專利名稱：一種新型人源化抗cd20單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及單克隆抗體人源化技術(shù)，基因重組技術(shù)及抗體的表達(dá)制備。與鼠抗，人鼠嵌合抗體和其他人源化抗體相比，本發(fā)明所涉及的新型人源化抗CD20單克隆抗體進(jìn)一步降低了抗體的免疫原性，同時(shí)保持了良好的抗原識(shí)別活性和體內(nèi)體外抗瘤功能，有更好的臨床應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
CD20屬于MS4A蛋白家族，有四個(gè)跨膜區(qū)域，C端和N端位于細(xì)胞膜內(nèi)，分子量約為!35kDa(Cragg，et al, Curr. Dir. Autoimmun. 8 :140-174)。CD20 作為 B 淋巴細(xì)胞表面膜蛋白，與B淋巴細(xì)胞Ca2+的跨膜傳導(dǎo)密切相關(guān)，對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化具有調(diào)節(jié)作用。 ⑶20僅在前-B淋巴細(xì)胞、未成熟B淋巴細(xì)胞、成熟B淋巴細(xì)胞、激活B淋巴細(xì)胞中表達(dá)，而在漿細(xì)胞、淋巴多能干細(xì)胞以及其它組織均無⑶20的表達(dá)。⑶20的自然配體尚未明確。由于CD20在90%以上B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤高度表達(dá)(Blood63 (6) =1424-1433,1984)，因此CD20成為B細(xì)胞淋巴瘤抗體治療的一個(gè)很好靶點(diǎn)?？笴D20單克隆抗體在體內(nèi)和體外已被證明對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤有很好藥效(Reff ME et al, Cancer Control 2002 ；9 :152-66.)。 當(dāng)抗⑶20抗體與⑶20結(jié)合后，可以通過抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)作用(Clynes RA et al. Nat Med, 2000 ；6 :443-6)，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(CDC)作用(Harjunpaa A，et al, Scand J Immunol 2000 ；51 :634-41)，和 / 或直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(Apoptosis ；Pedersen IM, et al, Blood 2002 ；99 =1314-9)等綜合機(jī)制來殺傷腫瘤細(xì)胞。由于抗⑶20抗體只針對(duì)性地殺傷帶有CD20表面抗原的B細(xì)胞，與化療藥相比，大大地降低了治療過程中帶來的副作用， 因此為非何杰金氏淋巴瘤患者提供了一個(gè)有效安全的靶向治療手段。近年來，抗CD20抗體的研究與臨床應(yīng)用發(fā)展迅速。美國食品與藥物管理局于1997，2002，2003年分別批準(zhǔn)了 CD20抗體美羅華(Rituximab) Jevalin和Bexxar用于非何杰金氏淋巴瘤的治療。其中，美羅華為人鼠嵌合抗體，包含鼠源單克隆抗體的可變區(qū)和人源IgGl重鏈及κ輕鏈的恒定區(qū) (Gopal and Press, J Lab Clin Med，1999 ;134 :445-450)。Zevalin是鼠單克隆抗體與放射性核素901禹聯(lián)物。Bexxar則是鼠源單克隆抗體與放射性核素131I共價(jià)偶聯(lián)而成。單獨(dú)使用美羅華治療復(fù)發(fā)及難治的非何杰金氏淋巴瘤有效率達(dá)50%左右，與化療藥物聯(lián)合使用， 則有效率可達(dá)90-100%。由于⑶20也在毛細(xì)胞白血病和B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞白血病表達(dá)，近年來，抗CD20抗體臨床適應(yīng)癥進(jìn)一步擴(kuò)大，美羅華與化療聯(lián)合治療慢性淋巴細(xì)胞性白血病已產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果(Cheson, et al. 2006, Cancer Immunol. Immunother. 55 188-196.)。由于良好的療效及較低的副作用，美羅華已經(jīng)成為銷售額最大的抗腫瘤藥物之一，2008年的銷售額近50億美元。
此外，B細(xì)胞在自身免疫疾病發(fā)病機(jī)理中也起核心作用。多種自身免疫疾病涉及B 細(xì)胞異常激活，產(chǎn)生抗自身抗體，介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。包括急性特發(fā)性血小板減少性紫癜， 慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜，重癥肌無力，狼瘡性腎炎，紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。最常用的治療藥物是皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒類藥物，這些藥物毒性很大，對(duì)骨髓，肝臟和腎臟有毒副作用，并且可抑制整個(gè)免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的感染。近年來，抗B細(xì)胞療法已被證明能有效治療人自身免疫疾病。美羅華可有效地減少體內(nèi)B淋巴細(xì)胞，消除B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體。用于治療自身免疫疾病，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可顯著改善癥狀。FDA已批準(zhǔn)美羅華治療中重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者(Summers et al，2005. Ann. Pharmacother. 39 :2091-2095)。
然而給予治療性抗體的最大隱患是人體對(duì)外源抗體蛋白所引起的免疫應(yīng)答，而產(chǎn)生抗抗體反應(yīng)(AAR)。鼠源抗體作為外源蛋白，反復(fù)刺激人體，可引起超敏反應(yīng)，被稱為人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)。因此鼠源抗體在體內(nèi)可能被抗抗體中和，進(jìn)而被快速清除，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)而致死。另外，鼠源單克隆抗體缺乏人抗體具有的免疫效應(yīng)功能，如ADCC和 CDC作用，而療效不佳。美羅華作為人鼠嵌合抗體，雖然含有人的Fc段，但在抗體的重輕鏈可變區(qū)仍然是鼠抗序列，仍被人體視為外源蛋白，導(dǎo)致免疫原性，產(chǎn)生中和抗體，降低持續(xù)性用藥的治療效果。尤其低劑量長(zhǎng)期治療，更易產(chǎn)生免疫原性。美羅華在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡時(shí)比治療非何杰金氏淋巴瘤免疫原性更高(Cartron G. et al, Critical Reviews in Oncology/Hematology, Volume 62)。
