專(zhuān)利名稱(chēng)：β-咔啉釕配合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及β-咔啉釕配合物及其制備自噬誘導(dǎo)劑作為 抗腫瘤藥物的用途。
背景技術(shù)：
1. β -咔啉釕配合物簡(jiǎn)介近年來(lái)，以具有生物活性的分子作為配體的金屬配合物的發(fā)展，為追求高效，針對(duì) 靶向活性的新藥設(shè)計(jì)提供了更為廣闊的空間。這類(lèi)配合物的研究表明，金屬的固有屬性和 生物活性配體分子的結(jié)合為克服當(dāng)前的耐藥性途徑的可能性提供了線索。β -咔啉生物堿是一類(lèi)人工合成和天然化合物，具有包括鎮(zhèn)靜，抗焦慮，催眠，抗驚 厥，抗腫瘤，抗病毒，抗寄生蟲(chóng)和抗菌等廣譜生物藥理學(xué)活性。(曹，彭等。2007年)據(jù)報(bào) 道，β-咔啉生物堿可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用的活性，如插入DNA(肖，林等。2001 年)，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II (Funayama,Nishio等。1996年)，抑制⑶K(細(xì)胞周期蛋白依 賴(lài)激酶)(李，梁等。2007年)和IkB激酶(Castro，Dang等。2003年)。合成出了一類(lèi) 以-1，-3和-9位不同亞基取代的β -咔啉為基本骨架的衍生物以闡釋這種化合物的構(gòu)效 關(guān)系(曹，彭等。2007)。由于其與苯二氮，咪唑啉，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)羥色胺受體的親和 力，β-咔啉顯示了相當(dāng)?shù)募毙远拘?，阻礙了其作為抗癌藥物的臨床應(yīng)用。(陳，趙等。2005 年)一定數(shù)量的釕化合物已被證明可以顯示出顯著的抗癌活性，兩個(gè)釕(III)配 合物已成功地進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，即NAMI-A(Alessio, Mestroni等。2004) ([ImH] Ltrans-RuCl4 (DMSO) (Im)]，其中 Im =咪唑，DMSO = 二甲基亞砜和 KP1019 (Hartinger， Jakupec 等。2008) ([IndH] [trans_RuCl4(Ind)2]，其中 Ind =吲唑)· Ru(II)。釕(II)也已 作為抗癌藥物研究物。含不穩(wěn)定集團(tuán)如Ru(II) “半三明治”芳烴復(fù)合物的化合物顯示出在 體內(nèi)和體外雙重活性(Bugarcic，Habtemariam 等。2009 年)。一些 α -[Ru(II) (azpy)2Cl2] (azpy = 2-(苯)吡啶)型復(fù)合物相對(duì)于順鉬顯示出類(lèi)似甚至更好的細(xì)胞毒性潛力(Hotze， Bacac等。2003年)。另?yè)?jù)報(bào)道，飽和配位的釕(II)多吡啶配合物[Ru (bpy)2 (dppn) ]Cl2 帶擴(kuò)展芳香配體在低濃度下針對(duì)兩株抗腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性(IC50值)。 (Schatzschneider, Niesel ο 2008)。2.自噬誘導(dǎo)劑用于治療癌癥簡(jiǎn)介自噬作用(autophagy)是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過(guò)程， 細(xì)胞內(nèi)的蛋白、細(xì)胞器和胞質(zhì)通過(guò)自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、氨基酸和脂肪酸循 環(huán)利用，合成新的大分子和ATP，從而維持細(xì)胞的正常代謝和生存。同時(shí)，在某些情況下它可 以選擇性地清除某些細(xì)胞成分，如受損或多余的過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、DNA，減少 異常蛋白、細(xì)胞器的堆積，維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)。自噬作用不僅具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn) 細(xì)胞生存的作用，過(guò)度上調(diào)的自噬作用也可以引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱(chēng)為 II型程序化細(xì)胞死亡。
