專利名稱：人源抗狂犬病毒Fab抗體及其與納米粒子交聯(lián)的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種納米粒子交聯(lián)的人源抗狂犬病病毒Fab 抗體的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的一種人獸共患自然疫源性疫病。人 和動(dòng)物一旦發(fā)病死亡率高達(dá)100%。全球每年約有55，000人死于狂犬病，主要集中在亞非 拉發(fā)展中國家。人類患者多因病畜咬傷而感染，出現(xiàn)以恐水、畏光、吞咽困難、狂躁等為主要 特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病。該病流行廣、宿主多，幾乎所有溫血?jiǎng)游锒寄鼙桓腥荆愿?種哺乳動(dòng)物為主要宿主，是一種危害非常嚴(yán)重的人畜共患急性傳染病，是迄今為止人類病 死率最高的急性傳染病，也是人類尚未能有效控制的疫病之一，因此研制狂犬病的防治藥 品相當(dāng)重要。1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以來，鼠源性單克隆抗體 作為第二代抗體，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。抗狂犬病病毒單克隆抗體(MAbs) 的研制為解決這一問題提供了新的思路。但是鼠源單克隆抗體對(duì)人體有免疫原性，易產(chǎn)生 人抗鼠抗體反應(yīng)(human anti-mouse antibody，HAMA)，可誘發(fā)過敏反應(yīng)，且不能有效激活 人體的生物效應(yīng)功能，半衰期較短，影響單克隆抗體的治療效果，其自身局限性極大地限制 了作為預(yù)防制劑在人體內(nèi)的應(yīng)用。80年代中期以來出現(xiàn)了第三代抗體_基因工程抗體，包括利用DNA重組技術(shù)對(duì)已 有的鼠源性單抗進(jìn)行“人源化”和“小型化”改造，以及利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選、克隆新 型單克隆抗體。1991年Winter等創(chuàng)立噬菌體抗體庫技術(shù)，以大腸桿菌為宿主菌，絲狀噬菌 體為表達(dá)和展示載體，使抗體及編碼抗體的DNA，共同存在于宿主菌中。應(yīng)用該技術(shù)，不需經(jīng) 細(xì)胞融合，甚至不需要進(jìn)行免疫，即可制備全人源、高特異性的抗體，可直接應(yīng)用于體內(nèi)治 療，減少毒副作用的發(fā)生。噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展依賴以下三項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展(1)PCR技術(shù)的發(fā)展，使人們 可以用一組引物克隆出免疫球蛋白的全套可變區(qū)基因，特別是RT-PCR的出現(xiàn)，使克隆出具 有轉(zhuǎn)錄活性的可變區(qū)基因變得簡捷、有效；(2)大腸桿菌分泌有結(jié)合能力的免疫球蛋白分 子片段獲得成功，抗體分子的抗原結(jié)合部位由輕鏈和重鏈的可變區(qū)組成，依賴于復(fù)雜的立 體構(gòu)象，一般淋巴細(xì)胞內(nèi)這一立體構(gòu)象主要是在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成，而大腸桿菌的周質(zhì)腔可 提供類似粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的環(huán)境，可變區(qū)分子在細(xì)菌信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到周質(zhì)腔，進(jìn)行立體 折疊、二硫鍵形成和肽鏈的雙體化，最終形成具有抗原結(jié)合活性的抗體分子片段，這使在原 核細(xì)胞中表達(dá)抗體庫篩選特異性抗體成為可能；(3)噬菌體展示技術(shù)的建立，即肽鏈與噬 菌體外殼蛋白(蛋白III或蛋白VIII)融合表達(dá)在噬菌體的表面，通過“吸附-洗脫-擴(kuò) 增”，可篩選到靶分子的配體肽鏈，尤其是噬菌體隨機(jī)展示文庫技術(shù)的建立和發(fā)展，促使了 噬菌體抗體庫技術(shù)的產(chǎn)生。
在抗狂犬病被動(dòng)免疫制劑研究領(lǐng)域，科學(xué)家進(jìn)行了多年探索，值得關(guān)注的是 (1) 1989年Schumacher等制備了多株針對(duì)RV糖蛋白、核蛋白的鼠源單克隆抗體，但因來源 于鼠，難以應(yīng)用于臨床；(2)2001年，Ray K等成功利用噬菌體抗體庫篩選出具有中和活性 的抗狂犬病病毒糖蛋白的單鏈抗體；(3) 2004年，閉蘭等從半合成噬菌體抗體庫篩選出狂 犬病病毒G蛋白的人單鏈抗體A12，具有完全中和病毒能力；(4) Bakke等研究小組，先是通 過體外和體內(nèi)中和效價(jià)試驗(yàn)的等鑒定出一株高中和活性、高親和性并且對(duì)各型毒株均有作 用和逃逸突變體的CR57，又通過噬菌體展示技術(shù)篩選到一株抗體，然后直接混合使用這兩 株MAbs，并同HRIG進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果表明，MAbs與HRIG在暴露后預(yù)防中的作用相仿，且 與多株狂犬病毒有良好的交叉反應(yīng)性，證明了重組人源化抗狂犬病毒單克隆抗體的實(shí)際可 用性；(5)TadasUkeAnd0等也報(bào)道了從Fab噬菌體抗體庫中篩選到兩株具有中和活性的抗 體EP5G3和GD2D12,并用RFFIT法對(duì)抗體的中和活性鑒定；(6) 2009年Houimel M等也報(bào) 道了從重組免疫抗體庫中篩選到三株Fab抗體。