專利名稱：酒蒸黃連炮制品及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酒蒸黃連，本發(fā)明還提供了該酒蒸黃連的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織《2008年世界衛(wèi)生報(bào)告》城市化、老齡化和全球性的生活方式變 化三者結(jié)合，使糖尿病等慢性非傳染性疾病成為越來越主要的疾病和死亡原因。據(jù)中華醫(yī) 學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)《中國2型糖尿病防治指南(2007版)》:中國糖尿病患病人群中，以2型 糖尿病為主(占93. 7% )，2025年預(yù)計(jì)將達(dá)到5500萬人。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”病范疇， 中醫(yī)藥理論認(rèn)為“消渴”的病機(jī)因恣食肥甘，或情志過極、房事不節(jié)、熱病之后等，郁熱內(nèi) 蘊(yùn)，氣化失常，津液精微不能正常輸布而下泄，陰虛燥熱(GB/T 16751. 1-1997中醫(yī)臨床診 療術(shù)語疾病部分)。“凡積久飲酒，未有不成消渴?！?唐代《千金方》)黃連為常用中藥，中醫(yī)很早就認(rèn)識(shí)到“治消渴”的用途，歷代本草及名醫(yī)驗(yàn)案多有 記載，梁代《名醫(yī)別錄》記載“止消渴”；唐代《新修本草》記載“黃連，療渴為最”。明代《玉機(jī) 微義》記載“酒蒸黃連丸，治消渴，飲水無度至二三升，小便五七十次，發(fā)熱瘦弱，口干，食已 如饑，此名消癉。今用味苦無毒，除熱正氣，消渴厚腸。消渴之人，脾胃惡濕，黃連為對(duì)。黃 連凈，半斤，酒一升，湯重蒸。伏時(shí)曬干用，右末，滴水丸，梧子大，每五十丸食前溫水下”；明 代《本草綱目》記載“治消渴，用酒蒸黃連”；朝鮮醫(yī)籍《東醫(yī)寶鑒》引明代《醫(yī)學(xué)綱目》“治消 渴要藥，酒浸蒸，曬干為末，蜜丸，白湯下五七十丸”；清代《本草備要》記載“單用能治消渴”。中藥黃連也為治療消渴病(糖尿病)的中成藥處方中常用藥味，2006年國內(nèi) 醫(yī)院糖尿病用藥分析結(jié)果表明，在排名前十位的產(chǎn)品中，糖脈康顆粒(含黃連，市場分額 22. 1 %，約1億元)、金芪降糖片(含黃連，市場分額11. 6%，約5000萬元)，分列第2、4位， 在中醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用。但本草醫(yī)籍對(duì)治消渴宜用的黃連飲片(炮制品)，或語焉不詳，或統(tǒng)而概之，現(xiàn)代 研究中也缺少對(duì)黃連不同炮制品在“治消渴”用途上的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，導(dǎo)致在中醫(yī)臨床實(shí)踐中甚 至提出“黃連不是治療消渴病(糖尿病)的主藥”。目前黃連治療消渴病(糖尿病)的研究主要集中在生品黃連及單一有效成分(小 檗堿)及生品黃連中提取的黃連總堿上，[黃笑夏，歐陽欽.黃連免煎顆粒治療肝原性糖 尿病臨床觀察.天津藥學(xué).2008，20 (3) 41-42]等報(bào)道，在臨床單獨(dú)使用胰島素及黃連素 免煎顆粒與胰島素聯(lián)合應(yīng)用均能有效降低血糖，但黃連素免煎顆粒與胰島素聯(lián)合應(yīng)用效 果更好，且黃連素免煎顆粒與胰島素聯(lián)合應(yīng)用組血糖值控制得更為穩(wěn)定。[Li-Qin Tang, Wei Wei，Li—MingChen，et al· Effects of berberine on diabetes induced by alloxan anda high-fat/high-cholesterol diet in rats. Journal ofEthnopharmacology. 2006, 108 (1) : 109 115]報(bào)道，對(duì)飲食誘導(dǎo)的糖尿病高脂血癥大鼠模型(高脂/高膽固醇/四氧 嘧啶)，小檗堿抑制了糖尿病進(jìn)程，作用機(jī)制可能與降血糖、調(diào)節(jié)血脂代謝等作用相關(guān)。[朱 紅衛(wèi)，唐禮可.黃連總堿對(duì)小鼠降糖作用研究.云南中醫(yī)中藥雜志.2008，29 (7) :59 60] 報(bào)道，黃連總堿具有顯著降血糖作用，對(duì)正常小鼠的血糖水平?jīng)]有影響。