自噬作用在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中都能見(jiàn)到，與人類(lèi)的多種疾病，尤其是惡性 腫瘤存在密切關(guān)系。在代謝壓力下，腫瘤細(xì)胞可以依靠自噬作用維持生存和活性。但在進(jìn) 一步研究中，卻發(fā)現(xiàn)了自噬抑制與腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性。通過(guò)對(duì)自噬作用的研究，進(jìn)一步 揭示了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在機(jī)制，為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的思路。 自噬誘導(dǎo)劑(Autophagy inducer):由于自噬作用的缺失可以造成細(xì)胞突變的累 積，形成腫瘤甚至轉(zhuǎn)移灶，藥物作用可通過(guò)促進(jìn)自噬作用，預(yù)防腫瘤的發(fā)生發(fā)展，或使腫瘤 在過(guò)度的自噬作用下發(fā)生自噬性死亡。這一設(shè)想在治療與異常蛋白積聚有關(guān)的退行性疾病 中取得了一定的效果。目前的許多化療藥物及放療都可以增加腫瘤細(xì)胞中的自噬小體數(shù) 量。它莫西芬(Tamoxifen)可以提高M(jìn)CF7乳腺癌細(xì)胞的自噬水平，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死 亡。同時(shí)，自噬也可抑制腫瘤的發(fā)生。首先，自噬可清除受損細(xì)胞器以避免有害自由基及突 變的發(fā)生，從而避免更大的損傷。然而，在人類(lèi)多種腫瘤中，自噬誘導(dǎo)基因Beclinl存在缺 失或突變，從而失去對(duì)腫瘤的抑制作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，將BECNl重新導(dǎo)人人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7中，自噬可被誘發(fā)，從而抑制細(xì)胞增殖及腫瘤形成。其次，自噬可限制DNA損傷，維持 基因組完整性。在永生化鼠腎上皮細(xì)胞中，自噬活性降低可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，基因擴(kuò)增， 染色體非整倍性等。這種基因組的不穩(wěn)定增加了致癌性突變率，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。再次， 自噬可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘發(fā)凋亡性細(xì)胞死亡。透射電鏡檢測(cè)常被認(rèn)為是檢測(cè)自噬體的金標(biāo)準(zhǔn)，在透射電鏡下可見(jiàn)損傷的細(xì)胞 器，如腫脹變性的線粒體，其周?chē)霈F(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu)，繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體，并 與溶酶體融合、消化，也可見(jiàn)自噬溶酶體內(nèi)最終不能降解的殘?bào)w等。腫瘤復(fù)發(fā)是臨床上的一個(gè)極其常見(jiàn)而又棘手的問(wèn)題。原發(fā)腫瘤被根除后，經(jīng)過(guò)長(zhǎng) 時(shí)間的“休眠期”，腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)。而且，其恢復(fù)增殖能力的過(guò)程是迅速而高效的。真正致命 的，往往并不是那些新生的原發(fā)腫瘤細(xì)胞，而是那些經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的代謝壓力后“重獲新生” 的殘余細(xì)胞。這些殘余的腫瘤細(xì)胞是如何恢復(fù)活性的，是亟需解決的問(wèn)題，也是腫瘤治療的 關(guān)鍵。而自噬作用很可能是問(wèn)題的答案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的β "咔啉釕配合物。本發(fā)明的目的之二是提供上述β "咔啉釕配合物的制備方法。本發(fā)明的目的之三是提供上述β-咔啉釕配合作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N~N)2(Nh)xClY] (A"A)Z，其中 N~N 選自 bpy 或 phen ；A~A 選自 PF6 或 SO3CF3 ；X = 1 或 2，Y = 2-Χ,Ζ = 1 或 2。一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru (Nl)2 (I-Py-β C)] (PF6)2其中Ν~Ν選自 bpy, phen 或 DIP。上述配合物作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。上述抗腫瘤藥物組合物，含有上述β -咔啉釕配合物作為有效成分以及藥學(xué)上可 接受的輔助劑。本發(fā)明在分子機(jī)理上證明了 β-咔啉釕配合物可以用于治療癌癥，且效果優(yōu)于廣 泛應(yīng)用的順鉬和在臨床試驗(yàn)中的ΝΑΜΙ-Α，β -咔啉釕配合物作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑用于治療 癌癥填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白，為開(kāi)發(fā)新一代高效的治療惡性腫瘤的藥物開(kāi)拓了新思路。


