專(zhuān)利名稱(chēng)：：苦柯胺a和苦柯胺b的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及苦柯胺A和苦柯胺B在制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途
背景技術(shù)：
：膿毒癥和自身免疫性疾病是由于機(jī)體自身過(guò)度免疫反應(yīng)而引發(fā)的兩類(lèi)疾病。目前尚無(wú)可靠、有效的藥物治療策略。膿毒癥是一種急性炎癥綜合征，其死亡率可高達(dá)30-70%。嚴(yán)重威脅臨床危重癥患者的生命。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年有超過(guò)300萬(wàn)膿毒癥患者，因此造成的死亡人數(shù)至少在50萬(wàn)人以上。自身免疫性疾病是一類(lèi)慢性炎癥性疾病，流行病學(xué)資料顯示，該病在我國(guó)的發(fā)病率大約為3.2%-5.3%，是導(dǎo)致65歲以下女性死亡的主要原因之一。因此膿毒癥和自身免疫性疾病的針對(duì)性防治是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題。目前膿毒癥和自身免疫性疾病的治療仍然十分棘手，臨床方面的主要措施還是經(jīng)驗(yàn)性地使用糖皮質(zhì)激素等非特異性抗炎藥物。然而這些藥物非但并不能確切提高患者的生存率或改善生存質(zhì)量，反而會(huì)造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)。既往數(shù)十年針對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的藥物防治性研究主要以抑制免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵分子和糾正凝血、補(bǔ)體等(造成機(jī)體臟器傷的直接因素)的紊亂為主要導(dǎo)向。相關(guān)研究結(jié)果顯示，這些措施非但療效難以實(shí)現(xiàn)(體內(nèi)免疫反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)路體系，難以調(diào)控)，反而有可能加重免疫系統(tǒng)的紊亂，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化。因此到目前為止，相關(guān)研究沒(méi)有取得任何突破性進(jìn)展，尚無(wú)可靠有效的新藥進(jìn)入臨床。以上事實(shí)表明需要從本質(zhì)上理解膿毒癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制與啟動(dòng)環(huán)節(jié)，并以此為突破口尋找到具有針對(duì)性治療作用的藥物。近年來(lái)，有關(guān)膿毒癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制研究取得了重要進(jìn)展，目前認(rèn)為，除了患者內(nèi)分泌、遺傳及環(huán)境因素影響外，細(xì)菌釋放出的內(nèi)毒素(LPS)和細(xì)菌非甲基化DNA(CpGDNA)是誘導(dǎo)膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的主要啟動(dòng)因素。諸多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，LPS和CpGDNA可單獨(dú)或協(xié)同誘發(fā)膿毒癥，也可直接誘發(fā)或加重類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。在急性感染中，病原體的急劇入侵可導(dǎo)致大量LPS和CpGDNA的產(chǎn)生，在短時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)TNF-α、IL-Iβ和IL-6等多種炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)和釋放，引起早期的器官功能衰竭和晚期的免疫麻痹，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥病人死亡。對(duì)自身免疫性疾病來(lái)說(shuō)，LPS和CpGDNA的持續(xù)存在可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)和慢性演變，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)、免疫球蛋白和類(lèi)風(fēng)濕因子等大量生成，形成免疫復(fù)合物，沉積在滑膜組織上，同時(shí)激活補(bǔ)體，產(chǎn)生過(guò)敏毒素，導(dǎo)致炎性病理?yè)p傷，最終造成對(duì)機(jī)體臟器的損害。由此可見(jiàn)，對(duì)LPS和CpGDNA的有效拮抗就可從根本和源頭發(fā)揮對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的預(yù)防和治療。有關(guān)藥物研究也已證實(shí)，阻斷LPS和CpGDNA對(duì)免疫細(xì)胞的刺激作用，抑制TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病具有明顯的療效。