為進(jìn)一步減低免疫原性，產(chǎn)生了以“CDR移植”為主要手段的抗體人源化技術(shù) (Riechman et al. Nature, 332 =323-327,1988) 該技術(shù)將鼠抗的CDR區(qū)移接連入人抗體的框架區(qū)。從而減少鼠抗框架區(qū)導(dǎo)致的免疫原性。目前，用此技術(shù)獲得的人源化抗CD20 抗體包括健泰科生物技術(shù)公司的2H7單抗(CN101418045A)；免疫醫(yī)療公司的A20單抗 (CN1662557A) ；VACCINEX 公司的 H1286/L373，大阪大學(xué)的 1K1791 單抗(W02009031230A1) 以及中信國健的9D3單抗。
盡管如此，這類抗體的人源化框架與鼠源性CDR區(qū)的氨基酸組合也可能被T細(xì)胞識(shí)別而引起免疫應(yīng)答。T細(xì)胞對(duì)異源蛋白的識(shí)別主要由抗原呈遞細(xì)胞表面的MHC II與蛋白多肽結(jié)合后，呈遞給T細(xì)胞受體，進(jìn)而活化淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，設(shè)計(jì)選擇人源框架時(shí)，應(yīng)能夠盡可能降低其框架多肽與MHC II (HLA-DR)分子的結(jié)合，從而使人源化抗體的免疫應(yīng)答降低到最小。本發(fā)明人源化抗體在鼠2B8(Reff，M.E.等(1994)Blood 83 =435-445)的序列基礎(chǔ)之上，依靠本申請(qǐng)描述的抗體人源化技術(shù)，設(shè)計(jì)選擇了與MHC II(HLA-DR)結(jié)合位點(diǎn)少的人胚系(germline)抗體框架序列進(jìn)行2B8的人源化，大大的減少免疫原性。同時(shí)，在低免疫源性框架的前提下，通過分子對(duì)接的方法適當(dāng)調(diào)整CDR區(qū)的序列結(jié)構(gòu)，可保持或提高良好的抗原識(shí)別活性和體內(nèi)體外抗瘤功能。對(duì)多種涉及B細(xì)胞異常激活的自身免疫疾病，也有廣泛應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種人源化抗⑶20單克隆抗體，該抗體的重鏈可變區(qū)由SEQ ID N0 15, SEQ ID NO :16或SEQ ID NO :36所示的氨基酸序列組成，輕鏈可變區(qū)含有SEQID NO :34， SEQ ID N0:35或SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列組成。
本發(fā)明涉及一種人源化抗CD20單克隆抗體，所述人源化抗CD20單克隆抗體是表 1中所示抗體，即為人源化抗體1534、16；34、1535、1635或3637。
如上所述的抗體，其中所述抗體可以是一種單價(jià)抗體，多價(jià)抗體，單鏈抗體，一種含有單一抗原結(jié)合臂的抗體，或Fc區(qū)修飾的可與毒性藥物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明涉及一種DNA分子，它編碼如上所述的抗體。
本發(fā)明涉及一種RNA分子，它編碼上述所述的抗體，或含有編碼如上所述的抗體的DNA序列的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，它含有編碼如上所述的抗體的DNA分子。
本發(fā)明涉及一種宿主細(xì)胞，它含有載體，所述載體含有編碼如上所述的抗體的DNA 分子。
本發(fā)明涉及一種組合物，其包含如上所述的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明涉及一種組合物，它含有如上所述的抗體以及藥學(xué)上可接受的輔料制成的制劑，用于對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤，白血病和與B細(xì)胞有關(guān)的多種自身免疫病的臨床治療。
本發(fā)明涉及一種制品，包含一種容器以及容器中的組合物，所述組合物包含如上所述的抗體。
本發(fā)明涉及如上所述的人源化CD20結(jié)合抗體，在制備治療CD20陽性癌癥、B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞白血病、自身免疫病例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、重癥肌無力、狼瘡性腎炎、紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
本發(fā)明涉及一種篩選和制備如上所述人源化抗體的方法分析鼠抗CD20抗體2B8 的重鏈可變區(qū)的序列，根據(jù)其重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對(duì)人抗體基因序列庫進(jìn)行比較，找出與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline) 抗體(比成熟抗體免疫源性更低)可變區(qū)相對(duì)應(yīng)序列。然后經(jīng)過in silicon方法，如用 NetMHCIIpan軟件或自編軟件，分析所述序列與HLA-DR分子結(jié)合的親和性，選出親和性最低的框架序列，從而最終確立重鏈可變區(qū)的FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的人源化序列。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子模型分析鼠2B8抗CD20抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持CDR構(gòu)型所需保留的鼠2B8抗體對(duì)應(yīng)框架氨基酸殘基(線性序列鄰近CDR抗原結(jié)合位點(diǎn)或據(jù)CDR 6埃以內(nèi)的氨基酸殘基)，設(shè)計(jì)出不同組合的人源化重鏈可變區(qū)的序列，優(yōu)選所述序列；同樣，分析鼠抗CD20抗體2B8的輕鏈可變區(qū)的序列，根據(jù)其輕鏈可變區(qū)FR1， FR2，F(xiàn)R3和FR4序列對(duì)人抗體基因序列庫(NCBI Ig BLAST)進(jìn)行比較，找出與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)序列，然后經(jīng)過insilicon分析所述序列與HLA-DR分子結(jié)合的親和性，選出親和性最低的框架序列，從而最終確立輕鏈可變區(qū)的FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的人源化序列。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子摸型分析鼠2B8抗CD20抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持CDR構(gòu)型所需保留的鼠2B8抗體對(duì)應(yīng)框架氨基酸殘基，設(shè)計(jì)出不同組合的人源化輕鏈可變區(qū)的序列。
