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      一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法

      文檔序號(hào):993049閱讀:543來(lái)源:國(guó)知局

      專利名稱::一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明屬植物藥獼猴桃的制備領(lǐng)域,特別是涉及一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法。
      背景技術(shù)
      :作為藥用的獼猴桃根系獼猴桃科獼猴桃屬植物《中華獼猴桃Actinidiachi體sisPlanch.》或獼猴梨《軟麥獼猴桃Actinidiaargute(Sieb.etZucc)Planch.》的根,收載于中國(guó)藥典1977年版P551。具有解毒活血、清熱利濕之功效,民間臨床上常用于抗腫瘤。在CN01128730、CN1093594A、CN1478495ACN02114318、CN02129513、CN03156252、CN200410022919等中國(guó)專利中都涉及了制備具有抗癌作用的復(fù)方中成藥中使用了藤梨根或獼猴桃根,這些專利大多涉及復(fù)方中成藥的配方組成、制備和應(yīng)用,而不是強(qiáng)調(diào)單方藤梨根提取有效部位和膠囊制劑的新藥制備。申請(qǐng)?zhí)?005100326685公開了藤梨根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途,該藤梨根抗腫瘤提取物可通過(guò)水或有機(jī)溶劑在70w10(TC溫度下浸提、然后減壓濃縮、調(diào)酸、乙酸乙酯萃取、聚酰胺層析、溶劑洗脫、濃縮干燥制得。但上述專利中未使用大孔樹脂分離,而用乙酸乙酯萃取,此方法在大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)帶來(lái)設(shè)備、勞防、環(huán)保等問(wèn)題,此方法未解決提取物制備新藥的制劑。專利CN100457116C中,闡述了獼猴桃素的制備方法和通用制劑的制備,缺少制劑的實(shí)際操作和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
      發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法,該方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),除了生產(chǎn)工藝方面的成熟,還解決了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性保障,獼猴桃膠囊可以用于防治肺癌及消化道腫瘤。本發(fā)明的一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法,包括(1)取中華獼猴桃根(市售)粗粉,加6-12倍量去離子水,浸泡10-60分鐘,加熱煮沸,保持沸騰l-3小時(shí),濾取藥液;第二次煎煮加6-10倍量去離子水,煎煮1-2小時(shí);第三次煎煮加4-8倍量去離子水,煎煮0.5-1.5小時(shí);合并三次煎液,靜置過(guò)夜,濾取上清液,真空濃縮至相對(duì)密度1.06-1.12;(2)將澄清劑加入到上述水提濃縮液中,邊加入邊攪拌,至無(wú)沉淀后靜置12小時(shí),濾取上清液,加乙醇至藥液含醇量達(dá)15-30%(V/V),過(guò)濾,棄沉淀,濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)75-85%(V/V),過(guò)濾;(3)沉淀物將上述過(guò)濾后的沉淀物抽干,加乙醇洗滌,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉(多糖);(4)濾液回收乙醇,至無(wú)醇,加水溶解,通過(guò)D型大孔吸附樹脂的柱子,先用去離子水洗脫至無(wú)色,再用15%(V/V)乙醇洗脫至無(wú)色,繼用55%(V/V)乙醇洗脫至無(wú)色,收取55%(V/V)乙醇洗脫液,回收乙醇,流份濃縮至浸膏(比重1.30-1.35),再用70-80%(V/V)乙醇溶解,過(guò)濾,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉(提取物);(5)制劑將步驟(3)和(4)所制得的細(xì)粉按質(zhì)量比13:l,充分混勻,制成細(xì)顆粒,填充膠囊即得。所述步驟(2)中的為每100ml醋酸溶液含有O.1-0.8g殼聚糖,該醋酸溶液的濃度為0.5-1.5%(V/V)。所述步驟(4)中的D型大孔吸附樹脂的用量為步驟(1)中獼猴桃根粗粉重量的0.5-1.5倍。本發(fā)明提供了從獼猴桃根提取獼猴桃中的有效成分的方法,用純凈水煎煮使用本煎煮方法,雜質(zhì)少,有效成分轉(zhuǎn)移率高;醇提加大孔樹脂分離,富集了脂溶性有效成分。制成膠囊后,避免了通常煎服的使用原藥材量大、煎煮不方便、攜帶麻煩、劑量不準(zhǔn)、雜質(zhì)太多等弊病。有益效果本發(fā)明的制備方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),將獼猴桃根中的有效成分精制,保留水溶性的多糖和脂溶性的甾萜及苷類;除了生產(chǎn)工藝方面的成熟,還解決了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性保障,獼猴桃膠囊可以用于防治肺癌及消化道腫瘤。