因此，對(duì)LPS和CpGDNA的拮抗活性能夠很好的反映藥物對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。傳統(tǒng)清熱解毒中草藥長(zhǎng)期用于膿毒癥和自身免疫性疾病等免疫系統(tǒng)功能紊亂的治療，并具有較好的療效。現(xiàn)代藥理研究表明，中草藥中存在能夠結(jié)合和拮抗LPS和CpGDNA等病原分子作用的成分，并且是其糾正免疫紊亂、發(fā)揮防治膿毒癥和自身免疫性疾病作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。大承氣湯、熱毒清和熱毒平等制劑能夠降低膿毒癥病人循環(huán)血中內(nèi)毒素、TNF-α,IL-I和IL-6水平，金銀花、連翹、黃芩和青蒿等20余種單味中藥體外對(duì)LPS等病原分子具有良好的拮抗活性；白術(shù)湯能顯著降低風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中升高的LPS和TNF-α，抑制血清IgG、IgA、IgM水平，降低RF陽(yáng)性率。從而實(shí)現(xiàn)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用；由白花蛇舌草、半枝蓮、紫草、丹參、益母草等7味清熱中藥組成狼瘡方具可抑制LPS刺激引起的T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，減少I(mǎi)L-6和IL-10及自身抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療作用。然而中草藥中成分非常復(fù)雜，安全性不明，嚴(yán)重限制其應(yīng)用于臨床治療，因此分離能夠拮抗LPS和CpGDNA的中藥單體化合物，對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病防治水平的提高具有重要意義。地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)的干燥根皮。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中，地骨皮具有清熱解毒功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮主要含有生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、蒽醌類(lèi)和肽類(lèi)成分，發(fā)揮降血壓、降血糖、解熱和鎮(zhèn)痛等藥理作用。但有關(guān)地骨皮直接拮抗LPS和CpGDNA和用于膿毒癥和自身免疫性疾病治療的活性研究及應(yīng)用情況，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和國(guó)內(nèi)發(fā)明專(zhuān)利中均未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的中藥組分和提取物物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制不明的主要缺陷，研制一種安全、有效、質(zhì)量可控的預(yù)防治療膿毒癥和自身免疫性疾病的新藥物，以解決目前尚無(wú)有效藥物應(yīng)用臨床治療的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案是苦柯胺A和苦柯胺B在制備預(yù)防和治療細(xì)菌膿毒癥和自身免疫性疾病藥物中的用途。所述苦柯胺A和苦柯胺B從中藥地骨皮中提取。所述藥物用于治療膿毒癥和自身免疫性疾病。所述藥物用于拮抗導(dǎo)致膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素細(xì)菌內(nèi)毒素LPS和細(xì)菌CpGDNA。所述地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)的〒^ltfli^o申請(qǐng)人:長(zhǎng)期堅(jiān)持以L(fǎng)PS和CpGDNA為靶點(diǎn)進(jìn)行拮抗病原分子的藥物研究。通過(guò)利用建立的生物傳感器篩選和跟蹤平臺(tái)，從清熱解毒類(lèi)中藥中篩選和定向分離具有結(jié)合和拮抗LPS和CpGDNA作用的活性單體化合物。本發(fā)明以中藥地骨皮為原料，經(jīng)水煎法提取、大孔樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離和反相高效液相色譜純化等過(guò)程分離得到的兩種精胺類(lèi)生物堿化合物苦柯胺AGdikoamineA)和苦柯胺B(KukoamineB)，以L(fǎng)ipidA(LPS的活性中心)和CpGDNA為靶點(diǎn)的藥物篩選和定向分離平臺(tái)，以中藥提取液和各種組分與LipidA和CpGDNA的結(jié)合活性作為篩選指標(biāo)和定向分離依據(jù)，并通過(guò)體外LPS中和實(shí)驗(yàn)、LPS和CpGDNA與細(xì)胞結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)外對(duì)LPS和CpGDNA刺激引起的炎癥反應(yīng)的抑制實(shí)驗(yàn)等離體和在體的藥理實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法，最終篩選出兩種具有良好拮抗LPS和CpGDNA作用的活性成分苦柯胺A(KukoamineA，K.A)和苦柯胺B(KukoamineB，K.B)。