在此基礎(chǔ)上，還可以應(yīng)用分子對(duì)接分析⑶20抗原靶位(miANPSm)及其周邊氨基酸殘基·Ε，169ρ，1μΕ和175K與人源化重鏈可變區(qū)的立體空間結(jié)合方式，通過計(jì)算靜電力，溶液媒合(salvation)，范德華引力和熵值，選擇⑶R1，⑶R2和⑶R3序列中可以優(yōu)化的氨基酸，以改善抗體CDR區(qū)域與CD20抗原表位的結(jié)合，以獲得更好活性抗體，優(yōu)選該抗體重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO 36 ； 上述得到的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別連接重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，優(yōu)選連接來源于健康人B淋巴細(xì)胞的重鏈恒定區(qū)IgGl、輕鏈恒定區(qū)κ，從而獲得完整的重鏈和輕鏈，將不同的重鏈和輕鏈進(jìn)行組合獲得所需的抗體分子。
本發(fā)明提供了一種新型人源化抗CD20單克隆抗體，其特點(diǎn)是進(jìn)一步降低了人源化抗體的免疫源性。該抗體由與ID No. 15或^^ ID No. 16相同的氨基酸序列得到的與⑶20結(jié)合的重鏈可變區(qū)和與kq ID No. 34或^^ ID No. 35相同的氨基酸序列得到的與CD20結(jié)合的輕鏈可變區(qū)所組成。本發(fā)明的抗體也可通過

圖10所示位置的CDR區(qū)氨基酸優(yōu)化和通過圖11所示位置的氨基酸優(yōu)化，進(jìn)一步保留和加強(qiáng)其生物活性。通過組合所得到的人源化抗⑶20抗體見表1。
本發(fā)明的抗體可以是單價(jià)的，多價(jià)的或單鏈的抗體。本發(fā)明涉及用該抗體抑制 ⑶20陽性B淋巴細(xì)胞的方法及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。
也可通過修飾本發(fā)明抗體的Fc段來改善效應(yīng)子功能，比如在Fc區(qū)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換或糖基化修飾可能會(huì)增強(qiáng)效應(yīng)子的功能，以致增強(qiáng)抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC) 和/或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)的活性。
也可通過與本發(fā)明抗體偶聯(lián)放射性同位素，化療藥物或毒素，從而增強(qiáng)抗體細(xì)胞毒活性。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 一 .抗⑶20人源化單克隆抗體的設(shè)計(jì)和制備 分析鼠抗⑶20抗體2B8的重鏈可變區(qū)的序列(詳見實(shí)施例1)，根據(jù)其重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對(duì)人抗體基因序列庫(NCBI Ig BLAST)進(jìn)行比較，找出與鼠抗 2B8重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體(比成熟抗體免疫源性更低)可變區(qū)相對(duì)應(yīng)序列。然后經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子(主要為 DRB1*0101，DRB1*1501，DRB1*0301，DRB1*0401，DRB1*0404，DRB1*0405，DRB1*0701， DRB1*0802, DRB1*0901, DRB1*1101, DRB1*1302, DRB3*0101, DRB4*0101, DRB5*0101, DQB1*0301，及DQB1*0302，因?yàn)檫@些分子代表全世界絕大多數(shù)的II型HLA分子)結(jié)合的親和性，選出親和性最低的框架序列，從而最終確立重鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的人源化序列分別為 FRl :Seq ID. No. 3，F(xiàn)R2 :Seq ID. No. 5/Seq ID. No. 6，F(xiàn)R3 :Seq ID. No. 8，和 kq ID. No. 9，F(xiàn)R4 =Seq ID. No. 14。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子模型分析鼠2B8抗 CD20抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持CDR構(gòu)型所需保留的鼠2B8抗體對(duì)應(yīng)框架氨基酸殘基(線性序列鄰近CDR抗原結(jié)合位點(diǎn)或據(jù)CDR 6埃以內(nèi)的氨基酸殘基)。設(shè)計(jì)出不同組合的人源化重鏈可變區(qū)的序列SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16。
同樣，分析鼠抗CD20抗體2B8的輕鏈可變區(qū)的序列(詳見實(shí)施例2)，根據(jù)其輕鏈可變區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對(duì)人抗體基因序列庫(NCBI Ig BLAST)進(jìn)行比較，找出與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)序列。然后經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子結(jié)合的親和性，選出親和性最低的框架序列，從而最終確立輕鏈可變區(qū)的FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4的人源化序列分別為Seq ID. No. 18, Seq ID. No. 21, Seq ID. No. 22, Seq ID. No. 23 和 kq ID. No. 32。在此框架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子模型分析鼠2B8抗CD20抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出支持 CDR構(gòu)型所需保留的鼠2B8抗體對(duì)應(yīng)框架氨基酸殘基(線性序列鄰近CDR抗原結(jié)合位點(diǎn)或據(jù)CDR6埃以內(nèi)的氨基酸殘基)。設(shè)計(jì)出不同組合的人源化輕鏈可變區(qū)的序列SEQ ID No. 34 和 SEQ IDNo. 35。
在此基礎(chǔ)上，還可以應(yīng)用分子對(duì)接分析⑶20抗原靶位(itoANPS173)及其周邊氨基酸殘基iraE，169P, 174E和mK與人源化重鏈可變區(qū)的立體空間結(jié)合方式。通過計(jì)算靜電力，溶液媒合(salvation)，范德華引力和熵值，選擇⑶R1，⑶R2和⑶R3序列中可以優(yōu)化的氨基酸，以改善抗體CDR區(qū)域與CD20抗原表位的結(jié)合，以期獲得更好活性抗體，該抗體重鏈可變區(qū)含有以下序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGAIYPGNSDTNYNQKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYG⑶WNFEVWGQGTTVTVSSGeq ID No 36),(圖 10， hVH-2)。