以上報(bào)道的人源化或全人源抗體取得了突 破性成就，對(duì)將來替代血源性RIG奠定了良好的基礎(chǔ)，但是上述制備的抗體僅通過RFFIT法 或FAVN法證明具有中和活性，未在動(dòng)物模型上進(jìn)行進(jìn)一步研究；或雖經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但需要 開發(fā)成可應(yīng)用于臨床使用的藥物還需要很多工作要開展。近年來，將小分子藥物接入大分子載體，特別是納米級(jí)聚合物粒子，制成納米分子 前藥，具有小尺寸效應(yīng)、表面、界面效應(yīng)、靶向作用及緩釋作用等優(yōu)勢(shì)，不僅可以提高藥效， 還可以減輕不良反應(yīng)，這就為生物制藥研究提供了一個(gè)新的研究途徑。利用納米微粒制成 特殊藥物或新型抗體，可方便地實(shí)現(xiàn)抗原或抗體分子的固定化進(jìn)行局部定向治療等，目前 較廣泛應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)、靶向治療等方面。申請(qǐng)人檢索了國內(nèi)外文獻(xiàn)，目前尚未見納米化抗 體在狂犬病暴露后預(yù)防領(lǐng)域的發(fā)明專利或研究的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明針對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)空白，提供一種人源抗狂犬病毒Fab抗體及其 與納米粒子交聯(lián)的方法和在制備治療動(dòng)物及人狂犬病暴露后藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案人源抗狂犬病毒Fab抗體，所述抗體的VH鏈具有SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列，并且所述抗體的\鏈具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。上述的人源抗狂犬病毒Fab抗體，所述抗體的VH鏈具有SEQ ID NO. 2所示的核苷 酸序列。上述的人源抗狂犬病毒Fab抗體，所述抗體的八鏈具有SEQ ID N0.4所示的核苷 酸序列。上述抗狂犬病毒Fab抗體在制備動(dòng)物及人狂犬病暴露后治療藥物中的應(yīng)用。人源抗狂犬病毒Fab抗體與納米粒子交聯(lián)的方法，制備步驟為鈣納米粒子的制 備12. 5mmol/L CaCl2、12. 5mmol/LNaH2P04和15. 6mmol/L枸櫞酸鈉等體積混合，室溫磁力 攪拌20-48h ；超聲儀內(nèi)超聲處理l_3h ；在4°C條件下10，OOOrpm離心15min ；超聲沉淀用 PBS懸浮得鈣納米粒子懸浮液；納米交聯(lián)純化的Fab抗體加入上述懸浮液，所述抗體在懸 浮液中的濃度為45mg/L ；4°C條件下，磁力攪拌5-10h ；在4°C條件下10，OOOrpm離心15min ； 離心沉淀用雙蒸水懸浮即為所交聯(lián)的人源抗狂犬病毒Fab抗體鈣納米粒子。上述制備得到的納米粒子交聯(lián)抗狂犬病毒Fab抗體在制備動(dòng)物及人狂犬病暴露后治療藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明通過噬菌體抗體展示技術(shù)篩選出一株高親和力的針對(duì)狂犬病病 毒糖蛋白的人源抗狂犬病毒抗體Fab，該抗體通過間接酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡、間接免 疫熒光、免疫共沉淀及質(zhì)譜等對(duì)抗體和抗原反應(yīng)的特異性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明Fab抗體能 夠與狂犬病病毒結(jié)合；質(zhì)譜分析表明其結(jié)合的蛋白為是狂犬病病毒糖蛋白。本發(fā)明制備磷酸鈣納米粒子，并對(duì)納米粒子進(jìn)行表征；磷酸鈣納米粒子與上述 制備的Fab抗體進(jìn)行交聯(lián)，獲得納米化抗體Fab-CPNPs。結(jié)果表明，納米粒子平均直徑為 260nm,與Fab抗體交聯(lián)率獲得的納米化抗體Fab-CPNPs的交聯(lián)率為55%。Fab抗體及其 納米化抗體Fab-CPNPs通過快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)和熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN) 對(duì)抗體中和活性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明RFFIT和FAVN法測(cè)得Fab抗體的中和效價(jià)分別為 200. llIU/mg和177. 7IU/mg ；將該抗體制備成納米化抗體Fab-CPNPs后，用RFFIT和FAVN 法測(cè)得中和效價(jià)分別為246. 12IU/mg和307. 7IU/mg，其中和活力得到進(jìn)一步提高。本發(fā)明制備的抗狂犬病病毒的Fab抗體及其納米化抗體Fab-CPNPs通過狂犬病 病毒標(biāo)準(zhǔn)攻毒株CVS-24攻擊昆明鼠，同時(shí)給予疫苗聯(lián)合不同劑量的Fab抗體或納米化 Fab-CPNPs抗體對(duì)小鼠進(jìn)行暴露后預(yù)防實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明僅給予疫苗預(yù)防，不能提供足夠的 保護(hù)；不同劑量的Fab、Fab-CPNPs對(duì)狂犬病暴露后的小鼠具有一定的保護(hù)作用；且8IU/kg 的Fab-CPNPs或40IU/kg的Fab提供的保護(hù)作用與WHO推薦的20IU/kg的HRIG存活率相 當(dāng)(62. 