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1取藤梨根(中華獼猴桃根別名)10kg,加100L去離子水,浸泡30分鐘,加熱煮沸,保持沸騰2小時(shí),濾取藥液;第二次煎煮加80L去離子水,煎煮1.5小時(shí);第三次煎煮加80L去離子水,煎煮1小時(shí);合并三次煎液,靜置過(guò)夜,濾取上清液,真空濃縮至相對(duì)密度1.08;用澄清劑含0.5%(g/ml)殼聚糖的1%(v/v)醋酸溶液,加入水提濃縮液中,邊加入邊攪拌,至無(wú)沉淀后靜置12小時(shí),濾取上清液,加乙醇至藥液含醇量達(dá)28%(v/v),過(guò)濾,棄沉淀,濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)78%(v/v),過(guò)濾;沉淀物將上述過(guò)濾后的沉淀物抽干,加約500ml乙醇洗滌,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉約200g;濾液回收乙醇,至無(wú)醇,加水溶解,通過(guò)已活化的D101-II型大孔吸附樹脂10kg的柱子,用去離子水洗脫至無(wú)色,再用15%(v/v)乙醇洗脫至無(wú)色,繼用55%(v/v)乙醇洗脫至無(wú)色,收取55%(v/v)乙醇洗脫液,回收乙醇,濃縮至浸膏(比重1.30),再用75%(v/v)乙醇溶解,過(guò)濾,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉約100g;將沉淀物與萃取物混合,制成細(xì)顆粒,填充膠囊1000粒,即得。實(shí)施例2取藤梨根10kg,加120L去離子水,浸泡20分鐘,加熱煮沸,保持沸騰2小時(shí),濾取藥液;第二次煎煮加100L去離子水,煎煮1小時(shí);第三次煎煮加80L去離子水,煎煮1小時(shí);合并三次煎液,靜置過(guò)夜,濾取上清液,真空濃縮至相對(duì)密度1.08;用澄清劑含0.1%(g/ml)殼聚糖的O.5%(V/V)醋酸溶液,加入水提濃縮液中,邊加入邊攪拌,至無(wú)沉淀后靜置12小時(shí),濾取上清液,加乙醇至藥液含醇量達(dá)15%(V/V),過(guò)濾,棄沉淀,濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)75%(V/V),過(guò)濾;沉淀物將上述過(guò)濾后的沉淀物抽干,加600ml乙醇洗滌,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉約210g;濾液回收乙醇,至無(wú)醇,加水溶解,通過(guò)已活化的D101-II型大孔吸附樹脂12kg的柱子,用去離子水洗脫至無(wú)色,再用10%(V/V)乙醇洗脫至無(wú)色,繼用50%(V/V)乙醇洗脫至無(wú)色,收取50%(v/v)乙醇洗脫液,回收乙醇,濃縮至浸膏(比重1.33),再用70%(V/V)乙醇溶解,過(guò)濾,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉約105g;將沉淀物與萃取物混合,制成細(xì)顆粒,填充膠囊1000粒,即得。實(shí)施例3取藤梨根10kg,加60L去離子水,浸泡60分鐘,加熱煮沸,保持沸騰1小時(shí),濾取藥液;第二次煎煮加60L去離子水,煎煮1小時(shí);第三次煎煮加60L去離子水,煎煮1小時(shí);合并三次煎液,靜置過(guò)夜,濾取上清液,真空濃縮至相對(duì)密度1.08;用澄清劑含0.8%(g/ml)殼聚糖的1.5%(V/V)醋酸溶液,加入水提濃縮液中,邊加入邊攪拌,至無(wú)沉淀后靜置12小時(shí),濾取上清液,加乙醇至藥液含醇量達(dá)30%(V/V),過(guò)濾,棄沉淀,濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)85%(V/V),過(guò)濾;沉淀物將上述過(guò)濾后的沉淀物抽干,加450ml洗滌,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉約185g;濾液回收乙醇,至無(wú)醇,加水溶解,通過(guò)已活化的D101-11型大孔吸附樹脂8kg的柱子,用去離子水洗脫至無(wú)色,再用20%(V/V)乙醇洗脫至無(wú)色,繼用60%(V/V)乙醇洗脫至無(wú)色,收取60%(V/V)乙醇洗脫液,回收乙醇,濃縮至浸膏(比重1.35),再用80%乙醇溶解,過(guò)濾,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉約96g;將沉淀物與萃取物混合,制成細(xì)顆粒,填充膠囊1000粒,即得。實(shí)施例性狀本品為膠囊劑,內(nèi)容物為棕黃色至淡褐色的粉末。鑒別1、取本品0.lg,加水10ml溶解,取2-3ml,加入等量的菲林試劑(堿性酒石酸銅試劑)置沸水浴中加熱數(shù)分鐘,即產(chǎn)生紅色沉淀。2、另取本品溶液2-3ml,加入a-萘酚試劑3滴,沿壁加入濃硫酸,分層處呈顯紫色環(huán)反應(yīng)。3、取本品1.0g,加甲醇30ml,超聲提取30min,過(guò)濾,濾液水浴蒸干,殘?jiān)铀?5ml溶解,用醋酸乙酯20ml提取2次,取醋酸乙酯層,水浴蒸干,殘?jiān)蛹状?ml使溶解,作為供試品溶液。另取獼猴桃根5g對(duì)照品,同上方法處理,加甲醇制成每lml,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VIB)試驗(yàn),吸取上述溶液各10iU,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:IO)I(TC以下放置過(guò)夜的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,加熱至斑點(diǎn)顯色。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。檢查水分不得過(guò)9.0%。崩解時(shí)限不得過(guò)30分鐘。微生物限度檢查細(xì)菌數(shù)應(yīng)不得過(guò)1000個(gè)/g。霉菌數(shù)應(yīng)不得過(guò)100個(gè)/g。大腸桿菌應(yīng)不得檢出。