同理，根據(jù)空間結(jié)構(gòu)分析，人源化輕鏈的⑶Rl和⑶R2與⑶20抗原靶位沒有直接結(jié)合，只有人源化輕鏈⑶R3與重鏈的⑶R1，⑶R2和⑶R3形成與⑶20抗原靶位(iroANPSm) 的結(jié)合口袋。所以，主要優(yōu)化輕鏈的CDR3。該抗體輕鏈可變區(qū)含有以下序列 DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTINSLEAEDAATYYCQQWTSKPPTFGGGTKVEIK(Seq ID No :37)，(圖 11，hVK-2)。
本發(fā)明具體得到的人源化抗體有以下組合 表1.人源化抗⑶20抗體組合
抗體名稱VH SEQ IDVk SEQ ID1534153416341634153515351635163536373637 該人源化抗⑶20抗體具有⑶20結(jié)合活性并且有誘導(dǎo)ADCC，⑶C和⑶20陽性惡性 B細(xì)胞凋亡的活性(見實(shí)施例)。
重鏈恒定區(qū)采用人IgGl，輕鏈恒定區(qū)采用人κ，均來源于健康人B淋巴細(xì)胞。通過基因工程，重疊延伸PCR，連接可變區(qū)和恒定區(qū)，得到完整的抗體重輕鏈基因。編碼的人源抗⑶20的DNA序列可被重組構(gòu)建成用于哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)的載體。本發(fā)明的表達(dá)載體含有編碼的人源抗CD20單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的DNA序列。然而，也可有分別構(gòu)建兩種表達(dá)載體，一種是含有重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的，另一種是含有輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的，一同轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞。表達(dá)載體進(jìn)一步含有啟動(dòng)子和編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列， 以及至少一種用于篩選的抗藥基因。所用方法包括DNA合成技術(shù)和體外重組技術(shù)。適用于本發(fā)明的載體可以是病毒的或非病毒的。優(yōu)選的病毒載體包括腺病毒，腺相關(guān)病毒，單純皰疹病毒，慢性病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒載體。非病毒載體為質(zhì)粒。
二 .抗體的制備方法 重組抗體的制備方法包括(i)線性化含有編碼本發(fā)明人源抗⑶20單克隆抗體的表達(dá)載體(ii)用線性化載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，輕鏈和重鏈可用不同載體共同轉(zhuǎn)染單個(gè)細(xì)胞中或用含有重鏈和輕鏈編碼基因的單一表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(iii)選擇表達(dá)抗藥基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(iv)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離出分泌本發(fā)明人源化抗CD20單克隆抗體的細(xì)胞。具體地，編碼本發(fā)明抗體的核苷酸可直接引入到宿主細(xì)胞中，將細(xì)胞在可以充分誘導(dǎo)編碼抗體表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。任何適用于表達(dá)的細(xì)胞都可以用作宿主細(xì)胞。例如，酵母細(xì)胞， 昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞等。具體地，用通常不產(chǎn)生抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，比如中國倉鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞，NSO細(xì)胞，SP2/0細(xì)胞，Cos-7細(xì)胞和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞比如PER. C6細(xì)胞。合適的方法包括電穿孔術(shù)，lipofactemine，基因槍技術(shù)，磷酸鈣沉淀，直接的顯微注射法等等。 方法的選擇通常取決于被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的類型及發(fā)生轉(zhuǎn)化的環(huán)境。
為了重組抗體的長(zhǎng)期、高產(chǎn)率的制備，需要用穩(wěn)定的表達(dá)。在重組質(zhì)粒中的抗藥基因能篩選穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合到染色體上，并長(zhǎng)成可被克隆的細(xì)胞集落。
在細(xì)胞培養(yǎng)期，轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過一系列的生物反應(yīng)器來擴(kuò)增接種細(xì)胞，從培養(yǎng)液中生產(chǎn)并積聚出抗CD20抗體。在培養(yǎng)期，轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過本領(lǐng)域已知的方法，在含有可同化的碳源(碳水化合物比如葡萄糖或乳糖)，氮源(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)或其退化產(chǎn)物比如蛋白胨、銨鹽等)及無機(jī)鹽(硫酸鹽、磷酸鹽和/或鈉、鉀、鎂和鈣的碳酸鹽)的液體介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括常規(guī)的Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium(DMEM) (Sigma), Ham ‘ s FlO(Sigma)， Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma)或 NCTC-135。這些培養(yǎng)基中的任何一種都可以在必要時(shí)加入氨基酸(如谷氨酰胺)，激素或其他生長(zhǎng)因子(胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)，緩沖液，核苷酸，離子表面活性劑和葡萄糖或相等能量源來進(jìn)行補(bǔ)充。培養(yǎng)基可進(jìn)一步含有促進(jìn)生長(zhǎng)的微量元素比如螯合鐵(比如chelate B, Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)和鎂。在培養(yǎng)期，要監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件比如溫度，pH等等以確?？焖俚募?xì)胞生長(zhǎng)。