5% )；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，40IU/kg 的 Fab 組、32IU/kg 及 40IU/kg 的 Fab-CPNPs 組的 存活率顯著高于對(duì)照組(P < 0. 05)；而lmg/kg的Fab與lmg/kg的Fab-CPNPs注射劑量， 注射未攻毒昆明鼠組的存活率為100%，該結(jié)果表明抗體Fab或Fab-CPNPs是安全的。制備 的納米化抗體在狂犬病暴露后治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。
四

圖lFab抗體基因的三輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析，泳道1為VH ；泳道2為V k ；泳道3為 VA ；泳道4為CH1 ；泳道5為CK ；泳道6為CA ；泳道7為Fd ；泳道8為LK ；泳道9為LA ；泳 道10為Fab。圖2phage_ELISA測(cè)定噬菌體抗體，22株抗體陽性。圖 3SDS-PAGE (A 圖)及 Western-blot (B 圖)分析純化的 Fab 抗體。圖4ELISA鑒定Fab與狂犬病病毒CTN株蛋白結(jié)合情況。圖5Fab的Western blot分析，泳道1為BHK-21細(xì)胞裂解物與Fab不能結(jié)合，泳 道2為CTN株狂犬病病毒粒子與Fab結(jié)合情況。圖6Fab結(jié)合蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜。圖7Fab的間接免疫熒光檢測(cè)，F(xiàn)ab能夠與感染病毒的BHK-21細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)熒光 (左)，而不能與未感染的BHK-21細(xì)胞結(jié)合(右)。
五具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，并不 構(gòu)成對(duì)權(quán)利要求范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的其他替代手段，均在本發(fā)明權(quán)利 要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1 一 .全人源抗狂犬病病毒Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建1.人源Fab基因的擴(kuò)增取45位狂犬病疫苗免疫健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用人源抗體的特異性引物(參照 Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K.Scott, Gregg J. Silverman. Phage display :A laboratory manual, lrd ed. New York Gold spring harbor laboratorypress，2004)擴(kuò)增 VH、VK、VA 基因，同時(shí)以質(zhì)粒 pComb3XTT 擴(kuò)增CH1、CK，以pComb3X入為模板擴(kuò)增CA ；再經(jīng)過三次重疊PCR制備Fab基因片斷；上述 PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，經(jīng)過凝膠回收試劑盒純化后，獲得約為1600bp Fab 片段，見圖1。2.抗狂犬病病毒噬菌體抗體庫的建立將Fab片斷與pComb3XSS經(jīng)Sfi I酶切、純化并連接。連接產(chǎn)物通過10次電轉(zhuǎn)化 導(dǎo)入宿主菌Ecoli.XLl-Blue，加入輔助噬菌體VCSM13過夜培養(yǎng)后，上清經(jīng)PEG8000/NaCl沉 淀，制備抗狂犬病病毒Fab噬菌體抗體庫。經(jīng)計(jì)算，所構(gòu)建的全人源抗狂犬病Fab噬菌體抗 體庫的庫容為約6.7X108。二.噬菌體抗體庫的特異性富集篩選1.用于抗體庫富集篩選的狂犬病病毒的制備采用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒(純度99%以上，武漢病毒所張愛華惠 贈(zèng))及其糖蛋白。2.噬菌體抗體庫的特異性富集篩選用滅活的狂犬病病毒CTN株病毒粒子(5 u g/mL) 50 u L/孔，封閉處理后加入新鮮 的噬菌體抗體庫，每孔100 u L，37°C濕盒孵育lh ；PBST緩沖液洗滌96孔板(第一輪洗滌10 次，以后每輪洗滌20次)，以去除未結(jié)合的噬菌體抗體；100 u L/孔甘氨酸-鹽酸溶液(pH 2.2)洗脫lOmin，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體抗體，加入50i!LlmOl/L Tris中和，使其保持 在pH 7.0左右；450iiL洗脫液感染及4mL對(duì)數(shù)生長期E. coli XLl_Blue混合，37°C水浴 30min ；力口 4mL SBU. 6u L Amp 于菌液中，37°C振搖 lh ；力口 2. 