含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備精密稱取105t:干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品適量,加水制成每lml含O.lmg的溶液,即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.Oml,1.2mlml,置10ml具塞試管中,加水至2.Oml,精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.lg,加80%的硫酸溶液100ml使溶解,搖勻)6ml,搖勻,置水浴中加溫?zé)?5分鐘,取出,放人冰浴中冷卻15分鐘,以相應(yīng)的試劑作空白,照紫外_可見分光光度法(附錄VA),在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。供試品溶液的制備取本品粉末約2g,精密稱定,置索氏提取器中,加水90ml,電加熱器加熱回流提取至提取液無(wú)色,提取液轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取10ml,加入乙醇150ml,搖勻,4t:放置12個(gè)小時(shí),取出,離心,傾去上清液,,沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得。測(cè)定法精密量取供試品溶液2ml,置10ml具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自"精密加入硫酸蒽酮溶液6ml"起,依法測(cè)定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的含葡萄糖的重量(mg),計(jì)算,即得。本品每粒膠囊內(nèi)容物含獼猴桃多糖以葡萄糖計(jì),不得少于10mg。功能主治扶正祛邪,清肺抑瘤,活血益氣。用法與用量口服,一次2粒,一日2-3次?;蜃襻t(yī)囑。規(guī)格每粒裝0.3g。40粒/瓶貯藏陰涼處密封保存實(shí)施例51、實(shí)驗(yàn)?zāi)康墨J猴桃膠囊體外抗腫瘤作用研究。2、儀器設(shè)備(1)C02細(xì)胞培養(yǎng)箱,PHA薩SCIENTIFIC(2)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,Labsystems,wellscan,MK.2(3)垂直單面雙人超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備廠(4)倒置生物顯微鏡,37XB/37XBTV,上海光學(xué)儀器六廠3、實(shí)驗(yàn)材料及配制(1)細(xì)胞株NCI-H460(人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)、K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)、A549(人肺癌細(xì)胞)、上述細(xì)胞株按實(shí)驗(yàn)規(guī)范凍存和傳代。(2)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO):含10%滅活新生小牛血清(上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司);L-谷氨酰氨(進(jìn)口分裝,SANG0N);丙酮酸鈉;1X105U.L—1青霉素,lOOmg.L—1鏈霉素;無(wú)菌過(guò)濾,4t:保存。(3)0.25%胰蛋白酶溶液(Trypsin):購(gòu)自Invitrogen公司,-2(TC保存。(4)磷酸緩沖液(PBS):NaC18g,KC10.2g,Na2HP04l.15g,KH2P040.2g,溶于1L雙蒸水,121°C高壓消毒20min,4°C保存。(5)MTT(AMRESCO)溶液用PBS配成5mg/ml溶液。(6)溶解液每100ml去離子雙蒸水含SDS10g,異丁醇5ml,濃硫酸0.12ml。(7)樣品獼猴桃膠囊(8)對(duì)照品順鉬4、實(shí)驗(yàn)方法對(duì)上述腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性通過(guò)MTT法測(cè)得。具體步驟如下(1)細(xì)胞培養(yǎng)①將細(xì)胞從液氮中取出,在37t:水浴中迅速解凍,細(xì)胞在無(wú)菌操作臺(tái)中移入10ml無(wú)菌離心管中加6mlRPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基,1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。棄去上清液,沉淀中加入5-6mlRPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基,滴管吹打使其懸浮后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。②次日,自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,棄去細(xì)胞瓶中RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基〔除K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)懸浮細(xì)胞〕,加入5-6mlRPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基,置37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。