專利名稱：小檗堿及其衍生物在制備吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制劑中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及小檗堿及其衍生物在制藥中的新用途，具體涉及小檗 堿及其衍生物在制備吲哚胺2，3-雙加氧酶(ID0)抑制劑中的用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了吲哚胺2，3-雙加氧酶(Indoleamine 2，3-dioxygenase，ID0)是 一種細(xì)胞內(nèi)含有亞鐵血紅素的酶，是肝臟以外唯一可催化色氨酸代謝使其沿犬尿氨酸途徑 分解生成包括喹啉酸在內(nèi)的一系列代謝產(chǎn)物的限速酶[1]。ID0與很多生理病理過(guò)程有關(guān)。有關(guān)對(duì)懷孕小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)母胎界面的合胞 體滋養(yǎng)層細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞可以合成ID0，并且ID0表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化與胚胎形成一致，如 果特異性阻斷ID0的作用，則可導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)，表明ID0可以使胎兒免于母體的排斥，維持 母胎界面免疫偏離的形成[2]。該研究結(jié)果說(shuō)明ID0與機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫耐受有關(guān)，是一 種免疫調(diào)節(jié)酶。ID0與腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)其監(jiān)視和殺傷的免疫逃逸現(xiàn)象有關(guān)。 Uyttenhove等發(fā)現(xiàn)多種人實(shí)體腫瘤細(xì)胞(宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑素瘤和胰腺癌等)高表 達(dá)的ID0使局部T細(xì)胞增殖受抑，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[3]。ID0參與調(diào) 節(jié)T細(xì)胞的反應(yīng)。T細(xì)胞對(duì)色氨酸耗竭特別敏感，當(dāng)色氨酸濃度較低時(shí)，T細(xì)胞增殖就會(huì)靜 止在G1期，ID0通過(guò)降解色氨酸，可切斷T細(xì)胞的活化?；谶@種機(jī)制，ID0保護(hù)胎兒免受 母體排斥，也介導(dǎo)了腫瘤免疫逃逸。研究顯示，色氨酸代謝的犬尿氨酸途徑異常，通常伴隨著ID0活性的提高和喹啉 酸水平的上調(diào)，與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和神經(jīng)退行性紊亂密切相關(guān)[4]。直接和間接地證據(jù)都表明 ID0和犬尿氨酸途徑在阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5_6]。阿爾茨海默病患者 血液中的色氨酸濃度與其認(rèn)知缺陷的程度成負(fù)相關(guān)[7]，血清中犬尿氨酸濃度高于正常人， 而且升高的程度與認(rèn)知缺陷的水平密切相關(guān)[8_9]。阿爾茨海默病患者大腦中ID0含量比正 常人豐富ID0和喹啉酸在阿爾茨海默病患者海馬體皮質(zhì)層的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞及神 經(jīng)元細(xì)胞中均有表達(dá)，在老年斑周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞中含量最高[1°]. 0淀粉樣多 肽A3 (1-42)能夠激活原代培養(yǎng)的人小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)ID0的表達(dá)[11_12]。干擾素Y可誘導(dǎo)ID0的表達(dá)，在高水平干擾素、刺激的持續(xù)活化期間，ID0降低 了游離血清色氨酸的利用度。因而，也降低了 5-羥色胺的產(chǎn)生。與諸如喹啉酸的具有神經(jīng) 活性的犬尿氨酸代謝物的蓄積相結(jié)合的這些變化有助于神經(jīng)病學(xué)、精神病學(xué)病癥的發(fā)生， 而且是多種心境障礙的因素，也是具有ID0活化和色氨酸降解特征的一些慢性病相關(guān)癥狀 的因素，所述慢性病例如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、多種類型抑郁癥、阿爾茨海默病和癌癥。[13]ID0活性還涉及與年齡相關(guān)的核性白內(nèi)障的發(fā)生。ID0是晶狀體中紫外線濾器生 物合成中的第一個(gè)酶，并且是限速酶。來(lái)自色氨酸降解的紫外線濾器化合物(犬尿氨酸和 3_羥基犬尿氨酸葡萄苷)修飾存在于人晶狀體中的蛋白質(zhì)。這些紫外線濾器化合物的量隨年齡而增加并且已經(jīng)報(bào)道了這些紫外線濾器化合物會(huì)導(dǎo)致稱為與年齡相關(guān)的核性白內(nèi)障 的晶狀體逐漸渾濁[14]。ID0抑制劑可以治療腫瘤。