圖 1 為[Ru (bpy) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 晶體結(jié)構(gòu)圖；
圖 2 為[Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的晶體結(jié)構(gòu)圖；圖3為I-Py- β C晶體結(jié)構(gòu)圖；圖4 為[Ru (bpy) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 晶體結(jié)構(gòu)圖；圖5Α-5Ε分別為β -咔啉釕配合物(Β1-Β3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬系列實(shí)驗(yàn)附圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N~N)2(Nh)xClY](A~A)z，其中Ν~Ν選 自bpy或phen ；A~A選自PF6或SO3CF3 ；X = 1或2，Y = 2-Χ,Ζ = 1或2 ；上述配合物對(duì)應(yīng)的 陽(yáng)離子部分的分子結(jié)構(gòu)式如Α1、Α2、Α4、Α5所示 上述配合物的制備方法，將 cis-[Ru (bpy) 2C12] · 2H2O 或 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 與9H-吡啶[3，4-b] B引哚(Norharman)溶于乙醇水溶液，回流，減壓蒸發(fā)，過(guò)濾去除沒(méi)有反應(yīng) 的9H-吡啶[3，4-b] Π引哚配體，加入NH4PF6，析出產(chǎn)物后清洗然后真空干燥，純化，重結(jié)晶，得 到[Ru (bpy)2 (Nh) Cl] (PF6)或[Ru (phen)2 (Nh) Cl] (PF6)；或者，將 cis-[Ru (bpy)2Cl2] · 2H20 或 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 與與 AgSO3CF3 反應(yīng)后濾去 AgCl，加入 9H-吡啶[3，4_b]吲哚， 回流，反應(yīng)混合物冷卻至室溫后再次過(guò)濾，緩慢蒸發(fā)母液得到[Ru (bpy) 2 (Nh)2] (SO3CF3)2或 [Ru(Phen)2(Nh)2] (SO3CF3) 2，反應(yīng)式如下
一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru (Ν~Ν)2 (I-Py-β C)] (PF6)2其中Ν~Ν選自 2,2'-聯(lián)吡啶(bpy)，l，10-鄰菲羅啉(phen)或4，7-二苯基-1，10-鄰菲羅啉(DIP)；上 述配合物對(duì)應(yīng)的陽(yáng)離子部分的分子結(jié)構(gòu)式如Bi、B2、B3所示 上述配合物的制備方法，首先將吡啶-2-甲醛(pyridine-2-carboxaldehyde)和色胺投入苯甲醚加熱，力口 入鈀/碳(Pd/C)后回流，反應(yīng)混合物趁熱過(guò)濾，旋蒸至濾液呈暗綠色，用甲醇溶解，蒸發(fā)得 到 1-(2_ 吡啶)-β -咔啉(l-(2-pyridyl)-0-carboline)；然后將1-(2-批啶)-β-咔啉與 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20、 cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20 或 cis-[Ru (DIP)2Cl2] · 2H20 中的一種溶于乙醇的混合液通氬氣 回流，直至呈現(xiàn)明顯的紅色液體，趁熱過(guò)濾后真空濃縮，加入NH4PF6后混合液放入冰箱過(guò)夜 冷卻，過(guò)濾得到產(chǎn)物，用乙醇/水混合物重結(jié)晶，真空干燥，即得；反應(yīng)式如下