③隔日,自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,棄去細(xì)胞瓶中RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基〔除K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株),加入PBS(ra7.4)2_3ml晃動(dòng)清洗,倒掉PBS溶液后再重復(fù)一次清洗。在培養(yǎng)瓶中加入3-5滴0.25%胰蛋白酶溶液晃動(dòng)均勻,加蓋置于371:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3分鐘左右,于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁上脫離,加RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基2ml,滴管吹打使細(xì)胞完全脫離瓶壁后,分別移入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中,加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基5-6ml吹打均勻,置于37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)懸浮細(xì)胞取出l-2ml懸浮液,分別移入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中,加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基5_6ml,置于37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。④隔日,重復(fù)③步驟。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,貼壁細(xì)胞不允許生長(zhǎng)過(guò)密,懸浮細(xì)胞始終保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。(2)樣品制備用DMS0溶解后,加入PBS配成1000yg/ml的溶液或均勻的混懸液,然后用PBS稀釋。對(duì)照品制備用DMS0溶解后,加入PBS配成1000yg/ml的溶液或均勻的混懸液,然后用PBS稀釋為100、10、1、0.liig/ml。(3)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中,每孔10iU,每點(diǎn)作兩個(gè)平行測(cè)試。將匿S0相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中,作為對(duì)照。(4)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,經(jīng)苔盼藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù),并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2X105細(xì)胞/ml。(5)在平底96孔板中,每孔加入90微升細(xì)胞,于371:、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。(6)將加入細(xì)胞的平底96孔板在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。(7)每孔中加入20ii15mg/mlMTT溶液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫34小時(shí)。(8)每孔加入100ii1溶解液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過(guò)夜,使生成的甲臢晶體充分溶解。測(cè)定492nm光吸收值。(9)根據(jù)光吸收值計(jì)算SM仁;005;處理后細(xì)胞相對(duì)存活率。計(jì)算公式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(10)通過(guò)軟件計(jì)算對(duì)各腫瘤細(xì)胞的工C5n05、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1.對(duì)各細(xì)胞株的體外增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例6l獼猴桃膠囊對(duì)小鼠溶血素的影響1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察獼猴桃膠囊對(duì)小鼠溶血素的影響。1.2受試藥物藥物名稱獼猴桃膠囊提供單位趙正福1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠,急性,18—20g,由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)SCXK(滬)2003一o0031.4實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量為o.5g/kg;1.5g/kg1.5陽(yáng)性藥名稱云芝糖肽膠囊規(guī)格o.34g/粒用法用量一次3粒,一日3次。實(shí)驗(yàn)劑量lg/kg1.6給藥途徑及容量灌胃給藥,o.5ml/20g。1.7實(shí)驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分組,每組lo只。獼猴桃膠囊2個(gè)劑量組,陽(yáng)性藥組,空白對(duì)照組。分組后第二天開始給藥,連續(xù)一個(gè)月,每星期稱重一次,根據(jù)體重調(diào)正給藥量,于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4天將濃度為20%的綿羊紅細(xì)胞懸液,按o.2ml/鼠從腹腔注入。