益嚴重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑?？咕木哂锌咕V廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變和對動植物無毒副作用等特點，其作為理想的抗生素替代品，正受到人們越來越多的重視，在養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應用前景?？咕牡谋磉_在大腸桿菌和酵母細胞中已經(jīng)存在， 特別是在酵母細胞中有較好的表達效果，但還未有在萊茵衣藻中表達抗菌肽的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種能夠在萊茵衣藻內高效表達天蠶素B基因的表達載體，以及經(jīng)過該表達載體轉化得到的轉化子，由于經(jīng)轉化得到的轉基因萊茵衣藻能夠高效表達天蠶素B，所以可以作為活體餌料，也可以應用于動物飼料添加劑、生物制藥、保健品研制等領域。本發(fā)明是通過以下方法實現(xiàn)的一種高效表達抗菌肽餌料藻的構建技術，其特征在于將人工合成的含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因導入受體藻株中，經(jīng)篩選得到能高效表達抗菌肽的轉基因藻，此方法包括以下步驟1)轉基因受體藻的篩選與培養(yǎng)選用餌料藻(如底棲硅藻、小球藻、萊茵衣藻等) 作為轉基因受體藻株，具有生長迅速、易培養(yǎng)等特點。采用藻類特定培養(yǎng)基(如BBM、BG-11 和TAP等)，在光照90 200 μ E/m2. s的條件下通氣培養(yǎng)；2)抗菌肽基因的合成a、根據(jù)抗菌肽基因序列(如Cecropin B等)和受體藻基因組偏愛密碼子表，設計適合于藻類表達的抗菌肽序列，并通過人工合成的方法合成抗菌肽基因。b、利用連接肽序列將抗菌肽基因串聯(lián)組合，形成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因；3)藻類抗菌肽表達載體的構建將串聯(lián)抗菌肽基因(如串聯(lián)Cecr0pinB，4個串聯(lián))插入藻類表達載體(如萊茵衣藻PH105載體的Nhe I和Pmac I位點)，獲得抗菌肽基因表達框架，然后分別將抗菌肽基因表達框架插入帶篩選標記表達盒的載體(如萊茵衣藻 PSP124的EcoR I位點)，獲得帶篩選標記的抗菌肽基因衣藻核表達載體；4)抗菌肽基因表達載體的遺傳轉化與轉基因藻的篩選分別將抗菌肽基因表達載體，通過“珠磨法”、基因槍法或電擊轉化法進行遺傳轉化。通過抗性平板篩選或營養(yǎng)缺陷型篩選，獲得陽性藻落，進行分子檢測和表達產(chǎn)物分析，確定高效表達抗菌肽的轉基因藻。上述的連接抗菌肽單體成為串聯(lián)抗菌肽基因的連接肽編碼序列，其特征在于藻類細胞中表達產(chǎn)物是6個氨基酸的肽段，且在細胞內能進行自剪切(如萊茵衣藻連接肽序列 LWMRFA等)，通過連接肽將抗菌肽單體基因連接起來，形成易于操作的串聯(lián)抗菌肽基因片段。上述的轉抗菌肽基因受體藻株，其特征在于能夠作為餌料或飼料的藍藻、綠藻、硅藻、甲藻等微藻。上述的抗菌肽基因，其特征包括能在藻類細胞中有效表達的不同來源和種類的抗菌肽基因，直接或經(jīng)過藻類優(yōu)先密碼子改造后，轉入受體藻株，獲得表達具有抗菌活性的轉基因藻。上述的高效表達抗菌肽的轉基因藻，其應用方法包括1)直接作為水產(chǎn)動物的活體餌料，或飼養(yǎng)動物的活體飼料；2)大量培養(yǎng)后制成干藻粉，添加到水產(chǎn)動物餌料或家養(yǎng)動物飼料中，其添加比例根據(jù)需要可以達到-99% ；3)大量培養(yǎng)轉基因藻后，從藻細胞中提取具有抗菌活性的重組抗菌肽，應用于醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、動物飼料和保健品等制品。


圖1目的基因序列設計圖2萊茵衣藻重組表達載體的構建圖3菌落PCR鑒定圖4衣藻表達載體酶切鑒定圖5衣藻總DNA的PCR鑒定圖6轉基因衣藻的RT-PCR鑒定圖7轉基因衣藻Western Blot鑒定圖