上述配合物作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。上述抗腫瘤藥物組合物，含有上述β -咔啉釕配合物作為有效成分以及藥學(xué)上可 接受的輔助劑。以下通過(guò)具體的例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。試齊[J:9Η- 口比唆[3, 4-b] 口引哚(Snyder, Walker et al. 1949), cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20(B. P. Sullivan 1978)，cis_[Ru(phen)2Cl2] · 2H20(B. P. Sullivan 1978), cis-[Ru(DIP)2Cl2] ·2Η20(Β. P.Sullivan 1978 ；Puckett andBarton 2008), [(Imidazole)H] [trans-RuCl4(DMSO) (Imidazole)] (NAMI-A) (Mestroni 1998)由文獻(xiàn)方法合成。1.釕(II)配合物[Ru (N~N)2(Nh)XC1Y](A~A)Z 的合成，其中 N~N 選自 bpy 或 phen ； A"A 選自 PF6 或 SO3CF3 ；X = 1 或 2，Y = 2_X，Z = 1 或 2。1. 1 [Ru (bpy) 2 (Nh) Cl] (PF6)的合成(Al)cis-[Ru (bpy)2C12] · 2H20(0. 520g, 1. Ommo 1)和 9H_ 吡啶[3,4-b]吲哚(0. 252g, 1. 5mmol)溶于50mL 1 1乙醇水溶液(ν/ν)，混合液用氬氣清洗15分鐘然后用力攪拌回 流8小時(shí)。將深紅色溶液減壓蒸發(fā)至IOmL再加入30mL水。剩余沒(méi)有反應(yīng)的9H-吡啶[3， 4-b]吲哚配體用過(guò)濾法去除。紅色溶液中加入過(guò)量的NH4PF6保證了足量的紅色析出物。產(chǎn) 物用水(20mLX2)洗后用(20mL)乙醚清洗，然后真空干燥。原產(chǎn)物用利用甲苯-乙腈(ν/ ν = 1 2)做洗脫液的氧化鋁柱層析法純化，再在丙酮-乙醚中重結(jié)晶。產(chǎn)量0.607g， 81%。C31H24ClF6N6PRu ·H2O 理論值C 47. 73%,H 3. 36%,N 10. 77%;實(shí)驗(yàn)值C 47. 62%,H 3. 35%;N 10.81%。ESI-MS(CH3OH) :C31H24ClN6Ru+[M-PF6]+m/z 理論值 617. 1，實(shí)驗(yàn)值 616. 8。1.2 [Ru (bpy) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的合成(A2)在(250mL)水甲醇中加入(0.550g，2. 2mmol) AgSO3CF3 與(0. 520g, 1. Ommol) cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 反應(yīng)獲取，過(guò)濾 AgCl 后，加入(0. 403mg，2. 4mmol) 9H-吡啶[3， 4-b]吲哚，溶液回流3天。反應(yīng)混合物冷卻至室溫后再次過(guò)濾。緩慢蒸發(fā)母液得到紅色晶體用于X射線衍射，晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示。產(chǎn)量0. 881mg, 84%。C44H32F6N8O6RuS2理論值C 50. 43%, H 3. 08%, N 10. 69% ；實(shí)驗(yàn)值C50. 37%，H 3. 09%, N 10.65%。ESI-MS(CH3OH) 理論值 C43H32F3N8O3RuS+[M-SO3CF3]+m/z 899. 1，實(shí)驗(yàn)值 898. 8，C42H32N8Ru2+[M_2S03CF3]2+m/z 理 論值 399. 1，實(shí)驗(yàn)值 399. 0。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 11. 48 (s，2H)，9. 20 (d，J = 5. 0Hz，2H)， 8. 65-8. 59(m，6H)，8. 25 (d, J = 8. 0Ηζ，2Η)，8· 19 (t, J = 7. 5Ηζ，2Η)，8· 11 (q, J = 6. OHz, 6Η)，8· 05 (t，J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 91 (t，J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 61 (d，J = 3. 5Ηζ，4Η)，7· 57 (t, J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 31-7. 28 (m，2Η) ·1· 3 [Ru (phen) 2 (Nh) Cl] (PF6)的合成(Α4) 與1. 1 例子的方法相同，使用(0. 570g，l_ol) cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20 替代 cis-[Ru(bpy)2Cl2] ·2Η20 進(jìn)行合成。產(chǎn)量0. 632g，78 %。C35H24ClF6N6PRu · H2O 理論值C 50. 76%,H 3. 16%,N 10. 15%;實(shí)驗(yàn)值C 50. 61%,H 3. 15%,N 10. 19%。