制備出的本發(fā)明抗體分子，可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行純化。例如，蛋白A親和色譜法以及離子交換色譜法等蛋白純化標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行本發(fā)明抗體分子的純化。
三.制劑 本發(fā)明抗體可通過常規(guī)方法用一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料制成制劑。術(shù)語 “藥學(xué)上可接受的輔料”是指一種或多種有機(jī)或無機(jī)組分，天然或合成的，與抗體聯(lián)合可促進(jìn)其穩(wěn)定和臨床應(yīng)用的載體。合適的載體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥學(xué)上可接受的無菌鹽水及含水和無水等滲無菌液和無菌混懸液。本發(fā)明抗體尤其在150mM氯化鈉，pH6. 5的 25mM檸檬酸鹽，脫水草酸三鈉，0. 05%山梨醇酯80組成的制劑中，有很好的穩(wěn)定性。
四.給藥劑量和方式 有效劑量可以根據(jù)個(gè)體的情況來確定，并且在某種程度上要考慮到治療的癥狀及效果。有效劑量可以根據(jù)體外細(xì)胞培養(yǎng)或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)規(guī)程來確定，例如確定 LD5tl (半數(shù)致死量)和ED5tl (半數(shù)有效治療劑量)。毒性與療效的劑量比為治療指數(shù)，可以表述為L(zhǎng)D5tZED5tl。選取具有較大治療指數(shù)值的治療方法。從體外細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于制定人類使用的相關(guān)劑量。典型的劑量包括但不限于0. 5mg/kg至100mg/kg 的范圍。該治療的劑量是在一個(gè)低毒或無毒ED5tl的血漿濃度范圍內(nèi)。這個(gè)范圍內(nèi)的劑量可能隨著使用劑型與給藥途徑的不同而有所變化。在一種治療方案中，治療的有效劑量可以通過動(dòng)物模型，估計(jì)外周循環(huán)血漿濃度范圍，來更精確地確定人類的有效劑量。
本發(fā)明中的抗體可以通過任何藥學(xué)上可以接受的方式來給藥。這包括注射方式，通過諸如靜脈、動(dòng)脈、皮下的、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔或插入供應(yīng)局部腫瘤的血管的導(dǎo)管方式等非腸胃途徑給藥注射方式；或者其他通過體表方式緩釋給藥。
五、臨床治療應(yīng)用 使用本發(fā)明人源化抗CD20抗體作為治療B細(xì)胞異常所致疾病的主要組分。尤其是，特別應(yīng)用于非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、 急性淋巴細(xì)胞性白血病以及瓦氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom' s macroglobulinemia)，也包括各種自身免疫性疾病，如免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、干燥綜合癥(Sjogren' s syndrome)、多發(fā)性硬化癥、希德罕氏舞蹈癥(Sydenham' s chorea)、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、 風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多腺性綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病、過敏性紫癜、鏈球菌感染后腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、高安氏動(dòng)脈炎(Takayasu' s arteritis)、愛迪生氏病(Addison' s disease)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肉樣瘤病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、強(qiáng)直性脊柱炎、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture' s syndrome)、阻塞性動(dòng)脈炎 (thromboangitis ubiterans)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)、甲狀腺功能亢進(jìn)、硬皮病、慢性活動(dòng)性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常型天皰瘡、韋格內(nèi)肉芽腫(Wegener' s granulomatosis)、膜性腎病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、脊髓癆、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎與纖維性肺泡炎。
該治療組分至少包括抗CD20抗體，或者聯(lián)合化療制劑或免疫調(diào)節(jié)劑的其他治療藥物。
本發(fā)明的抗體也可以是衍生抗體，包括單價(jià)的，多價(jià)的或單鏈的抗體。
本發(fā)明的抗體也可以是修飾抗體，包括Fc片段的改善，增強(qiáng)效應(yīng)子功能，比如在 Fc區(qū)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換或糖基化修飾可能會(huì)增強(qiáng)效應(yīng)子的功能，以致增強(qiáng)抗體依賴細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性的活性。也可通過與本發(fā)明抗體偶聯(lián)放射性同位素，化療藥物或毒素，以致增強(qiáng)抗體細(xì)胞毒活性。
本發(fā)明提供的人源化抗CD20單克隆抗體，進(jìn)一步降低了人免疫原性，保留并提高了治療效果，為治療B淋巴細(xì)胞瘤和B細(xì)胞有關(guān)的多種自身免疫病提供了一種安全有效的藥物。
說明書附圖 圖1.與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FRl序列相似的人胚系對(duì)應(yīng)FRl序列。
圖2.與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FR2序列相似的人胚系對(duì)應(yīng)FR2序列。
圖3.與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FR3序列相似的人胚系對(duì)應(yīng)FR3序列。