4ii L Amp 于菌液中，37°C振搖 lh ；力卩 lmL VCSM13、91mL SB 溶液、46yL Amp 于菌液中，37°C振搖 3h ；加 50 ii L KanUOOu L IPTG于菌液中，37°C振搖過夜；次日3，000g，4°C離心15min，轉(zhuǎn)移上清至清潔無菌的錐形瓶 中，加50mLPEG/NaCl，冰上放置lh ；4°C、15000g離心15min，棄上清，控干離心管，以2mL含 1%BSA重懸沉淀，將重懸液轉(zhuǎn)移至2mL EP管中，最高速度離心5min，轉(zhuǎn)移上清至1. 5mL Ep 管中；重復(fù)以上篩選步驟，共進(jìn)行五輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選。以純化的狂犬病病毒粒子包被ELISA板，對(duì)所制備的抗狂犬病病毒Fab抗體庫進(jìn) 行親和篩選。經(jīng)過5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集篩選過程，噬菌體抗體收獲率提高了 6. 03X 102 倍。3. phage ELISA 檢測(cè)將最后一輪篩選得到的洗脫液感染E.coli XLl-Blue感受態(tài)細(xì)菌后鋪于LB培養(yǎng) 板上(含終濃度100 U g/mL Amp)，37°C培養(yǎng)過夜；次日在60管試管中加入SB培養(yǎng)基2mL (含 終濃度100 u g/mLAmp+1 %葡萄糖)，從LB培養(yǎng)板隨機(jī)挑取60個(gè)菌落分別接種于試管中， 250rpm，37°C振搖8h ；每管再加終濃度為1 X 109pfu輔助噬菌體VCSM13超感染，250rpm，37°C振搖培養(yǎng)2h ；每管加終濃度為ImM IPTG和70 y g/mL Kan，250rpm，37°C振搖培養(yǎng)過夜； 次日將60管試管中培養(yǎng)液取lmL加入60管Ep管中，10000g、4°C離心lOmin，取上清進(jìn)行 ELISA檢測(cè)；以狂犬病病毒蛋白包板，phage上清為一抗，HRP-Anti_M13為二抗，以PBS溶液 做為空白對(duì)照，取其陽性。從5次篩選后得到的細(xì)菌集落中隨機(jī)挑選60個(gè)克隆，擴(kuò)增培養(yǎng) 后培養(yǎng)上清加入包被狂犬病病毒粒子的ELISA板孔中，再加入抗phage抗體，顯色。結(jié)果表 明，在隨機(jī)挑選的60個(gè)克隆中，有22株克隆與狂犬病病毒粒子結(jié)合，見圖2。4. Fab抗體基因的序列分析將上述鑒定正確的菌株測(cè)序作進(jìn)一步比對(duì)分析和驗(yàn)證。上述陽性克隆經(jīng)測(cè)序分 析，獲得4株序列不同的Fab抗體，分別命名為Fab092、Fab093、Fab094、Fab095。并經(jīng)中和 試驗(yàn)測(cè)定，F(xiàn)ab094具有中和活性(下述，以下稱Fab抗體)，對(duì)其作進(jìn)一步深入研究。三.Fab抗體的可溶性表達(dá)及純化1. Fab抗體的可溶性表達(dá)將噬菌體克隆轉(zhuǎn)化入E. coli TOPI OF' 200 u L,加入SB培養(yǎng)基20mL，1 : 100接 種，37°C振搖培養(yǎng)過夜；將lOmL過夜菌液加至lOOOmL SB培養(yǎng)基，1 100轉(zhuǎn)接E. coli T0P1 OF'，37°C振搖培養(yǎng)至OD600約為1. 0 ；加入終濃度為0. lmmol/L的IPTG，250rpm,對(duì)Fab 我們分別采用了 37°C、30°C、25°C、20°C振搖培養(yǎng)16h ；12, 000rpm、4°C離心lOmin，取培養(yǎng)上 清備用。離心沉淀用50mL PBS懸??；將上述重新懸浮的溶液，超聲裂解后，再次12，OOOrpm、 4°C離心lOmin ；離心上清用0. 22 P m無菌微孔濾器過濾除菌。對(duì)Fab我們分別采用了 37°C、 30°C、25°C、2(TC進(jìn)行了表達(dá)，SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果表明，25°C該抗體在裂解上清 及培養(yǎng)基中表達(dá)。2.抗體的純化用上樣緩沖液平衡Protein L親和層析柱；將無菌超聲上清加入Protein L親和 層析柱；上樣后，用緩沖液再次平衡Protein L親和層析柱；用洗脫緩沖液洗脫結(jié)合的蛋 白，收集蛋白峰，并用PH 9. OTris-HCl中和洗脫溶液至中性；將上述洗脫液用lOKDa的超濾 管進(jìn)行濃縮，并用PBS置換洗脫緩沖液，SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果表明，25°C該抗體上 清在26kD和30kD左右有二條目的條帶，確定抗體有可溶性表達(dá)，，同時(shí)，Western blot結(jié) 果還證實(shí)，在細(xì)菌培養(yǎng)上清中也有蛋白表達(dá)，見圖3。四.Fab抗體的鑒定1.間接 ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5 u g/mL的濃度100 u L/孔包被ELISA板， 37°C濕盒作用2. 5h ；PBST洗3次，5min/次；拍干；用含5%脫脂乳的PBS封閉，37°C濕盒作 用2. 5h或37°C過夜；PBST洗3次，5min次，拍干；加入制備的純化抗體Fab，同時(shí)設(shè)免疫志 愿者血清及正常未免疫血清為陽性和陰性對(duì)照，37°C濕盒作用90min ；PBST洗3次，5min/ 次，拍干；加入1 2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人抗體(Fab特異性)，37°C濕盒作用90min， 以TMB顯色，設(shè)免疫志愿者血清及正常未免疫血清為陽性和陰性對(duì)照。以P/N彡2. 