ESI-MS(CH3OH) C35H24ClN6Ru+[M-PF6]+m/z 理論值 665. 1，實(shí)驗(yàn)值 664. 8。1.4 [Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的合成(A5)與1. 2 例子的方法相同，使用 cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20(0. 570g，Immo 1)， AgSO3CF3(0. 550g，2. 2mmol)禾Π 9Η-吡啶[3，4_b]吲哚(0. 403mg，2. 4mmol)來(lái)合成。產(chǎn) 量0· 872g，80 %。C48H32F6N8O6RuS2 理論值C 52.60 %，H 2. 94%, N 10.22%;實(shí)驗(yàn)值 C 52. 75%, H 2. 95%, N 10.15%。ESI-MS(CH3OH) =C47H32F3N8O3RuS+[M-SO3CF3]+m/ζ 理論值 947. 1，實(shí)驗(yàn)值 946. 8，C46H32N8Ru2+[M_2S03CF3]2+m/z 理論值 375. 1，實(shí)驗(yàn)值 375. 0。其晶體結(jié) 構(gòu)圖如圖 2 所示。1H NMR (ppm, (CD3)2SO) 11. 42(s，2H)，9· 67 (d, J = 5. OHz, 2H) ,8. 90 (d, J =8. 5Hz，2H)，8. 78(s，2H)，8. 61(d，J = 8. 5Hz，2H)，8. 34-8. 29(m，6H)，8. 26 (d, J = 6. 5Hz, 2H)，8. 21 (t，J = 9. 0Hz，4H)，8. 07 (d, J = 6. 5Hz，2H)，7. 74 (q, J = 5. 0Hz，2H)，7. 58 (t, J = 3. 5Hz，4H)，7. 28-7. 24(m，2H).2.釕(II)配合物[Ru(N"N)2(l-Py-^ C)] (PF6)2 的合成，其中 N~N 選自 bpy, phen 或DIP2. 11-(2-批啶)-β _ 咔啉(l-Py—β C)的合成將吡啶-2-carboxaldehyde(535mg, 5. OOmmo 1)和色胺(8IOmg, 5. OOmmol)投入 200mL干燥苯甲醚的混合物在105°C加熱2小時(shí)，加入10%鈀/碳(1. 20g)后回流22h。反 應(yīng)混合物趁熱過(guò)濾，旋蒸至濾液呈暗綠色，用甲醇(20mL)溶解，溶液緩慢蒸發(fā)可得到可用 于測(cè)X射線衍射的黃色晶體，晶體結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。過(guò)濾后可得純配合物(1. 05g,86% )。 (Hassani, Cai et al. 2005) 2. 2 [Ru (bpy) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(Bi) 1-(2-吡啶)-β -咔啉(0. 245g, 1. Ommol)和 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20(0. 520g， 1. Ommol)溶于75%乙醇(IOOmL)的混合液通氬氣回流8小時(shí)。呈現(xiàn)明顯的紅色液體，趁熱 過(guò)濾后真空濃縮。加入NH4PF6 (0. 244g, 1. 5mmol)后混合液放入冰箱過(guò)夜冷卻。過(guò)濾得到產(chǎn) 物，用乙醇/水混合物重結(jié)晶，真空干燥。產(chǎn)量0. 797g (84% )0室溫下用甲醇溶液緩慢蒸發(fā) 得到可用于X射線衍射的晶體，結(jié)構(gòu)圖如圖4所示。元素分析=C36H27F12N7P2Ru ·Η20理論值C 44. 73%,H 3. 02%,N 10. 14%;實(shí)驗(yàn)值C 44. 65%,H 3. 03%,N 10.17%。ESI-MS(CH3CN) C36H27F6N7PRu+[M-PF6]+m/z 理論值 804. 1，實(shí)驗(yàn)值 803. 9 ;C36H27N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理論值 329.6，實(shí)驗(yàn)值 329.8。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 12. 36 (s, 1H) ,9. 06 (d, J = 8. OHz, 1H),8.85 (q, J = 8· 5Ηζ，4Η)，8· 31(m，3H)，8. 19 (q, J = 10. 0Hz,2H) ,8. 14 (q, J = 6.5Hz，2H)， 7. 88 (d, J = 5. OHz, 1H), 7. 86 (d, J = 8. OHz, 1H), 7. 78-7. 71 (m，4H)，7. 64 (d，J = 5. 5Hz, 1H)，7. 57-7. 52 (m, 3H)，7. 48 (t，J = 6. OHz，2H)，7. 44-7. 40 (m, 2H).