小檗堿對(duì)改善2型糖尿病患者胰島素抵抗方面有明確作用，而黃連各種飲片規(guī)格 都含有小檗堿成分，不同的黃連炮制品的功效也有不同，而且含有小檗堿成分的黃柏、三顆 針等中藥臨床效用也有不同，為中醫(yī)臨床處方用藥所困惑，早在清代《修事指南》就指出“炮 制不明，藥性不確，則湯方無準(zhǔn)而病癥不驗(yàn)也”，因此本發(fā)明發(fā)掘本草經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了酒蒸 黃連“治消渴”用途及其安全性，對(duì)防治與胰島素抵抗相關(guān)的代謝綜合征、糖尿病或并發(fā)癥 具有一定的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了 一種酒蒸黃連炮制品。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供 了該炮制品的制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種酒蒸黃連炮制品，它是將黃酒或白酒加入生黃連中蒸制而成， 制備的黃連炮制品的指紋圖譜如圖1所示，主要指標(biāo)成分包括藥根堿、非洲防己堿、表小檗 堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿及其以上生物堿成分的鹽酸鹽，其中，藥根堿、非洲防己堿、表小 檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為4_7 5-9 11-17 23-35 23-27 100。進(jìn)一步優(yōu)選地，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配 比為4· 7-6.8 5.7-8.3 11.5—16.7 23.9—34.5 23.4—26.5 100。 更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿 的重量配比為5. 6 7. 1 14. 8 31. 0 24.5 100。本發(fā)明酒蒸黃連炮制品是由如下方法制備而成取凈黃連，加黃酒或白酒悶潤 1-6小時(shí)，加熱蒸制3 8小時(shí)，取出，干燥，即得，其中黃連與黃酒或白酒的用量配比為黃連100份、黃酒或白酒20 120份。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的酒蒸黃連的炮制工藝中，每100份黃連，用酒40份拌勻，悶 潤6小時(shí)，加熱蒸制8小時(shí)，取出，干燥。本發(fā)明還提供了一種制備所述的黃連炮制品的方法，它是由如下方法制備而成 取凈黃連，加黃酒悶潤1-6小時(shí)，加熱蒸制3 8小時(shí)，取出，干燥，即得，其中黃連與黃酒的 用量配比為黃連100份、黃酒20 120份。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的酒蒸黃連的炮制工藝中，每100份黃連，用酒40份拌勻，悶 潤6小時(shí)，加熱蒸制8小時(shí)，取出，干燥。本發(fā)明還提供了所述的黃連炮制品在制備具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提 高葡萄糖利用率或降低血脂功能的藥物中的用途。其中，所述的藥物是改善胰島素抵抗，降低糖異生的藥物。其中，所述的藥物是治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物。本發(fā)明還提供了該黃連炮制品在制備胰島素增敏劑及PPARY激動(dòng)劑的藥物中的 用途。與生品黃連、小檗堿比較，顯著增加PPAR γ表達(dá)量，可以顯著改善胰島素抵抗，是具 有開發(fā)前景的胰島素增敏劑。本發(fā)明還提供了所述的黃連炮制品在制備α -葡萄糖苷酶抑制劑的藥物中用途。本發(fā)明還提供了一種具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞 葡萄糖利用率或降低血脂功能的藥物組合物，它是由下述方法制備而成取權(quán)利要求1-4所述的酒蒸黃連，加水煎煮1 3次，每次0. 5 3小時(shí)，每次加水量為6 10倍量，濾過，合 并提取液，濃縮，備用，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。進(jìn)一步優(yōu)選地，它是由下述方法制備而成取酒蒸黃連，加水煎煮3次，每次3小 時(shí)，每次加水量為10倍量，濾過，合并提取液，濃縮，備用。其中，所述的制劑是口服制劑。本發(fā)明酒蒸黃連與生品黃連及鹽酸小檗堿相比，具有明顯的作用，藥效明確，為臨 床提供了一種新的選擇。