圖4.與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FR4序列相似的人胚系對(duì)應(yīng)FR4序列。
圖5.與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FRl序列相似的人胚系對(duì)應(yīng)FRl序列。
圖6.與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FR2序列相似的人胚系
(germline)抗體可變區(qū)相 (germline)抗體可變區(qū)相 (germline)抗體可變區(qū)相 (germline)抗體可變區(qū)相 (germline)抗體可變區(qū)相 (germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR2序列。
圖7.與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FR3序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR3序列。
圖8.與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FR4序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR4序列。
圖9.人源化抗⑶20抗體重鏈可變區(qū)序列9A，9B ；人源化抗⑶20抗體輕鏈可變區(qū)序歹Ij 9C，9D ；9A、9B、9C 禾口 9D 分別對(duì)應(yīng)序列表中的 SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 34,SEQID NO :35。
圖10.人源化抗⑶20抗體重鏈可變區(qū)優(yōu)化⑶R序列，SEQ ID NO 16和36。
圖11.人源化抗⑶20抗體輕鏈可變區(qū)優(yōu)化CDR序列，SEQ ID NO 35和37。
圖12.為抗⑶20人源化單克隆抗體對(duì)⑶20+ Ramos淋巴瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，對(duì) ⑶2(Γ T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞無結(jié)合。圖A =Ramos淋巴瘤細(xì)胞；圖B Jurkat白血病細(xì)胞。
圖13.樹突狀細(xì)胞(DC) -T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)測(cè)定人源化抗CD20抗體體外免疫原性(η =20)。
圖14.為抗⑶20人源化單克隆抗體對(duì)⑶20+ Ramos淋巴瘤細(xì)胞的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(⑶C)結(jié)果。
圖15.為抗⑶20人源化單克隆抗體對(duì)⑶20+ Ramos淋巴瘤細(xì)胞的抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC)結(jié)果。
圖16.為抗⑶20人源化單克隆抗體對(duì)⑶20+ Ramos淋巴瘤細(xì)胞的體內(nèi)藥效結(jié)果。
具體實(shí)施例方式1.抗⑶20鼠抗2B8人源化抗體重鏈可變區(qū)框架序列的設(shè)計(jì) 以下為鼠抗CD20抗體2B8的重鏈可變區(qū)的序列，下劃線部分為鼠抗框架序列 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEfflGAIYPGNGDTSYNQKFKGKAT LTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYG⑶WYFNVWGAGTTVTVSA 根據(jù)以鼠抗⑶20抗體2B8的重鏈可變區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對(duì)人抗體基因序列庫(NCBI Ig BLAST)進(jìn)行比較，找出與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體(比成熟抗體免疫源性更低)可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3 和FR4序列· 圖1為與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FRl (Seq ID No 1, 即 QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFT)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FRl 序列，找出的10個(gè)有相似的FRl序列的人胚系(germline)抗體含有2個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 2 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT Seq ID. No 3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，主要的HLA-DR分子為 HLA-DRB1-0101，HLA-DR Bl-0301，HLA-DR B1-0401, HLA-DR Bl-0701，HLA-DR B1-1101， HLA-DR Bl-1301，HLA-DR B1-1501，原始鼠源 FRl (Seq ID NO 1)序列含有三個(gè)潛在的 HLA-DR結(jié)合位點(diǎn)，人源序列kq ID No 2含有兩個(gè)潛在的HLA-DR結(jié)合位點(diǎn)，而人源序列kq ID No :3只有一個(gè)較低的HLA-DR潛在結(jié)合位點(diǎn)。因此選出親和性較低的kq IDNo :3為人源化的重鏈可變區(qū)FRl的框架序列。
同樣，圖2為與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FR2 (Seq ID No :4，即WVKQTPGRGLEWIG)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR2序列，找出的10個(gè)有相似的FR2序列的人胚系(germline)抗體含有2個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 5 WVRQPPGKGLEffIG Seq ID No 6 WVRQAPGKGLEffVG 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，Seq ID NO 5和Seq ID NO :6親和性均低于鼠源FR2序列，選出親和性較低的kq ID No :5或kq ID No :6為人源化的重鏈可變區(qū)FR2的框架序列。