1為陽 性判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，F(xiàn)ab及志愿者血清能夠與狂犬病病毒結(jié)合，而未免疫血清并不能與 病毒結(jié)合，見圖4。2.免疫印跡 以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、BHK-21細(xì)胞裂解物為電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE ；按常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)印于NC膜上；取出硝酸纖維素膜，作好標(biāo)記，放入平皿中， 用PBST (含5%脫脂奶粉)室溫封閉過夜；PBST洗3次，5min/次；加入制備的純化抗體Fab， 37°C濕盒作用90min ；PBST洗3次，5min/次；加入1 2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人抗體 (Fab特異性)，37°C濕盒作用90min ；PBST洗3次，5min/次；加入DAB顯色，待出現(xiàn)條帶后 雙蒸水終止反應(yīng)。結(jié)果表明，F(xiàn)ab能與狂犬病病毒結(jié)合(67KDa)，而不能與BHK-21細(xì)胞裂解 物結(jié)合，見圖3-2。結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)ab能夠與狂犬病病毒粒子中的67KD的蛋白相結(jié)合，而不能 與培養(yǎng)該病毒的BHK-21細(xì)胞蛋白結(jié)合，見圖5。3.免疫共沉淀取 150iiL rProteinG-Resin，6000rpm 離心 5min，棄上清加入 150ii L PBS 重懸；用 PBS 洗 2 次，后用 90 ii L PBS 重懸 rProteinG-Resin，加入 20 ii L Fab (lmg/mL)，4°C搖動(dòng) 2h ； 用PBS洗Beads兩次，加純化的狂犬病病毒粒子20iiL(lmg/mL) ；4°C振搖過夜；將病毒-抗 體-rProteinG-Resin復(fù)合物，4°C，3000rpm離心5min，棄上清；用PBS重懸沉淀，4°C搖動(dòng) 20min, 4°C、3000rpm離心5min，棄上清。重復(fù)用PBS再洗次，最后一次棄PBS，保留沉淀；加 入30ii L的1XSDS加樣緩沖液到上一步驟的沉淀中，煮沸5min，4°C、6000rpm離心5min ； 取上一步驟離心所得上清，進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，一抗為商品化的鼠抗糖蛋白單克 隆抗體MAb C86307M(Meridian life science，US)，二抗為 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，Western Blotting方法見前。4.質(zhì)譜分析免疫共沉淀中與Fab相結(jié)合的目的條帶對(duì)應(yīng)的在SDS-PAGE凝膠上的條帶摳出 進(jìn)行質(zhì)譜分析。將凝膠片溶解在0. 三氟乙酸(TFA)中，脫鹽，用ZipTips濃縮。蛋 白溶液(0. 5 u L)與 0. 5 li L 白勺基石出液(5mg/mL a -cyano-4-hydroxycinnamic acid in 30% acetonitrile/0. 1 % TFA)混合，點(diǎn)樣，自然干燥。樣品進(jìn)行了質(zhì)譜分析(Bruker Daltonics, Leipzig, Germany)。在 MASCOT 數(shù)據(jù)庫中搜索目的蛋白(http://www. matrix science, com ；Matrix Science，UK)。質(zhì)譜分析顯示，該抗體結(jié)合蛋白為狂犬病病毒糖蛋白， 見圖6。5.間接免疫熒光檢測(cè)將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，使細(xì)胞附著板底上；24h后用Flury (軍事醫(yī)學(xué) 科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員提供)感染上述BHK-21細(xì)胞；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔， 即不感染病毒；感染72h后PBS清洗3次，分別加入經(jīng)100倍稀釋的Fab ；室溫孵育2h，用 PBST (含0. 05%Tween 20的PBS)洗滌3次；加入FITC標(biāo)記的抗人的二抗(1 100稀釋)， 室溫孵育 lh ；再用 PBST 洗滌 3 次，用 H0ECHST 33342(1 10000, Do jindo, Japan)染核；用 熒光顯微鏡在400倍放大倍數(shù)下觀察，細(xì)胞顯示強(qiáng)綠色熒光的判為陽性。結(jié)果顯色狂犬病 病毒感染的細(xì)胞孔出現(xiàn)綠色熒光，而未被病毒感染的細(xì)胞孔沒有出現(xiàn)綠色熒光，見圖7。五.納米化Fab-CPNPs抗體的制備1.鈣納米粒子的制備160mg CaCl2、160mg NaH2P04和160mg枸櫞酸鈉加入180mL雙蒸水中，室溫磁力攪 拌48h ；超聲儀內(nèi)超聲處理lh ；在4°C條件下10，OOOrpm離心15min ；超聲沉淀用PBS懸浮。2.納米粒子的表征用透射電鏡觀察鈣納米粒子形態(tài)、直徑。粒徑分析儀檢測(cè)鈣納米粒子直徑分布。結(jié)果35 %鈣納米粒子直徑在220nm以內(nèi)，85 %直徑在440nm以內(nèi)，99 %直徑在900nm以內(nèi)，長 徑290nm，寬徑240nm，平均直徑為260nm。