圖8抑菌圈實驗圖。
具體實施例方式1.材料與方法1. 1 材料質粒pH105 (含衣藻hsp70-RBCS2啟動子和RBCS2終止子)，質粒pSP124 (帶有ble 基因，使宿主細胞具有腐草霉素和Zeomycin抗性)，大腸桿菌ToplO、JM109菌株由本實驗室保存，萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii CC-849)由美國 Duke 大學 Chlamydomonas 遺傳中心提供，打孔器、T4 DNA連接酶、限制性內切酶Nhe I.Sal I和EcoR I購自TaKaRa 生物(大連)有限公司，DNAExtraction kit購自晶美生物工程有限公司，Ε. Ζ. N. A Plasmid Miniprep KitI 購自 Promega 公司，DNA Fragment Purification Kit Ver 2.0、 RNA PCRKit (AMV) ver 3· O購自TaKaRa生物(大連)有限公司。1.2 方法1. 2. 1人工合成串聯(lián)CecropinB基因根據(jù)萊茵衣藻偏好的密碼子，由于萊茵衣藻細胞核內基因對于G、C兩種堿基有很強的偏愛性，因此我們依據(jù)密碼子的簡并性特點結合萊茵衣藻偏愛密碼子表對原始的 CecropinB基因進行了改造，改造后的基因序列在不改變原有氨基酸序列的基礎上，提高了基因編碼序列的GC含量。改造并化學合成CecropinB (Genebank登陸號為AAA29184)。 將四段相同的Cecropin B基因依次串聯(lián)起來，中間加上了萊茵衣藻的自剪切連接肽序列 LWMRFA，末尾加上His6標簽，兩端設計了 Nhe I.Sal I限制性內切酶，總基因長度為522bp， 由上海生工完成整個外源基因的合成工作。1. 2. 2萊茵衣藻重組表達載體的構建先將外源基因連接到含有hsp70_RBCS2啟動子和RBCS2終止子的pH105載體上，構建載體PCB105，接著將pCB105上的表達框架切下連接到含有ble篩選基因的載體 PSP124上構建最終的衣藻表達載體pCB124。載體構建完成后進行PCR、酶切鑒定以及基因測序來驗證基因序列的正確性。1. 2. 3 “玻璃珠法”轉化萊茵衣藻并篩選陽性克隆子對于經(jīng)Not I酶切的重組質粒PCB124線性化后，采用“玻璃珠法”轉化萊茵衣藻細胞，轉化后涂布在含 ο μ g/mL的Zeomycin TAP平板上，于22°C光照培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，觀察綠色單克隆藻落生長情況。取20ml處于對數(shù)生長后期的萊茵衣藻培養(yǎng)液，于4°C 5000rpm離心5min，去上清， 收集藻細胞。提取萊茵衣藻CC-849和轉基因衣藻的基因組DNA進行PCR鑒定，檢驗有無基因整合入萊茵衣藻中。1. 2. 4轉基因衣藻的RT-PCR分析提取萊茵衣藻CC-849和轉基因衣藻的總RNA，取1 μ g作為模板，采用TaKaRa 生物(大連)有限公司的RNA PCR Kit(AMV)ver 3. 0進行反轉錄，然后以引物PI、P2 進行 RT-PCR 擴增(弓丨物 Pl 序列為5，-GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTC-3, P2 序列為 5，-GTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGT-3’ )。RT-PCR 條件30°C, IOmin ；50°C，40min ；99°C，5min ；5°C，5min。PCR 條件94°C變性 3min，94°C，30s ；60°C, Imin ；72°C，lmin，30 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin01. 2. 5轉基因衣藻的Western blot分析由于衣藻表達載體pH105的啟動子為HSP70A-RBCS2，串聯(lián)有熱休克蛋白HSP70A的啟動子，此啟動子具有熱激誘導的特性。