同樣，圖3為與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FR3 (Seq ID No :7，即KATLTADKSSSTAYMQL SSLTSEDSAVYYCAR)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR3序列，找出的10 個(gè)有相似的FR3序列的人胚系(germline)抗體含有2個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 8 RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR Seq ID No 9 RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，Seq ID NO 8和Seq ID NO 9親和性均低于鼠源FR3序列，均可用于作為人源化的重鏈可變區(qū)FR3的框架序列。
同樣，圖4為與鼠抗2B8重鏈可變區(qū)的FR4 (Seq ID No 10，即WGAGTTVTVSA)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR4序列，找出的6個(gè)有相似的FR4序列的人胚系(germline)抗體含有3個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No: 11 WGQGTLVTVSS Seq ID No: 12 WGRGTLVTVSS Seqe ID No 13 WGQGTMVTVSS Seq ID No: 14 WGQGTTVTVSS 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，選出親和性較低的Seq ID No 14為人源化的重鏈可變區(qū)FR4的框架序列。
所以根據(jù)框架序列優(yōu)化，設(shè)計(jì)出兩種人源化抗體重鏈可變區(qū)序列(圖9A，9B) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQPPGKGLEfflGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYG⑶WYFNVWGQGTTVTVSS(Sea ID No :15 ；參照 kq ID No 9) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEfflGAIYPGNGDTSYNQKFKGRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYG⑶WYFNVWGQGTTVTVSS(Sea ID 吣16，參照^^ ID No 8) 2.抗CD20鼠抗2B8人源化抗體輕鏈可變區(qū)框架序列的設(shè)計(jì) 以下為鼠抗CD20抗體2B8的輕鏈可變區(qū)的序列，下線部分為鼠抗框架序列 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHffFQQKPGSSPKPfflYATSNLASGVPVRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQffTSNPPTFGGGTKLEIK 根據(jù)以鼠抗CD20抗體2B8的輕鏈可變區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列對(duì)人抗體基因序列庫(NCBI Ig BLAST)進(jìn)行比較，找出與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4序列. 圖5為與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FRl (Seq ID No :17， 即 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FRl序列，找出的10個(gè)有相似的FRl序列的人胚系(germline)抗體含有2個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 18 DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITC Seq ID No: 19: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，主要的HLA-DR分子為 HLA-DR B1-0101，HLA-DR Bl-0301，HLA-DR B1-0401, HLA-DR Bl-0701, HLA-DRBl-1101, HLA-DR Bl-1301，HLA-DR B1-1501，原始鼠源序列 FRl (Seq ID No :17)含有四個(gè)潛在的 HLA-DR結(jié)合位點(diǎn)，人源序列kq ID No :18)和人源序kq ID No :19)在潛在的HLA-DR結(jié)合位點(diǎn)親和性明顯減低。因此選出親和性較低的kq ID No :18為人源化的輕鏈可變區(qū)FRl 的框架序列。
同樣，圖 6.為與鼠抗 2B8 輕鏈可變區(qū)的 FR2(Seq ID No :20，即 WFQQKPGSSPKPWIY) 序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR2序列，找出的7個(gè)有相似的FR2序列的人胚系(germline)抗體含有4個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 21 WFQQKPGKAPKSLIY Seq ID No 38 WYQQHPGTVPKPMIY Seq ID No 39 WFQQKPGQAPRALIY Seq ID No 40 WFQQKPGQAPRTLIY 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，Seq ID NO 21和Seq ID NO 38親和性均低于鼠源FR2序列，選出親和性較低的kq ID No :21為人源化的輕鏈可變區(qū)FR2的框架序列。
同樣，圖7為與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FR3 (Seq ID No :22，即GVPVRFSGSGSGTSYS LTISRVEAEDAATYYC)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR3序列，找出的7 個(gè)有相似的FR3序列的人胚系(germline)抗體含有5個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 23 GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC Seq ID No 24 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYC Seq ID No 25 GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC Seq ID No 26 GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLQSEDFAVYYC Seq ID No 27 GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，選出親和性較低的Seq ID. No. 23為人源化的輕鏈可變區(qū)FR3的框架序列。