本發(fā)明在有效的活性跟蹤手段的支持下，從中草藥中分離得到拮抗LPS和CpGDNA的活性物質(zhì)，明確其作用機(jī)制，為膿毒癥和自身免疫性疾病的防治研究提供安全、可靠和有效的新型藥物。所述苦柯胺A和苦柯胺B為兩種從地骨皮中提取、分離得到的精胺類(lèi)生物堿化合物，分子式C28H42N4O6，分子量530.66，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>苦柯胺B本發(fā)明中的苦柯胺A和苦柯胺B具有成為治療膿毒癥和自身免疫性疾病有效藥物的良好成藥前景，具體表現(xiàn)為(1)藥理活性方面申請(qǐng)人的離體實(shí)驗(yàn)證明，苦柯胺A和苦柯胺B與LPS和CpGDNA具有高親和活性，可顯著中和LPS和CpGDNA,阻斷二者與RAW264.7細(xì)胞(小鼠巨噬細(xì)胞)結(jié)合，進(jìn)而抑制LPS和CpGDNA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)和釋放炎癥介質(zhì)(TNF-α和IL-6等)，從源頭阻斷細(xì)胞的炎性活化，避免免疫反應(yīng)的紊亂；通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人也觀(guān)察到苦柯胺A和苦柯胺B可降低熱滅活大腸桿菌(模擬LPS和CpGDNA體內(nèi)注射)注射小鼠體內(nèi)的LPS和TNF-水平，對(duì)LPS和CpGDNA發(fā)揮拮抗作用。(2)藥學(xué)方面該兩種化合物在藥材中含量較高，易于制備，化合物本身理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全性較好(體外對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用，體內(nèi)單獨(dú)注射短期對(duì)小鼠無(wú)毒性作用)，因此苦柯胺A和苦柯胺B是一種治療膿毒癥和自身免疫性疾病的理想藥物。圖1為6種中藥水煎液與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)曲線(xiàn)，圖中橫軸的數(shù)值分別表示為1為地骨皮；2為牡丹皮；3為山茱萸；4為大黃；5.為黃芩；6為肉桂；圖2為CL-1-5與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)曲線(xiàn)；圖3為CL-4a-c與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)曲線(xiàn)；圖4為CLIb1和CL_4b2組分的高效液相色譜分析圖；圖5為K.A和K.B與LipidA(6&1)及CpGDNA(6a2)的結(jié)合活性檢測(cè)；圖6為K.A和K.B體外對(duì)LPS的中和作用；圖7為K.A和K.B對(duì)熒光標(biāo)記的LPS和CpGDNA與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合的抑制，圖中**:p<0.01vsFITC-LPSor5FAM_CpGDNA；圖8為K.A和K.B對(duì)熒光標(biāo)記的LPS和CpGDNA與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合的抑制，圖中*p<0.05，**p<0.01vsFITC-LPSor5FAM_CpGDNA；圖9為K.A和K.B對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響，圖中*ρ<0.05，氺氺ρ<0.01vsLPS；圖10為K.A和K.B對(duì)CpGDNA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響，圖中*ρ<0.05，**ρ<0.01vsCpGDNA；圖11為K.A和K.B對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響；圖12為K.A和K.B對(duì)熱滅活大腸桿菌(E.coil)ATCC35218攻擊小鼠血中LPS水平的影響，圖中*P<0.05，**p<0.01vsΕ.coli.；圖13為1(^和1(.8對(duì)熱滅活大腸桿菌伍.(；0丨1)41035218攻擊小鼠血中TNF-α7Κ平的影響，圖中*P<0.05，**p<0.01vsΕ.coli.。具體實(shí)施例方式由于LPS和CpGDNA是導(dǎo)致膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素，因此對(duì)LPS和CpGDNA的拮抗活性能夠很好的反映藥物對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。本實(shí)施方式中選取的模型均用于評(píng)價(jià)苦柯胺A和苦柯胺B對(duì)LPS和CpGDNA的結(jié)合和拮抗活性。并以此反應(yīng)二者對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的治療效果，并通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)指出的是，以下實(shí)施例僅是說(shuō)明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例中藥材及主要試劑來(lái)源1.114種中藥材來(lái)源名稱(chēng)及產(chǎn)地見(jiàn)表1。表1114種中藥名稱(chēng)和產(chǎn)地<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2.