分別將萊茵衣藻cc-849和轉基因衣藻接種于新鮮的TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在光照下培養(yǎng)至對數(shù)中后期，進行二次熱激誘導外源蛋白的表達。先置于40°C培養(yǎng)箱下，光照熱激誘導30min，然后放回22°C光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)5h ；光照完畢后再次置于40°C培養(yǎng)箱下，進行第二次熱激誘導30min，再放回22°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh。提取衣藻總蛋白，使用His6單克隆抗體作為一抗，堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG 作為二抗，進行免疫印記，檢測轉基因衣藻中目的蛋白CecropinB的表達。1.2. 6抑菌圈法檢測蛋白抑菌活性在LB平板上涂布IOOul培養(yǎng)至對數(shù)期的JM109細菌，待菌液稍干后用滅菌的打孔器打孔，接著用液體的LB —滴封底，加入IOOul藻蛋白提取液，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h觀察抑菌圈形成情況。1. 2. 7比濁法檢測實驗方法在0. 5ml的Enppendorf管中按以下比例加樣JM109過夜培養(yǎng)物5 μ L(0D = 1)， LB培養(yǎng)液50 μ L，實驗組轉基因衣藻和野生型衣藻蛋白抽提上清液(蛋白濃度為0. 03mg/ ml)分別加75 μ L (對照組用等量LB補加)，混勻，于37°C水浴2. 5 3h，其間不斷搖勻，然后稀釋至3mL的LB液中，同樣輕搖溫育lh，取出在721分光光度計上測溶液在600nm處的 OD值。2、結果與分析2. 1串聯(lián)抗菌肽的設計與合成人工合成的基因序列設計如圖1所示，將上海生工合成的串聯(lián)CecropinB基因送與深圳欣海凌生物公司測序，測序報告顯示結果表明，串聯(lián)CecropinB基因序列與上海生工提供的合成報告單完全相符?；蛟O計序列如下GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGG
CGAGGCCAAGGCGCTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGTCGACpCB124載體測序序列如下GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCTGTGGATGCGCTTCGCCAAGTGGAAGGTGTTCAAGAAGATCGAGAAGATGGGCCGCAACATCCGCAACGGCATCGTGAAGGCCGGCCCCGCGATCGCGGTGCTGGGCGAGGCCAAGGCGCTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGTCGAC由于萊茵衣藻細胞核內基因對于G、C兩種堿基有很強的偏愛性，因此我們依據(jù)密碼子的簡并性特點結合萊茵衣藻偏愛密碼子表對原始的CecropinB基因進行了改造，改造后的基因序列在不改變原有氨基酸序列的基礎上，提高了基因編碼序列的GC含量，經(jīng)過改造后的串聯(lián)CecropinB基因全長522bp，其中GC含量為64.2%，極大地滿足了萊茵衣藻基因組對于GC堿基的偏愛性，從而使得串聯(lián)CecropinB基因更易整合入萊茵衣藻基因組中并獲得穩(wěn)定表達。2. 2含串聯(lián)抗菌肽萊茵衣藻表達載體的構建如圖2所示，將CecropinB基因克隆到含hsp70_RBCS2啟動子和RBCS2終止子的 PH105載體上，再與攜帶ble篩選基因的表達框架連接，構建重組表達載體PCB124。載體構建好后進行菌落PCR以及酶切鑒定。2. 3萊茵衣藻重組表達載體的菌落PCR鑒定挑取轉化子單克隆劃線保種后，進行菌落PCR鑒定。從圖3可以看到，在重組菌 CB-UCB-2與陽性對照(含有目的基因的質粒)的PCR圖譜上分別可看到一條522bp的條帶，與目的基因大小相同，據(jù)此，我們可以判斷目的基因已經(jīng)連接到了相應的載體上。