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1酒蒸黃連樣品HPLC圖譜(其中，1-鹽酸藥根堿2-非洲防己堿3-表小檗堿 4-黃連堿5-巴馬汀6-鹽酸小檗堿)圖2酒蒸黃連給藥后大鼠血清HPLC指紋圖譜(其中，a 對(duì)照品色譜圖b空白血 清色譜圖c:酒蒸黃連體內(nèi)色譜圖，1-非洲防己堿2-表小檗堿3-黃連堿4-小檗堿)圖3酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型增殖影響圖4顯微鏡下的3T3-L1前脂肪細(xì)胞及3T3-L1脂肪細(xì)胞(X200)A :3T3_L1前脂肪 細(xì)胞；B :3T3-L1脂肪細(xì)胞；C :3T3-L1脂肪細(xì)胞(油紅0染色)圖5酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞株分化的影響圖6酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡萄糖利用的影響圖7酒蒸黃連對(duì)PPAR y表達(dá)的影響(Western blot法)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明酒蒸黃連炮制品的制備取凈黃連，加酒拌勻(每1kg凈藥材，用黃酒或白酒0. 2kg)，置鍋內(nèi)，悶潤2小時(shí)， 加熱蒸制5小時(shí)，取出，干燥。實(shí)施例2本發(fā)明酒蒸黃連炮制品的制備取凈黃連，加酒拌勻(每1kg凈藥材，用黃酒或白酒0. 4kg)，置鍋內(nèi)，悶潤4小時(shí)， 加熱蒸制8小時(shí)，取出，干燥。實(shí)施例3本發(fā)明酒蒸黃連炮制品的制備取凈黃連，加酒拌勻(每1kg凈藥材，用黃酒或白酒0. 6kg)，置鍋內(nèi)，悶潤6小時(shí)， 加熱蒸制4小時(shí)，取出，干燥。實(shí)施例4本發(fā)明酒蒸黃連炮制品的制備取凈黃連，加酒拌勻(每1kg凈藥材，用黃酒或白酒0. 8kg)，置鍋內(nèi)，悶潤1小時(shí)， 加熱蒸制7小時(shí)，取出，干燥。實(shí)施例5本發(fā)明酒蒸黃連炮制品的制備取凈黃連，加酒拌勻(每1kg凈藥材，用黃酒或白酒1kg)，置鍋內(nèi)，悶潤3小時(shí)，加 熱蒸制3小時(shí)，取出，干燥。
實(shí)施例6本發(fā)明酒蒸黃連炮制品的炮制工藝優(yōu)選 取凈黃連，加酒拌勻(每Ikg凈藥材，用黃酒或白酒1. 2kg)，置鍋內(nèi)，悶潤5小時(shí)， 加熱蒸制6小時(shí)，取出，干燥。以上6個(gè)試驗(yàn)例制備的酒蒸黃連炮制品，測(cè)定總生物堿含量，同時(shí)進(jìn)行薄層色譜 分析。總生物堿測(cè)定方法取黃連粉末約0. 8g，精密稱定.置索氏提取器中，用鹽酸-甲 醇(1 100)適量。加熱回流提取，至提取液無色為止，將提取液轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，用鹽 酸-甲醇(1 100)少量洗滌容器，洗液并人提取液中，并加至刻度。照柱色譜法(附錄VI C)試驗(yàn)，精密量取5mL，加于已處理好的氧化鋁柱(內(nèi)徑約9mm，中性氧化鋁5g，濕法裝柱， 用乙醇約30mL預(yù)洗)上，用乙醇35mL分次洗脫，置50mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻， 精密吸取2mL，置50mL量瓶中，用硫酸溶液(0. 05mol/L)稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法以 硫酸溶液(0.05mol/L)為空白，在345nm波長處測(cè)定吸收度，按鹽酸小檗堿(C2tlH18ClNO4)的
吸收系數(shù)(A=)為728計(jì)算其含量。表1酒蒸黃連炮制工藝均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)表與結(jié)果 含量綜合評(píng)分=Σ (表2中各生物堿含量/表3中各生物堿最高值*100)效應(yīng)綜合評(píng)分=Σ (表3中各劑量組葡萄糖利用率/表3中各劑量組葡萄糖利用 率最高值*100)表2酒蒸黃連炮制工藝含量測(cè)定結(jié)果 表3酒蒸黃連炮制工藝樣品對(duì)3T3-L1細(xì)胞模型葡萄糖利用率的影響 (1)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)含量綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行多元逐步回歸分析，得到回歸方 程Y = 570. 02-0. 41*Xl+4. 18*X2P = 0. 019，回歸方程有顯著性意義(2)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)含量綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行多元二次逐步回歸分析，得到回 歸方程2 Y = 574. 45-0. 17*X1_0. 08*X3*X3_0. 04*Xl*X3+0. 71*X2*X3P = 0. 