主要試劑提取分離試劑和材料無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉(分析純，重慶川東化工廠(chǎng)(集團(tuán))有限公司)，柱層析用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂和DOOl型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂購(gòu)自天津南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)；三氟醋酸(trifluoroaceticacid,TFA)、甲醇(MeOH，色譜純，美國(guó)霍尼韋爾(Honeywell)公司)細(xì)胞培養(yǎng)試劑GIBCODMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，新生牛血清(NCS)(美國(guó)Hyclone公司)；傳感器結(jié)合檢測(cè)試劑PBS(20mM,pH7.2)購(gòu)自武漢博士德公司，HCl(分析純)購(gòu)自重慶川東化工廠(chǎng)(集團(tuán))有限公司活性評(píng)價(jià)試劑LPS、FITC標(biāo)記的LPS、LipidA、5_FAM標(biāo)記的CpGDNA,四氮噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自sigma公司；RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自ATCC；生物傳感器樣品池及包被試劑購(gòu)自Thermo公司；鱟試劑及LPS檢查用水購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；小鼠TNF-αELISA試劑盒為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品；KM小鼠(SPF級(jí))購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)施例1:114種中藥水煎液與LipidA和CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)測(cè)定結(jié)果1.1實(shí)驗(yàn)方法(1)應(yīng)用光學(xué)親和生物傳感器技術(shù)(3冊(cè)技術(shù))，將類(lèi)脂六(1^丨(1A，LPS的生物學(xué)活性中心分子)和CpGDNA分別包被于親和型特異選擇性生物傳感器IAsysPlus(Affinity-sensorIAsysplus)的樣品池作為固定相配基。對(duì)于LipidA，將其一端的疏水側(cè)鏈與帶有疏水表面的樣品池結(jié)合，使另一端的磷酸基團(tuán)(LipidA活性基團(tuán))游離并暴露于外側(cè)，以此作為與中藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點(diǎn)，在溶液中的活性物質(zhì)通過(guò)靜電作用等方式與LipidA發(fā)生結(jié)合作用；對(duì)于CpGDNA，首先將親和素包被于表面帶有生物素分子的樣品池上，然后將生物素標(biāo)記的CpGDNA與親和素鏈接從而固定于樣品池上，未標(biāo)記基團(tuán)游離并暴露于外側(cè)，并以此作為與中藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點(diǎn)，在溶液中活性物質(zhì)通過(guò)靜電作用和嵌入等方式與CpGDNA發(fā)生結(jié)合作用；(2)將114種中藥材磨成粉狀，各取Ig裝入編號(hào)試管中，分別加入IOml蒸餾水，100°C水浴1.5h，4000rpm離心20min，過(guò)濾，收集上清液，每種藥材分別取5μL上清液上樣，測(cè)定其與LipidA或CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)，具體操作步驟如下①結(jié)合反應(yīng)加入PBS45μL，再力口入5μL待測(cè)樣品，結(jié)合反應(yīng)平衡后吸出；②解離反應(yīng)PBS沖洗50μLX3，解離反應(yīng)平衡后吸出；③再生反應(yīng)0.IN的HCl50μLX3，再生反應(yīng)平衡后吸出；④PBS沖洗50μLX3，曲線(xiàn)回至基線(xiàn)后加入45yLPBS和5μL另一待測(cè)樣品，開(kāi)始新的循環(huán)。檢測(cè)結(jié)束后，采用FASTplot軟件分析數(shù)據(jù)。1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果114種中藥中，地骨皮等6種中藥同時(shí)與LipidA和CpGDNA具有高親和活性，其中又以地骨皮親和活性最高，提示其含抗LPS和CpGDNA活性物質(zhì)的可能性較其它中藥大。故選擇其作為提取分離研究對(duì)象，結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2地骨皮抗LPS和CpGDNA有效成份苦柯胺A和苦柯胺B的提取與分離2.1大孔吸附樹(shù)脂分離及活性部位篩選2.1.1實(shí)驗(yàn)方法地骨皮(CL)約500g，加5.OL蒸餾水浸泡24h，100°C煎煮lh，粗濾紙濾過(guò)，8000rpm/min離心30min，收集上清液減壓濃縮至約1.OL；然后上樣于A(yíng)B-8型大孔吸附樹(shù)脂，分別以蒸餾水和10%、20%、40%、100%的乙醇依次梯度洗脫，收集各洗脫液，分別減壓濃縮后冷凍抽干，得到5種組分，按洗脫先后順序依次命名為CL-I5，將CL各組分以PBS溶解成1.Omg/ml，取5μL上樣，按1.1方法檢測(cè)其與LipidA及CpGDNA的結(jié)合活性。