已有研究表明目前公認(rèn)的ID0抑制劑1-甲基色氨酸 (1-MT)在體外能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的免疫刺激的敏感性，在體內(nèi)的動(dòng)物模型中能延緩 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤效果，而且對(duì)幾乎所有的自發(fā)性腫瘤起作用[15]。 ID0抑制劑可以治療心境障礙以及其他具有ID0介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的病理學(xué)特征的疾 病，包括:AIDS、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病)、抑郁癥、白內(nèi)障、 與年齡相關(guān)的黃化以及自身免疫性疾病。目前世界上尚無(wú)可以作為藥物使用的ID0抑制劑，ID0抑制劑的研發(fā)多以有機(jī)合 成為主，天然提取的工作尚少見(jiàn)。從中草藥中分離得到的許多活性天然產(chǎn)物往往有比較豐 富的生理功能，其中的若干活性天然產(chǎn)物已經(jīng)廣泛使用，小檗堿是其中使用最多的天然產(chǎn) 物之一。小檗堿(berberine)又名黃連素，是中藥黃連中的主要生物堿。近十年來(lái)，已經(jīng)有 若干文獻(xiàn)報(bào)道了小檗堿及其衍生物臨床用于治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、炎癥、 細(xì)菌和病毒感染等疾病，但，迄今未見(jiàn)有小檗堿及其衍生物在制備ID0抑制劑中的用途。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有[l]MacKenzie, C. R. Et. al. Current Drug Metabolism, 2007,8 :237-244.[2]David, H. M. ；et al.，Science，1998，281 :5380.[3]Uyttenhov, C, et al. Nat Med,2003，9 :1269—1274.[4]Heyes, M. P.，et al.，Brain, 1992，115 :1249_1273.[5]Guillemin，G. J. et al. . Redox Rep 2002，7，199-20.[6] Stone, T. ff. , et al. , J. Alzheimers Dis. 2001，3 :355_66.[7]ffidner B, et al. , Adv Exp Med Biol 1999,467 133-8.[8]Baran H, et al.，J. Neural Transm 1999，106 :165—81.[9]ffidner B, et al.，J Neural Transm 2000，107 :343-53.[10]Guillemin,G. J. Et al. ,Neuropathology and Applied Neurobiology 2005, 31 :395-404.[ll]Guillemin G. J.，et al.，Neuro Report 2003，14 :2311_2315.[12]ffalker D. G.，et al.，J. Leukoc. Biol. 2006，79 :596_610.[13]Schroecksnadel K.，et al.， Clin Exp Immunol. 2005,140(1) :41_45.[14]Takikawa 0，et al.，Exp Eye Res. 2001，72 (3) :271_7.[15]Friberg M,et al. Int J Cancer,2002,101 :151_155.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供小檗堿及其衍生物在制藥中的新用途，具體涉及小檗堿及其 衍生物在制備吲哚胺2，3-雙加氧酶(ID0)抑制劑中的用途。本發(fā)明所述的小檗堿及其衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式 其中，R1,R2, R3, R4 為-OCH3, -OH,或 _0CH20。本發(fā)明中所述小檗堿及其衍生物分別為下述結(jié)構(gòu)的小檗堿，藥根堿和巴馬汀 本發(fā)明中，優(yōu)選的小檗堿及其衍生物為小檗堿及其衍生物的鹽酸鹽或其他鹽，其 中的小檗堿及其衍生物的鹽酸鹽為如下結(jié)構(gòu)的鹽酸小檗堿，鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀 本發(fā)明經(jīng)IDO抑制活性檢測(cè)，以及可逆抑制的判定、抑制劑類型判斷及Ki值測(cè) 定及半數(shù)有效抑制濃度IC50測(cè)定，結(jié)果顯示，所述的小檗堿為可逆抑制劑，抑制常數(shù)Ki 為8 μ M ；所述的鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀為不可逆抑制劑，半數(shù)有效抑制濃度IC5tl分別為 123 μ M 禾P 126 μ M0本發(fā)明所述的小檗堿及其衍生物，及其鹽酸鹽均為市購(gòu)產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明公開(kāi)的小檗堿及其衍生物鹽酸藥根堿及鹽酸巴馬汀具有吲 哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)抑制活性，可作為吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)抑制劑，用于治療 或預(yù)防具有IDO介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的病理學(xué)特征的疾病，包括癌癥、艾滋病、阿爾茨海 默病、抑郁癥、白內(nèi)障等重大疾病的治療。