CB-I 菌落PCR結果圖出現(xiàn)目的條帶，說明目的基因已經(jīng)連接到了含有hsp70-RBCS2啟動子和 RBCS2終止子的pH105載體上，具有了可以順利表達的表達初步框架，CB-2菌落PCR結果出現(xiàn)目的條帶，則說明了最終的表達載體上連接上了 ble篩選基因，ble篩選基因的存在是為了便于在轉化子平板上篩選出對Zeomycin具有抗性的陽性轉化子。2. 4萊茵衣藻重組表達載體PCB124的酶切鑒定如圖4所示，用Nhe I和Sal I限制性內切酶酶切pCB57質粒，切下含有522bp的目的基因CecropinB (泳道1)，將之連接至經(jīng)Nhe I和Sal I雙酶切后的pH105載體上。經(jīng)酶切鑒定結果顯示，獲得了插入目的基因的載體pCB105(泳道3)。將pCB105采用EcoR I 酶切，得到包含萊茵衣藻hsp70-RBCS2啟動子和RBCS2終止子以及插入CecropinB基因的表達框架，全長1300bp。再將CecropinB基因表達框架與經(jīng)EcoR I酶切后的pSP124載體連接，轉化大腸桿菌TOPlO后經(jīng)酶切鑒定，篩選出正確的重組質粒PCB124 (泳道5，亦可用 EcoR I酶切下一條長1300bp的表達框架)。由此結果可以驗證，衣藻表達載體PCB124已經(jīng)構建成功。為了驗證我們所構建的表達載體基因是否有突變以及方向性的正確性，我們將重組載體送與深圳欣海凌生物公司測序，測序結果顯示所構建載體PCB124沒有發(fā)生基因突變，串聯(lián)CecropinB基因與合成序列同源性為100%，并且各個片段連接方向正確，含有ble 基因序列。至此，萊茵衣藻重組表達載體已經(jīng)完全被驗證構建成功。2. 5轉基因衣藻的PCR分析.如圖5所示，轉化子經(jīng)Zeomycin TAP平板抗性篩選獲得陽性克隆后，劃線保種陽性轉化子。提取轉基因衣藻和野生型萊茵衣藻基因組DNA，以引物P1、P2進行PCR。轉基因衣藻PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段。這表明CecropinB 基因已經(jīng)整合到萊茵衣藻基因組中。由于串聯(lián)CecropinB基因整合進入萊茵衣藻基因組中的方式是隨機進行的，因此，采用相同的外源基因轉化萊茵衣藻，可以產(chǎn)生不同的轉化子， 它們可能都能夠在Zeomycin TAP抗性平板上生長，但是卻可能整合到萊茵衣藻基因組的不同位置。2. 6轉基因衣藻的RT-PCR分析如圖6所示，提取轉基因衣藻和野生型萊茵衣藻的總RNA，以TaKaRa PCR(AMV)Kit ver 3.0進行反轉錄。以轉基因衣藻cDNA為模板，引物P1、P2進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過
瓊脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段。這表明CecropinB基因在轉錄水平上已經(jīng)獲得了表達。轉錄水平上的表達成功，說明了串聯(lián)CecropinB基因能夠成功進行自我復制，并且CecropinB基因在萊茵衣藻的細胞中能夠轉錄獲得相應的mRNA。2. 7轉基因衣藻的Western Blot分析如圖7所示，HSP70A-RBCS2啟動子是一個熱激誘導型啟動子，在40°C條件下熱激一定的時間，能顯著的提高外源基因的表達水平。將萊茵衣藻cc-849、轉CecropinB基因衣藻置于40°C下，進行二次熱激誘導，以提高CecropinB基因在萊茵衣藻中的表達量。使用His6單克隆抗體作為一抗、堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG作為二抗與提取的衣藻總蛋白進行免疫反應，以檢測萊茵衣藻中CecropinB的表達。與對照組相比，在14KD和20KD 附近各有一雜交信號帶，推測該條帶可能為不同數(shù)目的抗菌肽蛋白單體的表達產(chǎn)物。一個 CecropinB抗菌肽單體含有36個氨基酸，由此可計算出一個抗菌肽單體蛋白的分子量為 4. 