4天后眼球取血,分離離心血清。所得血清按500倍稀釋,取lml稀釋血清加入lo%o.5ml綿羊紅細(xì)胞、再加入lml經(jīng)預(yù)處理的llo豚鼠血清,37℃水浴lo分鐘后置入冰水終止反應(yīng)。2000r/min離心lo分鐘取上清液lml加3ml都氏試劑,放置lo分鐘后在722S分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)處測(cè)定。D值。HQ測(cè)定取10%綿羊紅細(xì)胞0.25ml加3ml都氏試劑,放置10分鐘后測(cè)定0D值。按下列公式計(jì)算每個(gè)樣品的半鼠溶血值(HC5。)。HC5。=(樣品0D值/羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)0D值)X稀釋倍數(shù)1.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表2可知獼猴桃膠囊具有增加小鼠溶血素作用,提高體液免疫。陽(yáng)性藥也顯示一定的作用。表2獼猴桃膠囊對(duì)小鼠HC5。的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>各組與模型組比較fp<0.05;**P<0.01。2獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能的影響2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能的影響。2.2受試藥物藥物名稱獼猴桃膠囊提供單位趙正福2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠,$性,18-20g,由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)SCXK(滬)2003-00032.4實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量為0.5g/kg;1.5g/kg2.5陽(yáng)性藥名稱云芝糖肽膠囊規(guī)格0.34g/粒用法用量一次3粒,一日3次。實(shí)驗(yàn)劑量lg/kg2.6給藥途徑及容量灌胃給藥,O.5ml/20g。2.7實(shí)驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分組,每組10只。獼猴桃膠囊2個(gè)劑量組,陽(yáng)性藥、空白對(duì)照各一組。分組后第二天開始給藥,連續(xù)一個(gè)月,每星期稱重一次,根據(jù)體重調(diào)正用藥量。連續(xù)給藥一個(gè)月,在最后一次給藥后一小時(shí)小鼠腹腔內(nèi)注射2%雞紅細(xì)胞(經(jīng)去除纖維蛋白,生理鹽水多次洗滌)0.2ml/只,4小時(shí)后處死小鼠,用生理鹽水沖洗腹腔,收集沖洗液、離心,傾去上清液,收集細(xì)胞涂片,涼干后用瑞氏染色液染色,油鏡下觀察。計(jì)數(shù)100個(gè)巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù),按下公式計(jì)算。(1)吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨嗜細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨嗜細(xì)胞數(shù),(2)吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/100巨嗜細(xì)胞數(shù)。2.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可知獼猴桃膠囊具有促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用,表明該藥對(duì)非特異性免疫也有促進(jìn)作用。表3獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各組與模型組比較fp<0.05;**P<0.01。3.獼猴桃膠囊對(duì)C57小鼠NK細(xì)胞活性及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能的影響。3.2受試藥物藥物名稱獼猴桃膠囊提供單位趙正福3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠C57BL/6,$性,18-20g,由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)SCXK(滬)2003-00033.4實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量為0.5g/kg;1.5g/kg3.5陽(yáng)性藥名稱云芝糖肽膠囊規(guī)格0.34g/粒用法用量一次3粒,一日3次。實(shí)驗(yàn)劑量lg/kg3.6給藥途徑及容量灌胃給藥,O.5ml/20g。3.73H_TdR上海原子核研究所,放射濃度20muci/ml3.8實(shí)驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分組,每組6只。獼猴桃膠囊2個(gè)劑量組,陽(yáng)性藥、空白對(duì)照各一組。分組后第二天開始給藥,連續(xù)一個(gè)月,每星期稱重一次,根據(jù)體重調(diào)正用藥量。最后一次給藥后1小時(shí)斷頸處死小鼠,無(wú)菌取脾,用手術(shù)剪刀將脾臟剪碎、制成懸液,離心去上清液,用1640培養(yǎng)劑調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107ml細(xì)胞,進(jìn)行NK活性測(cè)定及淋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。