同樣，圖8為與鼠抗2B8輕鏈可變區(qū)的FR4 (Seq ID No :28，即WGAGTTVTVSA)序列相似的人胚系(germline)抗體可變區(qū)相對(duì)應(yīng)FR4序列，找出的5個(gè)有相似的FR4序列的人胚系(germline)抗體含有5個(gè)不同序列，分別為 Seq ID No 29 FGQGTKVEIK Seq ID No 30 FGQGTKLEIK Seq ID No 31 FGPGTKVDIK Seq ID No 32 FGGGTKVEIK Seq ID No 33 FGQGTRLEIK 再經(jīng)過in silicon分析所述序列與HLA-DR分子的親和性，選出親和性較低的Seq ID No 32為人源化的輕鏈可變區(qū)FR4的框架序列。
所以根據(jù)框架序列優(yōu)化，設(shè)計(jì)出人源化抗體輕鏈可變區(qū)序列(圖9C) DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHffFQQKPGKAPKSLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTlNSLEAEDAATYYCQQffTSNPPTFGGGTKYEIK(Seq ID No :34) 在此基礎(chǔ)上，用計(jì)算機(jī)分子摸型(Swiss-PdbViewer)分析鼠2B8抗CD20抗體的可變區(qū)立體空間結(jié)構(gòu)，分析出44位氨基酸殘基P支持CDR構(gòu)型，保留氨基酸殘基P會(huì)更有利于CDR的結(jié)構(gòu)(圖9D)。
DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTlNSLEAEDAATYYCQQffTSNPPTFGGGTKYEIK(Seq ID No :35)。
在此基礎(chǔ)上，還可以應(yīng)用分子對(duì)接分析⑶20抗原靶位(miANPSm)及其周邊氨基酸殘基16 ，169P, 174E和mK與人源化重鏈可變區(qū)的立體空間結(jié)合方式。通過計(jì)算靜電力，溶液媒合(salvation)，范德華引力和熵值，選擇⑶R1，⑶R2和⑶R3序列中可以優(yōu)化的氨基酸，以改善抗體CDR區(qū)域與CD20抗原表位的結(jié)合，以期獲得更好活性抗體，該抗體重鏈可變區(qū)含有以下序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGAIYPGNSDTNYNQKFKGRV TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYG⑶WNFEVWGQGTTVTVSSGeq ID No 36),(圖 10， hVH-2)。
同理，根據(jù)空間結(jié)構(gòu)分析，人源化輕鏈的⑶Rl和⑶R2與⑶20抗原靶位沒有直接結(jié)合，只有人源化輕鏈⑶R3與重鏈的⑶R1，⑶R2和⑶R3形成與⑶20抗原靶位(iroANPSm) 的結(jié)合口袋。所以，只需優(yōu)化輕鏈的CDR3。該抗體輕鏈可變區(qū)含有以下序列 DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVSYIHWFQQKPGKAPKPLIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTINSLEAEDAATYYCQQWTSKPPTFGGGTKVEIK(Seq ID No :37)，(圖 11，hVK-2)。
本發(fā)明具體得到的人源化抗體有以下組合 表1.人源化抗⑶20抗體組合
權(quán)利要求
1.一種與HLA-DR分子親合力降低的人源化CD20抗體重鏈可變區(qū)序列，它是kq ID NO 15及其衍生序列，SEQ ID NO 16及其衍生序列，SEQ ID NO 36及其衍生序列。
2.—種與HLA-DR分子親合力降低的人源化⑶20抗體輕鏈可變區(qū)序列，它是SEQ ID NO 34及其衍生序列，SEQ ID NO 35及其衍生序列，SEQ ID NO 37及其衍生序列。
3.一種人源化抗CD20抗體，它含有上述權(quán)利要求1所述任一序列與權(quán)利要求2所述任一序列的兩兩組合而成的序列，它含有下述序列之一DSEQ ID NO: 15及其衍生序列和SEQ ID NO :；34及其衍生序列組合的序列；2)SEQ ID NO: 16及其衍生序列和SEQ ID NO :34及其衍生序列組合的序列；3)SEQ ID NO: 15及其衍生序列和SEQ ID NO :35及其衍生序列組合的序列；4)SEQ ID NO 16及其衍生序列和SEQ ID NO 35及其衍生序列組合的序列；5)SEQ ID NO :36及其衍生序列和SEQ ID NO :37及其衍生序列組合的序列。
4.如權(quán)利要求3任一所述抗體，它還含有人IgGl重鏈恒定區(qū)和人κ輕鏈恒定區(qū)。
5.一種含有權(quán)利要求1-2任一所述可變區(qū)序列的抗體。
6.權(quán)利要求3-5的任一所述抗體，它是抗體1534、1634、1535、1635、3637。
7.一種DNA分子，它編碼上述權(quán)利要求1-2任一所述可變區(qū)或編碼上述權(quán)利要求3-6 任一所述抗體。
8.一種用于哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表達(dá)載體，是病毒的或非病毒的，它含有權(quán)利要求 3-6所述抗體的DNA分子。
9.一種宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求8所述載體。
10.一種組合物，它含有權(quán)利要求3-6任一所述抗體以及藥學(xué)上可接受的輔料制成的制劑，用于對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤，白血病和與B細(xì)胞有關(guān)的多種自身免疫病的臨床治療。
11.一種制品，包含一種容器以及容器中的組合物，所述組合物為權(quán)利要求10所述的組合物。
12.權(quán)利要求3-6任一所述的人源化⑶20結(jié)合抗體，在制備治療⑶20陽性B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞白血病、自身免疫病例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、重癥肌無力、狼瘡性腎炎、紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型人源化抗CD20單克隆抗體的設(shè)計(jì)及制備方法，相關(guān)基因，蛋白質(zhì)序列以及該抗體應(yīng)用。與鼠抗及人鼠嵌合抗體相比，該人源化抗CD20抗體既保留或提高了可變區(qū)的高親和性，又減低了嵌合抗體的免疫原性，從而達(dá)到減少藥物副作用，改善臨床治療效果。本發(fā)明所述抗體在動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤，白血病和與B細(xì)胞有關(guān)的自身免疫病有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P19/04GK102190728SQ20101015030
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者劉劼, 張永克 申請(qǐng)人:永卓博濟(jì)(上海)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司