3KD，加上中間2個連接肽序列，一個連接肽含有6個氨基酸，那么兩個連接肽序列表達的蛋白分子量應該為1. 4KD，因此三個多肽式抗菌肽單體和兩個連接肽序列的表達產(chǎn)物總分子量應該為14. 3KD，這與我們從圖7上看到的蛋白分子量的位置是相吻合的。同理我們可以計算出四個多肽式抗菌肽單體加上三個連接肽序列以及6個His組氨酸標簽蛋白的總分子量應該為20. 08KD，這與我們圖7中反應的條帶位置也是相一致的。此結果說明了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中確實可以獲得不同程度的表達。 從而從蛋白水平上印證了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中表達的可行性。2. 8抑菌圈法鑒定蛋白功能結果分析從圖8中我們可以看到，轉基因衣藻總蛋白抑菌效果圖中出現(xiàn)了明顯的抑菌圈， 而野生型衣藻總蛋白抑菌效果圖中則沒有出現(xiàn)抑菌圈，經(jīng)測量得知轉基因衣藻總蛋白抑菌圈半徑長為0.2cm。由此我們可以推斷，轉基因衣藻總蛋白對細菌具有抑制作用，野生型衣藻總蛋白對細菌不具有抑菌作用。這說明，我們的串聯(lián)CecropinB基因已經(jīng)成功轉入單細胞生物萊茵衣藻CC-849中，并且在萊茵衣藻中獲得了成功表達，更重要的是，串聯(lián) CecropinB基因所表達的目的基因具有蛋白活性即抗菌生物活性。因此當具有抗菌生物活性的轉基因衣藻總蛋白提取物加入到孔洞內時，就會在空洞的周圍出現(xiàn)顯著的抑菌透明圈，相反，野生型衣藻總蛋白則由于沒有外源抗菌肽基因的導入，不能表達抗菌活性的蛋白，所以就不能產(chǎn)生抑菌圈。2. 9比濁法測量實驗結果及分析比濁法測量抑菌效果是將細菌培養(yǎng)至對數(shù)期后，實驗組加入轉基因衣藻與野生型衣藻總蛋白提取物，對照組加入LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)一段時間后，測量培養(yǎng)液的OD值，將實驗組 OD值與對照組OD值做比較，用實驗組相對于對照組細菌OD值降低的程度來說明其抑菌效果，OD值降低越大，說明加入實驗組蛋白后菌數(shù)量減少的越多，則該組蛋白具有越強的抑菌效果。表比濁法測量抑菌效果數(shù)據(jù)
權利要求
1.一種在藻類中高效表達抗菌肽的載體構建方法，其特征在于此方法包括以下步驟1)根據(jù)抗菌肽基因序列和受體藻基因組偏愛的密碼子表，設計合成適合于藻類表達的抗菌肽基因序列；2)利用連接肽序列將抗菌肽基因串聯(lián)組合，形成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因；3)將串聯(lián)抗菌肽基因插入含有藻類啟動子和終止子的表達載體，獲得抗菌肽基因表達框架；4)將抗菌肽基因表達框架插入帶篩選標記表達盒的載體中，獲得帶篩選標記的抗菌肽基因的表達載體。
2.如權利要求1所述的在藻類中高效表達抗菌肽的載體構建方法，其特征在于在萊茵衣藻中表達抗菌肽Cecropin B基因的表達載體構建方法包括以下步驟1)根據(jù)萊茵衣藻基因組偏愛的密碼子，設計合成適合于萊茵衣藻表達的天蠶素 Cecropin B基因序列；1)將四段相同的CecropinB基因依次串聯(lián)起來，中間加上了萊茵衣藻的自剪切連接肽序列LWMRFA，末尾加上His6標簽，兩端設計了 Nhe I、Sal I限制性內切酶，總基因長度為 522bp ；2)將串聯(lián)CecropinB基因連接到含有hsp70_RBCS2啟動子和RBCS2終止子的pH105載體上，構建載體PCB105，獲得天蠶素CecropinB基因表達框架；3)用限制性內切酶NheI.Sal I將pCB105上的天蠶素CecropinB基因表達框架切下， 連接到含有ble篩選基因的載體PSP124上，構建最終的衣藻表達載體pCB124。