0021,回歸方程有顯著性意義最高指標(biāo)時(shí)的因素水平組合黃酒用量20%、悶潤時(shí)間6小時(shí)、蒸制時(shí)間8小時(shí)。(3)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)特征性成分(非洲防己堿)含量進(jìn)行多元逐步回歸分析， 得到回歸方程3:Y = 0. 4864-0. 0109*X3P = 0. 055，回歸方程無顯著性意義(4)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)效應(yīng)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行多元逐步回歸分析，得到回歸方 程Y = 211. 69-0. 63*X1P = 0. 040，回歸方程有顯著性意義(5)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)效應(yīng)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行多元二次逐步回歸分析，得到回 歸方程Y = 179. 68+0. 41*X1_0. 01*Xl*Xl+0. 09*X1*X3_0. 57*X2*X3P = 0. 049，回歸方程有顯著性意義最高指標(biāo)時(shí)的因素水平組合黃酒用量60%、悶潤時(shí)間1小時(shí)、蒸制時(shí)間8小時(shí)。由方程1、2、3、4、5，結(jié)合直觀分析及成本效益分析，確定酒蒸黃連的工藝參數(shù)為 取凈黃連，每100kg用黃酒或白酒40kg,悶潤6小時(shí)，蒸制8小時(shí)，即得。根據(jù)方程2的含量綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值為584根據(jù)方程5的效應(yīng)綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值為182以上預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在確定的酒蒸黃連的工藝參數(shù)下，含量與效應(yīng)的結(jié)果比較理 想，也與均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)號(hào)2的因素水平設(shè)置相近。因此確定酒蒸黃連的工藝參數(shù)為取凈黃連，每100kg用黃酒或白酒40kg，悶潤6 小時(shí)，蒸制8小時(shí)，即得。實(shí)施例7本發(fā)明酒蒸黃連的質(zhì)量控制方法酒蒸黃連的質(zhì)量控制方法
(1)薄層色譜鑒別取本品粉末0. lg，加甲醇50ml，超聲處理30min，濾液作為供試品溶液。取鹽酸藥 根堿照品、非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿加甲醇制成 每1ml含0. lmg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取各對(duì)照品溶液1. 5ml加入同一 10ml量 瓶中，以甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部 附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙
酸乙酯-異丙醇-甲醇-氨水-三乙胺(3 3.5
1.5 0. 5 1)并以氨水預(yù)飽和
20min后，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相 應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。(2)含量測(cè)定方法采用XtimateTM C18(4. 6mmX 250mm, 5 u m)色譜柱，以 0. 三乙胺(碳酸 氫銨，氨水調(diào)PH為10)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速lmL.min-l，柱溫 30 °C，檢測(cè)波長 270nm。結(jié)果鹽酸藥根堿在 0. 848 u g. ml/1 16. 96 u g. ml/1 (r = 0. 9997)、 非洲防己堿在 1. 248 u g. ml/1 24. 96 u g. ml/1 (r = 0. 9999)、表小檗堿在 2. 048 u g. ml/1 40. 96 u g. mL_1 (r = 0. 9999)、黃連堿在 3. 648 ii g. mL_1 72. 96 u g. mL_1 (r = 0. 9999)、 巴馬汀在 2. 88 u g. mL-1 57.6iig. mL-1 (r = 0. 