本發(fā)明的小檗堿及其衍生物在抑制IDO介導(dǎo)的色 氨酸代謝途徑的疾病領(lǐng)域有者廣闊的應(yīng)用前景為了便于理解，以下結(jié)合具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特 別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō) 明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā) 明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的 全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。


圖1為小檗堿，鹽酸藥根堿，鹽酸巴馬汀，I-MT在100 μ M濃度下的IDO抑制活性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1) IDO抑制活性檢測(cè)反應(yīng)條件將50mM磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5)，40mM維生素C，400ug/ml過(guò)氧化氫酶， 20uM亞甲基藍(lán)，底物L(fēng)-色氨酸和待測(cè)樣品混合，混合液37°C保溫5分鐘，再向上述混合液 內(nèi)加入IDO酶，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行30分鐘，加入30% (w/v)三氯乙酸200ul使反應(yīng)終止， 反應(yīng)體系在65 °C加熱15分鐘，使之完成從甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化，然后12000rpm 旋轉(zhuǎn)10分鐘，取上清與等體積2% (w/v)對(duì)-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸與 之反應(yīng)產(chǎn)生的黃顏色可使用酶標(biāo)儀在490nm觀測(cè)。測(cè)試結(jié)果表明小檗堿，鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀對(duì)IDO的抑制效力優(yōu)于目前體 內(nèi)外實(shí)驗(yàn)通用的IDO抑制劑I-MT (1-甲基色氨酸，市售)。2)是否為可逆抑制的判定在固定抑制劑濃度的情況下，用一系列不同濃度的酶與抑制劑反應(yīng)并測(cè)定反應(yīng)速 度。以反應(yīng)速度對(duì)酶濃度(ν [E])作圖，根據(jù)曲線的特征可以判定是否是可逆抑制劑。反應(yīng)條件在500ul的反應(yīng)體系中，先加入50mM磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5)，40mM維 生素C，400ug/ml過(guò)氧化氫酶，20uM亞甲基藍(lán)，300mM底物L(fēng)-色氨酸或同時(shí)加入IOOmM抑制 劑(鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、小檗堿)，混合液37°C保溫5分鐘，再向上述混合液內(nèi)分別 加入不同體積的IDO酶(對(duì)于鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀，加入酶的體積分別為0. 5、1、1. 5、 2,2. 5ul ；對(duì)于小檗堿，加入的酶的體積分別為5、8、10、15、20ul)，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行30分 鐘，加入30% (w/v)三氯乙酸200ul使反應(yīng)終止，反應(yīng)體系在65°C加熱15分鐘，使之完成 從甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化，然后12000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘，取上清與等體積2% (w/ ν)對(duì)-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)讀數(shù)。測(cè)試結(jié)果表明小檗堿是IDO的可逆抑制劑，鹽酸藥根堿與鹽酸巴馬汀是IDO的不 可逆抑制劑。3)小檗堿抑制劑類型判斷及Ki值測(cè)定反應(yīng)條件在500ul的反應(yīng)體系中，先加入50mM磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5)，40mM維 生素C，400ug/ml過(guò)氧化氫酶，20uM亞甲基藍(lán)，分別加入80、150、300mM底物L(fēng)-色氨酸，在一 個(gè)底物濃度下，加入不同濃度的小檗堿(0. 