3.納米化Fab-CPNPs抗體的制備將9mg純化的Fab抗體加入上述懸液；4°C條件下，磁力攪拌8h，使納米粒子與抗 體分子充分結(jié)合；在4°C條件下10，000rpm離心15min ；取離心上清，測(cè)量蛋白濃度，計(jì)算上 清中總蛋白質(zhì)量；離心沉淀用雙蒸水懸浮；即為所交聯(lián)的Fab鈣納米粒子(Fab-CPNPs)。4. Fab-CPNPs的包裝率的計(jì)算用以下公式計(jì)算Fab-鈣納米粒子(Fab-CPNPs)結(jié)合率結(jié)合率(％)=(總Fab的質(zhì)量-離心上清中Fab的質(zhì)量)/總Fab的質(zhì)量X 100%。 經(jīng)計(jì)算鈣納米粒子的荷載抗體的荷載率為55%。六.Fab及Fab-CPNPs體外中和活性分析1.快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)抗狂犬病血清標(biāo)準(zhǔn)品將國家抗狂犬病血清標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成效價(jià)為2. OIU/mL ；病毒的準(zhǔn)備BSR細(xì)胞用胰酶消化，每2 3d傳代一次；將該細(xì)胞稀釋成約3X106 于3mL含3%牛血清的DMEM液中。加IX 106感染單位的CVS-11狂犬病毒于上述3mL的 細(xì)胞懸液中，混勻，37°C吸附15min，期間振搖細(xì)胞懸液一次，使其充分吸附。補(bǔ)加lOmLDMEM 培養(yǎng)液并接種培養(yǎng)瓶，待100%細(xì)胞感染后24h收獲上清。收獲的上清以5000r/min離心 lOmin，分裝成每個(gè)小試管0. 5mL。凍存于_70°C備用；病毒的滴定取一管在-70°C凍存的毒種迅速溶解后用DMEM培養(yǎng)基做10倍系列 稀釋(lO-LlO-8)。各稀釋度取50 uL加入96孔培養(yǎng)，每孔加0. 2mL細(xì)胞(約5 X 104/0. 2mL)， 在含5%C02，37°C條件下培養(yǎng)20h。吸去上清，避免觸碰細(xì)胞面，用丙酮固定細(xì)胞，進(jìn)行免疫 熒光染色，并進(jìn)行顯微鏡下熒光灶記數(shù)，要求病毒在每0. lmL中含104感染單位；取抗體Fab及Fab-CPNPs分別稀釋成lmg/mL ；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入10%滅 活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 u L ；將抗體Fab或Fab-CPNPs樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 y L分別加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)；混合后再取50 y L混合液置于下一孔內(nèi)；每孔加入50 y L能致80%細(xì) 胞感染的CVS病毒懸液；同時(shí)設(shè)空白孔對(duì)照，即不加入CVS病毒懸液，和病毒對(duì)照孔，即不加 入抗體，僅加入病毒；輕拍細(xì)胞板，混勻后在含5% C02，37°C條件下孵育lh，進(jìn)行中和；取出 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1 X 106/mL的BSR細(xì)胞50 u L，輕拍細(xì)胞板，混勻后在含5% C02， 37°C條件下孵育24h ；細(xì)胞長成單層，取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將孔中培養(yǎng)液甩入消毒液的盆 中，在吸水紙上輕拍板子，吸去多余水分；每孔加入200 y L的PBS溶液，甩出拍干后，每孔加 入預(yù)冷的80%丙酮50 u L，室溫固定30min，去掉丙酮，讓各孔干燥；每孔加入工作難度的熒 光標(biāo)記的鼠抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體50y L，37°C條件下孵育30min ；甩出液體，PBS 洗板2-3次；每孔加入80 %的甘油50 u L，待甘油布滿孔底后，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上，吸 去多余甘油；在熒光顯微鏡下觀察熒光情況；計(jì)算出能致50%細(xì)胞感染的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，通過Reed-Muench法計(jì)算 ED50，計(jì)算出樣品的狂犬病中和抗體的效價(jià)。結(jié)果表明，用RFFIT檢測(cè)Fab的中和效價(jià)為200. llIU/mg ；而用FAVN檢測(cè)中和效 價(jià)為177. 7IU/mg0而Fab092、Fab093和Fab095與狂犬病病毒CVS-11中和效價(jià)為0。2.熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)