3.一種高效表達抗菌肽轉基因藻的構建技術，其特征在于將人工合成的含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因導入受體藻株中，經(jīng)篩選得到能高效表達抗菌肽的轉基因藻，此方法包括以下步驟1)轉基因受體藻的篩選與培養(yǎng)選用餌料藻作為轉基因受體藻株，具有生長迅速、易培養(yǎng)等特點，采用藻類特定培養(yǎng)基，在光照90 200μ E/m2. s的條件下通氣培養(yǎng)；2)抗菌肽基因的合成a、根據(jù)抗菌肽基因序列和受體藻基因組偏愛密碼子表，設計適合于藻類表達的抗菌肽序列，并通過人工合成的方法合成抗菌肽基因；b、利用連接肽序列將抗菌肽基因串聯(lián)組合，形成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因；3)藻類抗菌肽表達載體的構建將串聯(lián)抗菌肽基因插入藻類表達載體，獲得抗菌肽基因表達框架，然后分別將抗菌肽基因表達框架插入帶篩選標記表達盒的載體，獲得帶篩選標記的抗菌肽基因表達載體；4)抗菌肽基因表達載體的遺傳轉化與轉基因藻的篩選分別將抗菌肽基因表達載體， 通過“珠磨法”、基因槍法或電擊轉化法進行遺傳轉化，通過抗性平板篩選或營養(yǎng)缺陷型篩選，獲得陽性藻落，進行分子檢測和表達產(chǎn)物分析，確定高效表達抗菌肽的轉基因藻。
4.如權利要求3所述的高效表達抗菌肽轉基因藻的構建技術，其特征在于采用萊茵衣藻作為受體藻株，構建能表達天蠶素Cecropin B轉基因藻的方法，具體包括以下步驟1)轉基因受體萊茵衣藻的篩選與培養(yǎng)選擇細胞壁缺陷型萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii cc-849作為轉基因的受體藻株，使用TAP培養(yǎng)基作為萊茵衣藻的培養(yǎng)基，萊茵衣藻的培養(yǎng)條件包括在22-25°C，90 μ E/m2/s光照條件下連續(xù)培養(yǎng)，藻細胞對數(shù)生長期濃度達到l-2X106cellS/mL時，收集藻細胞進行遺傳轉化；2)串聯(lián)抗菌肽CecropinB基因的改造與合成根據(jù)萊茵衣藻偏好的密碼子，由于萊茵衣藻細胞核內基因對于G、C兩種堿基有很強的偏愛性，因此依據(jù)密碼子的簡并性特點結合萊茵衣藻偏愛密碼子表，對原始的CecropinB基因進行改造，改造后的基因序列在不改變原有氨基酸序列的基礎上，提高了基因編碼序列的GC含量；將四段改造后的Cecropin B基因依次串聯(lián)起來，中間加上了萊茵衣藻的自剪切連接肽序列LWMRFA，末尾加上His6標簽， 兩端設計了 Nhe I、Sal I限制性內切酶，設計總基因長度為522bp串聯(lián)CecropinB基因序列；3)抗菌肽CecropinB基因萊茵衣藻表達載體的構建先將總長度為522bp串聯(lián) CecropinB基因序列連接到含有hsp70_RBCS2啟動子和RBCS2終止子的pH105載體上，構建載體PCB105 ；接著將PCB105上的表達框架切下，連接到含有ble篩選基因的載體pSP124 上構建最終的衣藻表達載體PCB124 ；4)表達載體的遺傳轉化采用QIAGENePlasmidPurification Kit分別提取重組質粒PCB124，經(jīng)Not I酶切的重組質粒，使其線性化后進行遺傳轉化，其遺傳轉化方法包括 “珠磨法”、“基因槍法”和“電擊轉化法”；5)能表達CecropinB轉基因萊茵衣藻篩選鑒定，包括以下步驟(1)轉基因藻PCR檢測人工合成引物P1、P2，轉化子經(jīng)ZeomycinTAP平板抗性篩選獲得陽性克隆后，劃線保種陽性轉化子；提取轉基因衣藻和野生型萊茵衣藻基因組DNA ；利用引物 P1、P2 進行 PCR 反應，PCR 條件94°C變性 3min，94°C，30s ；60°C，lmin ；72°C，lmin，30 個循環(huán)，72°C延伸IOmin ；轉基因衣藻PCR產(chǎn)物經(jīng)過1 %瓊脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段；這表明CecropinB基因已經(jīng)整合到萊茵衣藻基因組中；(2)轉基因藻的RT-PCR檢測提取轉基因衣藻的總RNA，取1μ g作為模板，采用TaKaRa 