9998)、鹽酸小檗堿在 13. 248 u g. mL-1 264. 96 ug. mL—1，(r = 0. 9996)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。加樣回收率及其RSD分別為102.4% (RSD 為 1. 17 % )、101. 8 % (RSD 為 1. 30 % )、100. 3 % (RSD 為 1. 76 % )、100. 7 % (RSD 為 1. 75% )U01. 2% (RSD 為 1.53% )和 97.9% (RSD 為 1. 97% ) 樣品重復(fù)性良好，在 12h 內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論方法操作簡便、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，可用于酒蒸黃連中6種生物堿的含量測(cè) 定。
對(duì)以上含量測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行進(jìn)行兩樣本均數(shù)的比較分析 (Independent-Samples T Test)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明酒蒸黃連中非洲防己堿的含量與生品飲片比較有顯著性變化(P = 0. 017)(指紋圖譜見圖1)，同時(shí)在血清化學(xué)指紋圖譜發(fā)現(xiàn)的入 血成分中非洲防己堿的色譜峰明顯，非洲防己堿的可能是酒蒸黃連中與藥效生物效應(yīng)相關(guān) 的重要成分之一，見圖2。由實(shí)施 例6中酒蒸黃連工藝各實(shí)驗(yàn)號(hào)測(cè)定結(jié)果(表2)，結(jié)合實(shí)施例7中各批次酒 蒸黃連測(cè)定結(jié)果(表4)，合并各結(jié)果構(gòu)成表5表5酒蒸黃連含量測(cè)定結(jié)果(mg/g) 表6酒蒸黃連含量測(cè)定結(jié)果(比例含量，以鹽酸小檗堿含量為100計(jì)算) 按統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的99%置信區(qū)間(下限值，上限值)，Ua/2 二 2·56(α = 0· 01)下 限值=平均值-υα/2 X標(biāo)準(zhǔn)偏差，上限值=平均值+Ua/2Χ標(biāo)準(zhǔn)偏差綜上所述，酒蒸黃連中，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為4. 74-6. 84 5.67-8.32 11. 54-16. 66 23. 89-34. 49 23. 38-26. 46 10 0 或4-7 5-9 11-17 23-35 23-27 100(3)化學(xué)指紋圖譜酒蒸黃連化學(xué)指紋圖譜的主要特征峰包括藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連 堿、巴馬汀、小檗堿，還包括以上生物堿成分的鹽酸鹽(圖1)。酒蒸黃連HPLC指紋圖譜的最佳色譜條件為XtimateTMC18(4.6X250mm，5iim)；柱 溫30°C ；流速1. Oml/min ；檢測(cè)波長270nm ；流動(dòng)相0. 三乙胺的水溶液(碳酸氫銨，氨 水調(diào)節(jié)PH到10)-乙腈(二元梯度洗脫)；進(jìn)樣量10ul ；采樣時(shí)間45min，洗脫程序如下流動(dòng)相A泵0. 三乙胺的水溶液(碳酸氫銨，氨水調(diào)節(jié)PH到10) ；B泵乙腈。時(shí)間程序0 15min，A 泵90% — 75% ;B 泵— 25%15 25min，A 泵75%— 70% ;B 泵25%— 30%25 40min，A 泵70%— 55% ;B 泵30%— 45%40 50min，A 泵55%— 90% ;B 泵45%— 10%酒蒸黃連供試品溶液制備方法取酒蒸黃連粉末0. lg，精密稱定，置錐形瓶中，加 入鹽酸-甲醇(1 100)501111，超聲處理301^11，濾過，過0.4511111微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。酒蒸黃連水提取浸膏供試品溶液制備方法取酒蒸黃連25g，精密稱定，置燒杯 中，加水150ml，煎煮3h，煎煮3次，合并水煎液，濃縮至lg/g濃縮液。取0. lg濃縮液，精密 稱定，置錐形瓶中，加入鹽酸-甲醇(1 100)501111，超聲處理301^11，濾過，過0.4511111微孔 濾膜，取續(xù)濾液，即得。(4)血清化學(xué)指紋圖譜酒蒸黃連血清化學(xué)指紋圖譜中的主要特征峰包括非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、 小檗堿，還包括以上生物堿成分的鹽酸鹽(圖2)。