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標(biāo)準(zhǔn)陽性參照血清的稀釋取適量的標(biāo)準(zhǔn)陽性參照血清加入DMEM培養(yǎng)基中，稀釋 成中和效價(jià)為0. 5IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)參照血清；取抗體Fab及Fab-CPNPs分別稀釋成lmg/mL ；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入10%滅 活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 u L ；將抗體Fab或Fab-CPNPs樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50 y L分別加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)做4個(gè)復(fù)孔；中和加入100TCID5(1的CVS-11于待測(cè)樣品中，同時(shí) 設(shè)空白孔對(duì)照，即不加入CVS病毒懸液，和病毒對(duì)照孔，即不加入抗體，僅加入病毒；37°C、 5%C02培養(yǎng)箱中孵育lh;取生長單層的BHK細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含2 %小牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分懸 浮，使細(xì)胞濃度調(diào)整為4X105個(gè)/mL，50 iiL/孔。(每孔約2X 104個(gè)細(xì)胞)；37°C，5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;取出細(xì)胞培養(yǎng)板，將培養(yǎng)基甩入污物盤，盤內(nèi)預(yù)先盛有足量的的NaOH溶液； 洗板3次每次5min ；加入80%的預(yù)冷丙酮固定；棄掉丙酮，洗板3次，每次5min ；染色按 1 128的工作濃度，以PBS稀釋熒光素標(biāo)記的抗狂犬病毒核蛋白抗體，按2%的量加入 的伊文斯藍(lán)溶液，混合均勻后，每孔滴加50y L，37°C濕盒內(nèi)溫育lh ；棄去熒光抗體溶液，以 PBS洗板3次，每次5min ；熒光顯微鏡下觀察結(jié)果凡有不少于1個(gè)熒光細(xì)胞的孔，記為“ + ”， 無熒光細(xì)胞的記為“_”；根據(jù)Karber法公式計(jì)算出血清的ED5CI(50%終點(diǎn)稀釋度)；結(jié)果判定免疫水平或 者抗體效價(jià)的測(cè)定是通過與0. 5IU參照血清的ED5(i值的比較而獲得。如果待檢樣品的ED5(i <參照血清的ED5(1，那么此待檢血清的效價(jià)< 0. 5IU/mL ；如果待檢樣品的ED50 >參照血清 的ED5(1，那么此待檢血清的效價(jià)> 0. 5IU/mL。研究結(jié)果表明，用RFFIT檢測(cè)Fab-CPNPs的中和效價(jià)為246. 12IU/mg ；而用FAVN檢 測(cè)結(jié)果為307. 7IU/mg。而Fab092、Fab093和Fab095與狂犬病病毒CVS-11中和效價(jià)為0。七.Fab及Fab-CPNPs對(duì)狂犬病暴露后預(yù)防作用10-12g昆明雌性小鼠(清潔級(jí))152只，隨機(jī)分成19組，每組8只。1. Fab對(duì)狂犬病暴露后小鼠的預(yù)防作用第1-10組小鼠于0天前肢肌肉注射100LD50劑量的狂犬病病毒CVS-24株病毒 0. 05mL (染色確定)，第11組不注射狂犬病病毒，作為抗體Fab的安全性試驗(yàn)組別；在小鼠攻毒3h后，各組按如下方式進(jìn)行預(yù)防處理第1組不做任何預(yù)防處理；第2 組在其攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒疫苗，劑量為1頭份/25kg ；第3組組在其攻毒部位 周圍注射20IU/kg的人抗狂犬病免疫球蛋白(HRIG)，在其攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒 疫苗，劑量為1頭份/25kg ；第4組在其攻毒部位周圍注射20IU/kg的抗體Fab，不注射狂犬 病疫苗；第5-10組在其攻毒部位周圍分別注射0.5，2，8，20，32，40IU/kg的抗體Fab ；在其 攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒疫苗，劑量為1頭份/25kg ；第11組在其前肢注射200IU/ kg(lmg/kg)的抗體Fab，不注射疫苗作為安全性試驗(yàn)組。對(duì)昆明鼠進(jìn)行暴露后預(yù)防處理后觀察28d。第1組不做任何預(yù)防處理，存活率為 12. 5% (1/8)，說明本研究采用的狂犬病暴露模型是成功的；第2組僅給予疫苗預(yù)防，存活 率為25% (2/8)，表明僅注射疫苗不能提供足夠的保護(hù)；第3組給予疫苗和20IU/kg的HRIG 進(jìn)行預(yù)防，存活率為62. 5% (5/8)；第4組僅給予20IU/kg Fab-CPNPs進(jìn)行預(yù)防，存活率為 25% (2/8)，表明單獨(dú)使用抗體預(yù)防也不能提供保護(hù)；第5-10組給予疫苗聯(lián)合0.5、2、8、20、32、40IU/kg 的 Fab 進(jìn)行預(yù)防，其存活率分別為 37. 5% (3/5),37. 5% (3/8),37. 5% (3/8)、 37.5% (3/8), 50% (3/8), 75% (3/8)，表明疫苗聯(lián)合不同劑量的Fab能夠提供不同的保護(hù) 率；第11組不注射狂犬病病毒，僅注射Fab抗體，存活率均為100%。2. Fab-CPNPs對(duì)狂犬病暴露后小鼠的預(yù)防作用小鼠狂犬病暴露及預(yù)防方法如下第1-3組與Fab對(duì)狂犬病暴露后預(yù)防試驗(yàn)組第 1-3組，分別為不預(yù)防組、疫苗預(yù)防組、HRIG聯(lián)合疫苗預(yù)防組；處理方式也與Fab相一致；第 12-18組小鼠于0天前肢肌肉注射100LD50劑量的狂犬病病毒CVS-24株病毒0. 