(1)NK活性測(cè)定在96孔培養(yǎng)板中加入1X107ml濃度脾細(xì)胞100ul作為效應(yīng)細(xì)胞,另取已培養(yǎng)24小時(shí)處于旺盛生長(zhǎng)期的YAC-1、濃度IX10Vml細(xì)胞100ul作為靶細(xì)胞加入培養(yǎng)板中,同時(shí)加3H_TdR0.4uci/孔在37t:、C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),收集細(xì)胞在液閃儀上測(cè)定CPM值,各組設(shè)6復(fù)管,自然摻入組不加脾細(xì)胞。(2)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化測(cè)定在96孔培養(yǎng)板中加入1X107ml濃度脾細(xì)胞100ul,ConA(50ug/ml)50ul,在5XC02、37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí),加入20ul3H_TdR培養(yǎng)24小時(shí),各組設(shè)6復(fù)管,對(duì)照管用培養(yǎng)劑代替,培養(yǎng)結(jié)束后在多孔細(xì)胞收集器上收集細(xì)胞,5%TCA固定,無(wú)水乙醇脫水,液閃儀上測(cè)定CPM值。NK活性=(對(duì)照組CPM值-實(shí)驗(yàn)組CPM值)/(對(duì)照組CPM值-自然摻入組CPM值)X100%淋轉(zhuǎn)指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組CPM值/對(duì)照組CPM值3.9實(shí)驗(yàn)結(jié)果獼猴桃膠囊對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性具有促進(jìn)作用,表明該藥對(duì)細(xì)胞免疫也有作用。表4獼猴桃膠囊對(duì)小鼠NK活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例7表5獼猴桃膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6獼猴桃膠囊對(duì)小鼠S180抑瘤試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法,包括(1)取獼猴桃根粗粉,加6-12倍量去離子水,浸泡10-60分鐘,加熱煮沸,保持沸騰1-3小時(shí),濾取藥液;第二次煎煮加6-10倍量去離子水,煎煮1-2小時(shí);第三次煎煮加4-8倍量去離子水,煎煮0.5-1.5小時(shí);合并三次煎液,靜置過(guò)夜,濾取上清液,真空濃縮至相對(duì)密度1.06-1.12;(2)將澄清劑加入到上述水提濃縮液中,邊加入邊攪拌,至無(wú)沉淀后靜置12小時(shí),濾取上清液,加乙醇至藥液含醇量達(dá)15-30%(V/V),過(guò)濾,棄沉淀,濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)75-85%(V/V),過(guò)濾;(3)沉淀物將上述過(guò)濾后的沉淀物抽干,加乙醇洗滌,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉;(4)濾液回收乙醇,至無(wú)醇,加水溶解,通過(guò)D型大孔吸附樹脂的柱子,先用去離子水洗脫至無(wú)色,再用濃度為15%(V/V)乙醇液洗脫至無(wú)色,繼用55%(V/V)乙醇液洗脫至無(wú)色,收取55%(V/V)乙醇液洗脫液,回收乙醇,流份濃縮至浸膏,比重為1.30-1.35,再用70-80%(V/V)乙醇溶解,過(guò)濾,抽干,真空干燥,粉碎成細(xì)粉;(5)制劑將步驟(3)和(4)所制得的細(xì)粉按質(zhì)量比1~3∶1混勻,制成細(xì)顆粒,填充膠囊即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法,其特征在于所述步驟(2)中的澄清劑為每100ml醋酸溶液含有O.l-0.8g殼聚糖,該醋酸溶液的濃度為0.5-1.5%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法,其特征在于所述步驟(4)中的D型大孔吸附樹脂的用量為步驟(1)中獼猴桃根粗粉重量的O.5-1.5倍。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法,包括取獼猴桃根粗粉,進(jìn)行三次煎煮,合并煎液,靜置過(guò)夜,濾取上清液,真空濃縮至相對(duì)密度1.06-1.12;加入澄清劑至無(wú)沉淀后,濾取上清液,加乙醇攪拌、靜置沉淀,過(guò)濾;將上述過(guò)濾后的沉淀物經(jīng)抽干、用乙醇洗滌、干燥,粉碎成細(xì)粉;將含醇濾液回收乙醇后,經(jīng)大孔吸附樹脂層析,收集,干燥,粉碎成細(xì)粉;最后將二個(gè)細(xì)粉充分混勻,制成細(xì)顆粒,填充膠囊即得。本發(fā)明的制備方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),將獼猴桃根中的有效成分精制,保留水溶性的多糖和脂溶性的甾萜及苷類;除了生產(chǎn)工藝方面的成熟,還解決了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性保障,獼猴桃膠囊可以用于防治肺癌及消化道腫瘤。文檔編號(hào)A61K125/00GK101791325SQ20101015804公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者張際忠,趙正福,黃曉東申請(qǐng)人:香港曉源藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司
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