2. 3 [Ru (phen) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(B2)與2. 2 合成方法相同，用 cis-[Ru(Phen)2Cl2] · 2H20(0. 570g, 1. Ommo 1)替代 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20。C40H27F12N7P2Ru · H2O 理論值:C 47. 35%, H 2. 88%, N 9. 66% ； 實(shí)驗(yàn)值C 47. 47%,H 2. 87%,N 9. 64% ESI-MS(CH3CN) C36H27F6N7PRu+[M-PFj+m/z 理論值 852. 1，實(shí)驗(yàn)值 851. 9 ；C36H27N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理論值 353. 6，實(shí)驗(yàn)值 353. 8。1H NMR (ppm, (CD3)2SO) 12. 34 (s，1H)，9. 07 (d，J = 8. 0Hz，1H)，8. 81 (q，J = 4. 0Hz,2H) ,8. 74 (t, J =
9.5Ηζ，2Η)，8· 41-8. 36(m，4H)，8· 27 (t, J = 8. 0Hz，2H)，8· 24 (d, J = 4. OHz, 1Η)，8· 18 (d, J =5. 5Hz, 1Η)，8· 13 (d, J = 4. OHz, 1Η)，7. 98 (t, J = 6. 5Ηζ，2Η)，7· 90 (q, J = 5. OHz, 1Η)， 7· 86-7. 83(m，3H)，7· 75-7. 70(m，3H)，7· 44(t，J = 6. OHz, 1Η) ,7. 48 (t, J = 6·5Ηζ，1Η)，
7.40 (d, J = 8. OHz，1Η).2. 4 [Ru (DIP) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(Β3)與2. 2 合成方法相同，用 cis-[Ru(DIP)2Cl2] · 2Η20(0. 872g, 1. Ommo 1)替代 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20。C64H43F12N7P2Ru · H2O 理論值:C 58. 27%, H 3. 44%, N 7. 43% ； 實(shí)驗(yàn)值C 58.38 %，H 3. 39 %, N 7. 37 ESI-MS(CH3CN) C64H43F6N7PRu+[M-PF6]+m/z 理 論值 1156. 2，實(shí)驗(yàn)值 1155. 9 ；C64H43N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理論值 505. 6，實(shí)驗(yàn)值 505. 8。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 12. 42 (s, 1H) ,9. 14(d,J = 8. 5Hz, 1H)，8· 36(t, J = 5. OHz, 1H)，8· 32 (d, J = 6. OHz, 1Η)，8· 30 (d, J = 6. OHz, 1Η)，8· 27 (q, J = 3. 5Ηζ，6Η)，8· 22 (d, J = 5. 5Hz, 1Η)，
8.01 (d, J = 5. OHz, 1Η)，7. 91 (d, J = 5. 5Hz, 1Η)，7. 88 (d, J = 8. 5Hz, 1Η)，7. 85 (d, J = 6. OHz, 1Η)，7· 78 (q, J = 5. 5Ηζ，2Η)，7· 74 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7· 69-7. 60 (m，22Η)，7· 56 (t, J =6. OHz, 1Η)，7. 42 (t, J = 8. OHz, 1Η) ·3.實(shí)驗(yàn)及分析3. 1 β _咔啉釕配合物腫瘤細(xì)胞抑制活性IC5tl測(cè)試使用!fepG2和HeLa兩種細(xì)胞進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制活性IC5tl的測(cè)試將細(xì)胞以約105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔接種100 μ L，置CO2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入待測(cè)樣品，每一梯度至少3個(gè)重復(fù)。對(duì)照 組加入等體積的溶解樣品用的溶劑。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入20 μ 1的MTT(5mg/mL)， 然后置于37°C溫育4小時(shí)。小心除去上清后，每孔加入100 μ 1的DMS0，振蕩約IOmin溶解 沉淀，隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，波長(zhǎng)630nm。用下式求出每一樣品濃度下的細(xì)胞存活率存活率％=樣品組平均OD值/對(duì)照組平均OD值χ100%以細(xì)胞存活率對(duì)藥物濃度作圖，按作圖法求出每個(gè)樣品細(xì)胞存活50%的值，即 IC50值(見(jiàn)表1)。表 1.