整體動(dòng)物模型灌胃樣品的制備取酒蒸黃連100g，加水600ml，煎煮2h，煎煮3次， 合并水煎液，濃縮至lg/ml，即得灌胃樣品。試驗(yàn)方法取SD大鼠5只。禁食12h(自由飲水)，稱體重，按照5g/kg灌胃給予酒 蒸黃連濃縮液(lg/ml)，給藥后180min，股動(dòng)脈取血，37°C水浴15min，3600rpm離心15min， 分離血清，即為含藥血清。取各時(shí)間點(diǎn)含藥血清1ml分別置于5ml帶蓋離心管中，分別加入 乙腈3ml渦旋3min，3600r/min離心lOmin，取上清液，于37°C氮吹儀吹干，加入50%甲醇 75 u 1，渦旋 3min, 120000r/min 離心 lOmin,即得。色譜分析條件同“化學(xué)指紋圖譜”項(xiàng)下。(5)其控制指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)例7本發(fā)明酒蒸黃連炮制品提取浸膏的制備工藝優(yōu)選根據(jù)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)和水煎提取工藝特點(diǎn)，考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等三個(gè) 因素，選擇混合水平的均勻設(shè)計(jì)表U6 (6 X32)。稱取黃連10g，加水至規(guī)定量，水煎提取規(guī)定時(shí)間，提取規(guī)定次數(shù)，提取液濃縮至10mL。
表7酒蒸:黃連水煎提取工藝的影響因素與水平設(shè)置 表8酒蒸黃t連水煎提取工藝的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)表和結(jié)果
(1)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)總生物堿含量結(jié)果進(jìn)行多元逐步回歸分析，得到回歸方 程1 Y = 1. 6680+0. 3209*Xl+0. 5200*X3P = 0. 0121 ；回歸方程有顯著性意義(2)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)總生物堿含量結(jié)果進(jìn)行多元二次逐步回歸分析，得到回 歸方程2 Y = 2. 1836+0. 1235*Xl*X3+0. 0044*X2*X3P = 0. 0164 ；回歸方程有顯著性意義最高指標(biāo)時(shí)的因素水平組合加水量為100ml，提取時(shí)間為3小時(shí)、提取次數(shù)為3 次由方程1、2可知，對(duì)黃連水煎提取工藝影響的顯著因素是提取時(shí)間、提取次數(shù)，其 次是加水量，從確定了酒蒸黃連水煎提取工藝的優(yōu)化參數(shù)為取凈黃連，加水煎煮3次，每 次3小時(shí)，每次加水量為10倍量，濾過，合并提取液。2. 3. 3驗(yàn)證方法與結(jié)果按2. 3. 2項(xiàng)下確定的優(yōu)化水煎提取工藝參數(shù)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由表9可知，酒蒸黃 連的水煎提取工藝穩(wěn)定可行。表9酒蒸黃連水煎提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)表和結(jié)果 實(shí)驗(yàn)例8本發(fā)明酒蒸黃連提取浸膏的制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)例6、7提供的優(yōu)化工藝，提取制備了酒蒸黃連提取浸膏供藥理實(shí)驗(yàn)，在 總生物堿測(cè)定的基礎(chǔ)上還測(cè)定了總多糖的含量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)例7提供的優(yōu)化工藝，還提取制 備了生品黃連的提取浸膏供藥理實(shí)驗(yàn)，在總生物堿測(cè)定的基礎(chǔ)上還測(cè)定了總多糖的含量。總生物堿的測(cè)定方法精密稱取浸膏0.4g，至25mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖 勻，照柱色譜法試驗(yàn)。精密量取5mL，置已處理好的氧化鋁柱(內(nèi)徑約0. 9cm,中性氧化鋁5g， 濕法裝柱，用乙醇30mL預(yù)洗)上，用乙醇35mL洗脫，收集洗脫液置50mL量瓶中，用乙醇稀 釋至刻度，搖勻。精密量取2mL轉(zhuǎn)置50mL量瓶中，用0.05mol/l H2S04溶液，稀釋至刻度， 搖勻。按照紫外分光光度法，在345nm波長處，測(cè)定吸收度，按鹽酸小檗堿的吸收系數(shù)為728 計(jì)算，即得?？