2.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果5種組分中，CL-4與LipidA和CpGDNA結(jié)合活性較高，提示其為CL組分的主要活性部位，因此，選擇CL-4進(jìn)一步分離。結(jié)果如圖2所示。2.2強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離及活性部位篩選2.2.1實(shí)驗(yàn)方法CL-4凍干粉加超純水稀釋成100mg/ml，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后上樣于DOOl型強(qiáng)陽(yáng)離子樹(shù)脂，分別以蒸餾水和0.3M、0.5MNa2HPO4進(jìn)行淋洗，收集各洗脫液，分別減壓濃縮后冷凍抽干，得到3種組分，分別命名為CL-4a、b和C。2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得CL_4a、b和c3個(gè)組分，按1.1方法檢測(cè)與LipidA和CpGDNA的結(jié)合活性，篩選出與LipidA和CpGDNA結(jié)合活性較高CL_4b組分。結(jié)果如圖3所7J\ο2.3制備液相色譜分離2.3.1實(shí)驗(yàn)方法①色譜條件選擇儀器采用Agilent1200Series高效液相色譜儀(分析型)，CL-4b用流動(dòng)相(Α(0·1%TFA)B(MeOH)=8020,ν/ν,)配制成0.5mg/mL濃度。采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的AgilentXDB-C18色譜柱(150X4.6mm，5^111)，檢測(cè)波長(zhǎng)28()11111，流速lmL/min，柱溫25°C，進(jìn)樣量10μL；②高效液相色譜制備儀器采用Agilent1100Series高效液相色譜儀(制備型)，CL_4b用流動(dòng)相(A(0.1%TFA)B(MeOH)=8020，ν/ν,)配制成20mg/mL濃度。采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的KF-C18色譜柱(200X20mm，10μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流速10mL/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量20mL。收集保留時(shí)間為16至20、20至30分鐘的色譜峰餾分，負(fù)壓抽干，得到2種成分，按保留時(shí)間先后順序依次命名為CLIb1和CL-4b2，將CLIb1和CL-4b2組分以PBS溶解成1.Omg/ml，取5μL上樣，按1.1方法檢測(cè)其與LipidA和CpGDNA的結(jié)合活性。2.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)高效液相色譜分析與制備，獲得CLIb1和CL_4b2兩個(gè)主要成分，其色譜行為如圖4所示。經(jīng)高效液相色譜DAD五點(diǎn)峰純度分析，可初步確認(rèn)為單一化合物(純度大于98%)。2.4化合物CLIb1和CL_4b2化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定2.4.1實(shí)驗(yàn)方法對(duì)CLIb1和CL_4b2進(jìn)行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振波譜以及質(zhì)譜檢測(cè)。2.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物CLIb1和CL_4b2均為淺黃色塊狀結(jié)晶。紫外吸收光譜λ-281nm(甲醇)，F(xiàn)AB-mass質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果為[M+l]+m/z531，提示兩者為同分異構(gòu)體，核磁共振結(jié)果見(jiàn)表2表2苦柯胺A和苦柯胺B的核磁檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>經(jīng)結(jié)構(gòu)解析，確定CLIb1為苦柯胺A(KukoamineA，K.A)，CL_4b2為苦柯胺B(KukoamineB,K.B)。實(shí)施例3:K.A和K.B體外與LipidA及CpGDNA的親和力測(cè)定3.1實(shí)驗(yàn)方法將K.A和K.B制成濃度為100μM的工作液，分別取5μL上樣，測(cè)定其與LipidA或CpGDNA的結(jié)合反應(yīng)，具體操作步驟如下①結(jié)合反應(yīng)加入PBS45yL，再力口入5μL待測(cè)樣品，結(jié)合反應(yīng)平衡后吸出；②解離反應(yīng)PBS沖洗50μLX3，解離反應(yīng)平衡后吸出；③再生反應(yīng)0.IN的HCl50μLX3，再生反應(yīng)平衡后吸出；④PBS沖洗50μLX3，曲線(xiàn)回至基線(xiàn)后加入45yLPBS和5μL另一待測(cè)樣品，開(kāi)始新的循環(huán)。