表1.使用肌1~方法檢測(cè)配合物41^2^4^5和81，82，83對(duì)兩種癌細(xì)胞株0fepG2 和HeLa)的IC5tl值，并用臨床廣泛應(yīng)用的順鉬(cisplatin)作為對(duì)照。從表格數(shù)據(jù)中可以 看到在進(jìn)行配合物合成后使得合成產(chǎn)物的IC5tl值明顯下降，使其具有更高的抗癌活性，其 中A2，A4，A5和B3更是優(yōu)于現(xiàn)在臨床廣泛應(yīng)用的順鉬，極具開(kāi)發(fā)潛力。3. 2 β -咔啉釕配合物(Β1-Β3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬系列實(shí)驗(yàn)3. 2. 1透射電子顯微鏡(TEM)HeLa細(xì)胞(5 X IO5) 37°C時(shí)處理24h。細(xì)胞洗兩次后用2% 4°C的戊二醛固定1小時(shí)， 再用2%的四氧化鋨固定。細(xì)胞用50%，70%，80%，90%和100%乙醇連續(xù)清洗脫水，然后 嵌入Spurrs樹(shù)脂。獲得超薄切片，安裝進(jìn)銅網(wǎng)，用醋酸鈾和檸檬酸鉛復(fù)染，使用JEM-100CX 透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。使用Eversmart Jazz程序(Scitex)進(jìn)行圖像掃描和拍攝。如圖5A所示，TEM圖像顯示配合物處理24小時(shí)后HeLa細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。a :100μΜ 配合物1處理后的HeLa細(xì)胞。b :50 μ M配合物2處理的HeLa細(xì)胞。c :2. 5 μ M配合物3處 理的HeLa細(xì)胞。在a，b，c中可以觀察到大量的自噬空泡。Insert 高倍率的典型的自噬 空泡。比例尺(a-c) 5 μ m，(放大圖)1 μ m。3. 2. 2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照jetPEI 轉(zhuǎn)染試劑制造商的說(shuō)明(Q-biogen，法國(guó))將綠色熒光蛋白標(biāo)記的 LC3 (GFP-LC3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞(GFP-LC3，由中華人民共和國(guó)廣州中山大學(xué)陳忠平教 授提供)。每24孔板轉(zhuǎn)染1 μ gGFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)20小時(shí)，用配合物1_3處理細(xì)胞， 使用熒光顯微鏡(Axio Observer ZLCarl Zeiss，德國(guó))檢測(cè)GFP-LC3的熒光以及計(jì)算空 泡(自噬體)中GFP-LC3的蛋白率。如圖5B所示，GFP-LC3的細(xì)胞定位檢測(cè)Ru(II)配合物1_3誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的能力。將HeLa細(xì)胞鋪在蓋玻片上生長(zhǎng)至70%，然后轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，細(xì)胞用相應(yīng)濃度的配合物 1-3處理，使用多聚甲醛固定，然后用顯微鏡觀察。Ru(II)處理后，細(xì)胞中GFP-LC3出現(xiàn)點(diǎn) 狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明了自噬體相關(guān)的自噬標(biāo)志分子LC3-II出現(xiàn)。3. 2. 3自噬泡(AVO)的丫啶橙(AO)定量染色HeLa細(xì)胞加入或不加入配合物1_3培養(yǎng)24小時(shí)。為了用于顯微鏡研究，用PBS 洗兩次貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用含培養(yǎng)基的1 μ g/mL丫啶橙(AO)染色，使用熒光顯微鏡(Axio Observer Zl, Carl Zeiss，德國(guó))立即使用490nm帶藍(lán)色濾光器激發(fā)波長(zhǎng)和515nm長(zhǎng)通障 礙濾光器檢測(cè)。為用于流式細(xì)胞儀研究，將細(xì)胞從60mm毫米皿(Corning)上刮下，用胰蛋白 酶-EDTA和用PBS洗兩次。用丫啶橙(AO)染色15分鐘后，收集細(xì)胞至苯酚無(wú)紅色生長(zhǎng)培 養(yǎng)基。使用488nm藍(lán)色光波長(zhǎng)激發(fā)10000個(gè)細(xì)胞的綠色(510-530nm)和紅色(650nm)的熒 光發(fā)射由FACSCalibur (Becton Dickinson)的CellQuest軟件進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。如圖5C所示，在12小時(shí)計(jì)數(shù)自噬體的形成，數(shù)據(jù)為GFP-LC3-轉(zhuǎn)染的含點(diǎn)狀熒光細(xì)胞的比率。計(jì)數(shù)至少300個(gè)GFP-LC3-轉(zhuǎn)染細(xì)胞，0. 1 % DMSO作為對(duì)照也包含在內(nèi)。如圖5D所示，丫啶橙(AO)染色的HeLa細(xì)胞12小時(shí)處理后用熒光顯微鏡進(jìn)行 檢測(cè)。大型橙色染色為AVOs (自噬體的標(biāo)記)。在沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AVOs。a， control ；b, 100 μ M配合物1_處理細(xì)胞；c，50 μ M配合物2-處理細(xì)胞；d，2. 5 μ M配合物 3-處理細(xì)胞。比例尺1μπι。如圖5Ε所示，使用FACS掃描定量AO染色的AVOs。細(xì)胞用配合物處理后12小時(shí) 進(jìn)行AO體外活體染色。a，control ；b, 100 μ M配合物1_處理細(xì)胞；c，50 μ M配合物2-處 理細(xì)胞；d，2. 5μ M配合物3-處理細(xì)胞。顯示經(jīng)過(guò)Ru(II)配合物1_3處理，處理后的細(xì)胞 的AVO數(shù)量大幅增加。結(jié)論在分子機(jī)理上證明了 β-咔啉釕配合物可以用于治療癌癥，且效果優(yōu)于廣 泛應(yīng)用的傳統(tǒng)金屬配合物順鉬和在臨床試驗(yàn)中的釕系配合物ΝΑΜΙ-Α，其中系列B可以作為 細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑用于治療癌癥，填補(bǔ)了化合物作為自噬誘導(dǎo)劑治療癌癥的空白。