5 μ M，2 μ M，4 μ M，6 μ M，8 μ M)混合液37°C保溫5 分鐘，再向上述混合液內(nèi)加入IOul IDO(約20nM)，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行30分鐘，加入30% (w/v)三氯乙酸200ul使反應(yīng)終止，反應(yīng)體系在65°C加熱15分鐘，使之完成從甲酰犬尿氨 酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化，然后12000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘，取上清與等體積2% (w/v)對(duì)-二甲氨 基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)讀數(shù)。以Dixon作圖法(l/ν [I]) 判定小檗堿的抑制劑類型，以S/v [I]作圖，可以得到抑制劑的Ki值。測(cè)試結(jié)果表明小檗堿為IDO的反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，Ki值為8 μ Μ。4)半數(shù)有效抑制濃度IC50測(cè)定
反應(yīng)條件將50mM磷酸鉀緩沖液(pH 6. 5)，40mM維生素C，400ug/ml過(guò)氧化氫酶， 20uM亞甲基藍(lán)，底物L(fēng)-色氨酸150mM和抑制劑混合。抑制劑濃度選用100，200，400，600， 800，1000,1200uM混合液37°C保溫5分鐘，再向上述混合液內(nèi)加入IDO酶。反應(yīng)在37°C下 進(jìn)行30分鐘，加入30% (w/v)三氯乙酸200ul使反應(yīng)終止，反應(yīng)體系在65°C加熱15分鐘， 使之完成從甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化，然后12000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘，取200ul上清與 等體積2% (w/v)對(duì)-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸與之反應(yīng)產(chǎn)生的黃顏色可 使用酶標(biāo)儀在490nm觀測(cè)，所得結(jié)果利用IC50計(jì)算器計(jì)算。表1.為小檗堿及其衍生物對(duì)IDO的IC5tl(PM)結(jié)果。表 1.
權(quán)利要求
小檗堿及其衍生物在制備吲哚胺2，3-雙加氧酶抑制劑中的用途；所述的小檗堿及其衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式其中，R1，R2，R3，R4為-OCH3，-OH，或-OCH2O。FSA00000080134400011.tif
2.按權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的小檗堿及其衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式
3.按權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述的小檗堿及其衍生物為具有如下結(jié)構(gòu)式的 小檗堿及其衍生物的鹽酸鹽
4.權(quán)利要求3所述的小檗堿及其衍生物的鹽酸鹽在制備治療或預(yù)防具有吲哚胺2， 3-雙加氧酶介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的病理學(xué)特征的疾病藥物中的用途。
5.按權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的具有吲哚胺2，3-雙加氧酶介導(dǎo)的色氨酸代 謝途徑的病理學(xué)特征的疾病包括但不限于腫瘤性疾病、癌癥、阿爾茨海默病、自身免疫性疾 病、白內(nèi)障、心境障礙、抑郁癥或焦慮癥。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及小檗堿及其衍生物在制藥中的新用途，具體涉及小檗堿及其衍生物在制備吲哚胺2，3-雙加氧酶IDO抑制劑中的用途。本發(fā)明經(jīng)IDO抑制活性檢測(cè)，以及可逆抑制的判定、抑制劑類型判斷及Ki值測(cè)定及半數(shù)有效抑制濃度IC50測(cè)定，結(jié)果顯示，所述的小檗堿為可逆抑制劑，抑制常數(shù)Ki為8μM；所述的鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀為不可逆抑制劑，半數(shù)有效抑制濃度IC50分別為123μM和126μM。本發(fā)明公開(kāi)的小檗堿及其衍生物作為IDO抑制劑，有廣闊的應(yīng)用前景，可以用于具有IDO介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑的病理學(xué)特征的疾病，包括癌癥、艾滋病、阿爾茨海默病、抑郁癥、白內(nèi)障等重大疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P37/00GK101843618SQ20101015642
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者于存靜, 匡春香, 楊青, 鄭茂發(fā) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)