檢測(cè)結(jié)束后，采用FASTplot軟件分析數(shù)據(jù)。3.22實(shí)驗(yàn)結(jié)果:K.A與K.B和LipidA及CpGDNA均具有高親和活性。結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例4:K.A和K.B體外結(jié)合中和LPS的活性4.1實(shí)驗(yàn)方法將K.A和K.B均(1，2，4μβ/πι1)分別與濃度為2.Ong/ml的LPS等體積混合，37°C孵育30min，LPS對(duì)照組加等量無(wú)熱原水，采用動(dòng)態(tài)濁度法鱟試驗(yàn)檢測(cè)孵育后的LPS值，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次。LPS含量以以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。具體操作按EDS-99細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，K.A和K.B均具有中和LPS的活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明K.A和K.B對(duì)LPS有顯著的中和作用(ρ<0.05或ρ<0.01)并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示二者可對(duì)LPS進(jìn)行有效拮抗，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。結(jié)果如圖6所示。實(shí)施例5:K.A和K.B對(duì)熒光標(biāo)記的LPS和CpGDNA與RAW264.7細(xì)胞結(jié)合作用的影響5.1實(shí)驗(yàn)方法采用含有10%NCS(ν/ν)的DMEM培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋至1XIOVmL,加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02條件下孵育4h貼壁后，分別加入K.A和K.B(均為0.200μg/ml)，隨即加入FITC標(biāo)記的LPS(終濃度400ng/ml)和5FAM標(biāo)記的CpGDNA(終濃度10μg/ml)，同時(shí)設(shè)不加任何藥物的空白對(duì)照組(medium)，繼續(xù)孵育30min后，PBS洗滌細(xì)胞三次，吹打細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中，4%多聚甲醛固定IOmin后PBS洗滌細(xì)胞三次，制成細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組重復(fù)三次，平均熒光強(qiáng)度以以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果K.A和K.B顯著降低RAW264.7細(xì)胞中LPS和CpGDNA的熒光強(qiáng)度(P<0.01)，表明二者可影響LPS和CpGDNA與RAW264.7細(xì)胞的結(jié)合，有效抑制二者刺激引起的過(guò)度免疫反應(yīng)，避免對(duì)機(jī)體的損傷，發(fā)揮對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。結(jié)果如圖7-8所示。實(shí)施例6K.A和K.B對(duì)LPS和CpGDNA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響6.1實(shí)驗(yàn)方法采用含有10%NCS(ν/ν)的DMEM培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋至1XIOVmL,加入96孔板(200μL/孔)，在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02條件下孵育4h貼壁后；更換新鮮培養(yǎng)液，分別加入終濃度為0、50、100μg/ml的K.A和K.B；隨即加入LPS(終濃度lOOng/ml)和CpGDNA(終濃度10μg/ml)，同時(shí)設(shè)不加任何刺激物的空白對(duì)照組(medium)，繼續(xù)孵育4h；取上清按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)TNF-α的濃度，結(jié)果以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果K.A和K.B以劑量依賴(lài)的方式抑制LPS和Cp⑶NA誘導(dǎo)的TNF-α釋放，與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.01，結(jié)果如圖9-10所示)。TNF-α的大量或持續(xù)釋放對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的病理?yè)p傷具有重要意義。因此抑制TNF-α的釋放可以有效發(fā)揮對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。