05mL(染 色確定)，第19組不注射狂犬病病毒，作為抗體Fab-CPNPs的安全性試驗(yàn)組別；在小鼠攻 毒3h后，各組按如下方法進(jìn)行預(yù)防處理第12組在其攻毒部位周圍注射20IU/kg的抗 體Fab-CPNPs，不注射狂犬病疫苗；第13-18組在其攻毒部位周圍分別注射0.5，2，8，20， 32，40IU/kg的抗體Fab-CPNPs ；在其攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒疫苗，劑量為1頭份 /25kg ’第19組在其前肢注射200IU/kg(lmg/kg)的抗體Fab-CPNPs，不注射疫苗作為安全 性試驗(yàn)組。對(duì)昆明鼠進(jìn)行暴露后預(yù)防處理后觀察28d。第1-3組與2. 2Fab對(duì)狂犬病暴露后 不預(yù)防組、疫苗預(yù)防組、HRIG聯(lián)合疫苗預(yù)防組結(jié)果公用，即相一致；分別為第1組不作任何 預(yù)防組，存活率為12. 5% (1/8)，說明本研究采用的狂犬病暴露模型是成功的；第2組僅給 予疫苗預(yù)防，存活率為25% (2/8)，表明僅注射疫苗不能提供足夠的保護(hù)；第3組給予疫苗 和20IU/kg的HRIG進(jìn)行預(yù)防，存活率為62. 5% (5/8)；第4組僅給予20IU/kg Fab-CPNPs 進(jìn)行預(yù)防，存活率為25% (2/8)，表明單獨(dú)使用抗體Fab-CPNPs不能提供保護(hù)；第13-18 組給予疫苗聯(lián)合0. 5、2、8、20、32、40IU/kg的Fab進(jìn)行預(yù)防，其存活率分別為25% (2/5)、 50% (4/8),62. 5% (5/8),62. 5% (5/8), 75% (6/8), 75% (6/8)，表明疫苗聯(lián)合不同劑量的 Fab-CPNPs能夠提供不同的保護(hù)率；第19組不注射狂犬病病毒，僅注射Fab-CPNPs抗體，存 活率均為100%。表lFab聯(lián)合疫苗對(duì)昆明鼠狂犬病暴露后預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 表2Fab_CPNPs聯(lián)合疫苗對(duì)昆明鼠狂犬病暴露后預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
權(quán)利要求
人源抗狂犬病毒Fab抗體，其特征在于所述抗體的VH鏈具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且所述抗體的VL鏈具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗狂犬病毒Fab抗體，其特征在于所述抗體的VH鏈具有 SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗狂犬病毒Fab抗體，其特征在于所述抗體的\鏈具有 SEQID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1 3任一所述抗狂犬病毒Fab抗體在制備動(dòng)物及人狂犬病暴露后治療藥 物中的應(yīng)用。
5.人源抗狂犬病毒Fab抗體與納米粒子交聯(lián)的方法，其特征在于制備步驟為a.鈣納米粒子的制備12.5mmol/L CaCl2、12. 5mmol/L NaH2P04 禾口 15. 6mmol/L 枸櫞酸 鈉等體積混合，室溫磁力攪拌20-48h ；超聲儀內(nèi)超聲處理l_3h ；在4°C條件下10，OOOrpm離 心15min ；超聲沉淀用PBS懸浮得鈣納米粒子懸浮液；b.納米交聯(lián)純化的Fab抗體加入上述懸浮液，所述抗體在懸浮液中的濃度為45mg/L； 4°C條件下，磁力攪拌5-10h ；在4°C條件下10，OOOrpm離心15min ；離心沉淀用雙蒸水懸浮 即為所交聯(lián)的人源抗狂犬病毒Fab抗體鈣納米粒子。
6.權(quán)利要求5所制備得到的納米粒子交聯(lián)抗狂犬病毒Fab抗體在制備動(dòng)物及人狂犬病 暴露后治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
人源抗狂犬病毒Fab抗體及其與納米粒子交聯(lián)的方法和應(yīng)用，所述抗體的VH鏈具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列，并且所述抗體的VL鏈具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本發(fā)明制備的抗狂犬病病毒的Fab抗體及其納米化抗體Fab-CPNPs通過狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)攻毒株CVS-24攻擊昆明鼠，同時(shí)給予疫苗聯(lián)合不同劑量的Fab抗體或納米化Fab-CPNPs抗體對(duì)小鼠進(jìn)行暴露后預(yù)防實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明僅給予疫苗預(yù)防，不能提供足夠的保護(hù)；不同劑量的Fab、Fab-CPNPs對(duì)狂犬病暴露后的小鼠具有一定的保護(hù)作用。制備的納米化抗體在狂犬病暴露后治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101863978SQ20101017382
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者馮振卿, 劉新建, 朱進(jìn), 林紅, 管曉虹 申請(qǐng)人:中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所