權(quán)利要求
β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N^N)2(Nh)XClY](A^A)Z，其中N^N選自bpy或phen；A^A選自PF6或SO3CF3；X＝1或2，Y＝2-X，Z＝1或2；上述配合物對(duì)應(yīng)的陽(yáng)離子部分的分子結(jié)構(gòu)式如A1、A2、A4、A5所示FSA00000129175200011.tif
2.權(quán)利要求1所述配合物的制備方法，其特征在于將 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20 或 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20 與 9H-吡啶[3，4_b]吲哚 溶于乙醇水溶液，回流，減壓蒸發(fā)，過(guò)濾去除沒(méi)有反應(yīng)的9H-吡啶[3，4-b]吲哚配體，力口 入NH4PF6，析出產(chǎn)物后清洗然后真空干燥，純化，重結(jié)晶，得到[Ru(bpy)2(Nh)Cl] (PF6)或 [Ru(phen)2(Nh)Cl] (PF6)；或者，將 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 或 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 與與 AgSO3CF3 反應(yīng)后 濾去AgCl，加入9H-吡啶[3，4-b]吲哚，回流，反應(yīng)混合物冷卻至室溫后再次過(guò)濾，緩慢蒸發(fā) 母液得到[Ru (bpy)2 (Nh)2] (SO3CF3)2 或[Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3)2 ； 反應(yīng)式如下
3.權(quán)利要求1所述配合物作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤藥物，含有權(quán)利要求1所述β-咔啉釕配合物作為有 效成分以及藥學(xué)上可接受的輔助劑。
5.β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N~N)2(l-Py-i3C)] (PF6)2其中Ν~Ν選自bpy，phen 或DIP ；上述配合物對(duì)應(yīng)的陽(yáng)離子部分的分子結(jié)構(gòu)式如Bi、B2、B3所示
6.權(quán)利要求5所述配合物的制備方法，其特征在于首先將吡啶-2-甲醛和色胺投入苯甲醚加熱，加入鈀/碳后回流，反應(yīng)混合物趁熱過(guò) 濾，旋蒸至濾液呈暗綠色，用甲醇溶解，蒸發(fā)得到1- (2-吡啶)-β -咔啉；然后將 1-(2-批啶)-β _ 咔啉與 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20、cis-[Ru(phen)2C12] · 2H20 或cis-[Ru (DIP)2Cl2] · 2H20中的一種溶于乙醇的混合液通氬氣回流，直至呈現(xiàn)明顯的紅色 液體，趁熱過(guò)濾后真空濃縮，加入NH4PF6后混合液放入冰箱過(guò)夜冷卻，過(guò)濾得到產(chǎn)物，用乙 醇/水混合物重結(jié)晶，真空干燥，即得；反應(yīng)式如下
7.權(quán)利要求5所述配合物作為制備細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5所述配合物作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗腫瘤藥物，含有權(quán)利要求5所述β-咔啉釕配合物作為有 效成分以及藥學(xué)上可接受的輔助劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N^N)2(Nh)XClY](A^A)z，其中N^N選自bpy或phen；A^A選自PF6或SO3CF3；X＝1或2，Y＝2-X，Z＝1或2；或者，其分子式為[Ru(N^N)2(1-Py-βC)](PF6)2其中N^N選自bpy，phen或DIP。本發(fā)明在分子機(jī)理上證明了上述β-咔啉釕配合物可以用于治療癌癥，且效果優(yōu)于廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)金屬配合物順鉑和在臨床試驗(yàn)中的釕系配合物NAMI-A，β-咔啉釕配合物作為細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑用于治療癌癥填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白，為開(kāi)發(fā)新一代高效的治療惡性腫瘤的藥物開(kāi)拓了新思路。
文檔編號(hào)A61K31/4745GK101845060SQ201010173100
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者吳壽海, 彭文烈, 徐安龍, 朱一平, 王旻谞, 譚彩萍, 賴(lài)森森, 連武 申請(qǐng)人:中山大學(xué)