實(shí)施例7:K.A和K.B對(duì)細(xì)胞活力影響的測(cè)定(MTT法)7.1實(shí)驗(yàn)方法采用四氮噻唑藍(lán)(MTT)法，用DMEM培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋至1X106/ml，加入96孔板(200μL/孔)，置37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，實(shí)驗(yàn)組依次加入終濃度為200μg/ml的K.A和K.B；正常對(duì)照組不加任何試劑。各組均設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，每孔加入180μL培養(yǎng)液和20μLMTT溶液(5mg/ml)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩IOmin使結(jié)晶充分溶解，以550nm處測(cè)定的各孔吸光度(OD55tl)值表示RAW264.7細(xì)胞活力，比較K.A和K.B與對(duì)照組之間的吸光度的差異。7.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，200μg/mlK.A和K.B對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無(wú)影響(P>0.05)，表明該濃度的的K.A和K.B對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用不是由其細(xì)胞毒性導(dǎo)致的。結(jié)果如圖11所示。實(shí)施例8:K.A和K.B體內(nèi)對(duì)LPS和CpGDNA的拮抗作用8.1實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)制備熱滅活E.coil懸液，于波長(zhǎng)600nm處檢測(cè)懸液吸光度值(OD6tltl值1.01.0X1010CFU/ml)；昆明小鼠84只，雌雄各半，隨機(jī)分為熱滅活E.coil對(duì)照組，K.A(40mg/kg)+Ε.coil.組和Κ·B(40mg/kg)+Ε·coil.組，每組各28只。動(dòng)物稱(chēng)重后，熱滅活E.coil對(duì)照組注入熱滅活E.coil(1.1X1010CFU/Kg)；，K.A和K.B治療組于熱滅活E.coil(1.1X10nCFU/Kg)注入IOmin后分別注射40mg/Kg的K.A和K.B。每只動(dòng)物液體注入總量為200μl/20g,分別在注射后0、2、4、8、12、24、48和72h眼眶取靜脈血，鱟試劑動(dòng)態(tài)比濁法檢測(cè)LPS水平，ELISA法檢測(cè)TNF-α水平。8.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12-13所示，熱滅活E.coil.細(xì)胞本身無(wú)增殖活力，但其中含有大量的LPS和CpGDNA，在體內(nèi)能夠很好地模擬LPS和CpGDNA的刺激作用。熱滅活E.coil.對(duì)照組小鼠在4h后血LPS和TNF-α迅速升高，在24_48h內(nèi)回復(fù)到初始狀態(tài)。與熱滅活E.coil對(duì)照組相比，K.A和K.B治療組可顯著降低小鼠在各時(shí)相點(diǎn)的血LPS和TNF-α水平(ρ<0.05或ρ<0.01)，說(shuō)明二者在體內(nèi)對(duì)LPS和CpGDNA均具有很好的拮抗活性，可通過(guò)抑制LPS和CpGDNA的刺激作用，阻止TNF-α的大量或持續(xù)釋放，有效發(fā)揮對(duì)膿毒癥和自身免疫性疾病的防治作用。權(quán)利要求一種苦柯胺A和苦柯胺B在制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述苦柯胺A和苦柯胺B從中藥地骨皮中提取。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述地骨皮為茄科植物枸杞或?qū)幭蔫坭礁稍锔ぁ?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物用于制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物用于拮抗導(dǎo)致膿毒癥和自身免疫性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)和細(xì)菌非甲基化DNA(CpGDNA)。全文摘要本發(fā)明涉及一種苦柯胺A和苦柯胺B用于制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途。本發(fā)明以誘發(fā)膿毒癥及自身免疫性疾病的主要病原分子細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)和細(xì)菌非甲基化DNA(CpGDNA)為靶點(diǎn)，從中藥中定向分離藥物先導(dǎo)化合物，克服了現(xiàn)有中藥組分和提取物物質(zhì)基礎(chǔ)和作用靶點(diǎn)不明的主要缺陷，研制一種安全、有效、質(zhì)量可控的新藥物，以解決目前膿毒癥及自身免疫性疾病缺乏有效治療藥物的問(wèn)題。文檔編號(hào)A61K31/165GK101829075SQ20101015650公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年4月27日優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日發(fā)明者劉鑫,周紅,曹紅衛(wèi),王寧,鄭新川,鄭江,魯永玲申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院