生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)ver 3. O進行反轉錄，然后以引物P1、P2進行RT-PCR擴增，RT-PCR 條件30°C, IOmin ；50°C，40min ；99°C，5min ；5°C，5min ；RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊 脂糖凝膠電泳，顯示出522bp大小的基因片段，這表明CecropinB基因在轉錄水平上已經(jīng)獲得了表達，轉錄水平上的表達成功，說明了串聯(lián)CecropinB基因能夠成功進行自我復制，并且CecropinB基因在萊茵衣藻的細胞中能夠轉錄獲得相應的mRNA ；(3)轉基因藻的Western-Blot檢測將萊茵衣藻cc_849、轉CecropinB基因衣藻置于40°C下，進行熱激誘導以提高CecropinB基因在萊茵衣藻中的表達量，使用His6單克隆抗體作為一抗、堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG作為二抗與提取的衣藻總蛋白進行免疫反應，以檢測萊茵衣藻中CecropinB的表達，此結果說明了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中確實可以獲得不同程度的表達，從而從蛋白水平上印證了串聯(lián)CecropinB基因在萊茵衣藻中表達的可行性。
5.如權利要求4所述的高效表達抗菌肽轉基因藻的構建技術，其特征在于所述的弓丨物Pl序列為5，-GCTAGCATGAAGTGGAAGGTGTTC-3, P2序列為 5’ -GTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGT-3’。
6.如權利要求1或2所述的在藻類中高效表達抗菌肽的載體構建方法，其特征在于 所述的連接肽是藻類細胞中存在的6個氨基酸左右的肽，且在細胞內能進行自剪切，萊茵衣藻連接肽序列為LWMRFA，通過連接肽將抗菌肽單體基因連接起來，形成易于操作的串聯(lián)抗菌肽基因片段，在藻類中表達后能利用藻細胞內的自剪切機制將串聯(lián)肽切開成具有活性的單體抗菌肽。
7.如權利要求3或4所述的高效表達抗菌肽轉基因藻的構建技術，其特征在于能夠作為餌料或飼料的微藻包括藍藻、綠藻、硅藻和甲藻。
8.如權利要求1或2所述的在藻類中高效表達抗菌肽的載體構建方法，其特征在于 所述的抗菌肽基因包括能在藻類細胞中有效表達的不同來源和種類的抗菌肽基因，直接或經(jīng)過藻類優(yōu)先密碼子改造后，轉入受體藻株，能獲得表達具有抗菌活性的轉基因藻。
9.權利要求3或4所述的高效表達抗菌肽轉基因藻的構建技術所得到的轉基因藻的應用包括以下方面1)直接作為水產(chǎn)動物的活體餌料，或飼養(yǎng)動物的活體飼料；2)大量培養(yǎng)后制成干藻粉，添加到水產(chǎn)動物餌料或家養(yǎng)動物飼料中，其添加比例根據(jù)需要可以達到-99% ；3)大量培養(yǎng)轉基因藻后，從藻細胞中提取具有抗菌活性的重組抗菌肽，應用于醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、動物飼料和保健品領域。
全文摘要
本發(fā)明申請公開了一種高效表達抗菌肽的基因工程餌料微藻的構建技術與應用方法。根據(jù)藻類偏愛的密碼子，設計改造并人工合成含連接肽序列的串聯(lián)抗菌肽基因，將串聯(lián)抗菌肽基因克隆到含藻類高效啟動子和終止子的載體上，再與攜帶篩選基因的表達框架連接，構建重組表達載體。采用玻璃珠轉化法、基因搶法或電擊轉化法將重組表達載體轉入微藻中，并篩選得到轉基因藻。本發(fā)明生產(chǎn)的轉基因藻具有高效表達抗菌肽的能力，其藻細胞或提取物均具有抗菌特性，可以作為活體餌料，也可以應用于動物飼料添加劑、生物制藥、保健品研制等領域。
文檔編號A61P31/00GK102220362SQ20101014881
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權日2010年4月16日
發(fā)明者穆菲蕓, 胡章立 申請人:深圳大學, 深圳市深博泰生物科技有限公司