偠嗵堑臏y(cè)定方法精密稱取已經(jīng)提取好的黃炮制品品提取浸膏，置離心管中，加 無水乙醇至80%，混勻，離心10min(3000r/min)，棄去上清液，用80 %乙醇多次洗滌沉淀， 至離心上清液無色，沉淀用沸水分次使溶解，離心，上清液轉(zhuǎn)移置100mL量瓶中，精密吸取 5mL轉(zhuǎn)移置25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品。分別吸取供試品溶液、葡萄糖對(duì)照 品溶液(0. 06mg/mL) 2mL至具塞試管中，加入蒽酮試劑8mL，渦旋30s，沸水lOmin，冷卻至室 溫，在620nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算以葡萄糖計(jì)算的黃連總多糖的含量。表10酒蒸黃連提取浸膏總生物堿/總多糖測(cè)定結(jié)果 由上數(shù)據(jù)可知，酒蒸黃連提取浸膏中總生物堿含量明顯低于生品黃連。以下通過藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增值的影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞株是小鼠胚胎來源、具有纖維母細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞株，在經(jīng)典的 激素雞尾酒，即胰島素、地塞米松和1-甲基-3-異丁基黃嘌呤的刺激下，具有分化為成熟脂 肪細(xì)胞的能力，是目前國際上研究肥胖及體外脂肪細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞模型。通過干預(yù) 小鼠前脂肪細(xì)胞觀察其對(duì)該細(xì)胞增殖和分化的影響，為肥胖的2型糖尿病的治療提供可能 的途徑。方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液按5X 105/ml的密度接種到48孔培養(yǎng)板，于含 10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37°C、5% C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d換液1次。待3T3-L1前脂肪細(xì)胞貼壁后，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù)，空白對(duì)照組 培養(yǎng)液中加入等體積藥物溶劑PBS，每濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在37°C、體積分?jǐn)?shù)5% C02中 培養(yǎng)2d。48h后，PBS漂洗，加入DMEM高糖培養(yǎng)液400 yl及5mg/ml MTT 40 u 1，孵育4h。 吸去培養(yǎng)液，并加入溶媒DMSO 300ia，490nm測(cè)定各組的0D值。計(jì)算3T3-L1前脂肪細(xì)胞
增殖變化率。相對(duì)變化率(％ )=(實(shí)驗(yàn)組平均0D值/空白對(duì)照組平均0D值-1) X 100%表11酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 增殖率1 各劑量組相對(duì)空白組的增殖變化率；增殖率2 酒蒸組相對(duì)于同劑量組生品的增殖變化率。注與空白對(duì)照組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；由表11、圖3可知，酒蒸黃連促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖作用優(yōu)于黃連生品。試驗(yàn)例2酒蒸黃連提取浸膏對(duì)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液按5X 105/ml的密度接種到48孔培養(yǎng)板，于含 10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37°C、5% C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d換液1次。 待3T3-L1前脂肪細(xì)胞達(dá)到接觸抑制后，用含1 P mol/L的Dex、0. 5mmol/L IBMX及5mg/L胰 島素的DMEM完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，48h后撤去Dex和IBMX，用10mg/L胰島素再繼續(xù)作用 48h，換正常完全培養(yǎng)液培養(yǎng)8 12天，隔天換液，直至3T3-L1細(xì)胞90 %多呈脂肪細(xì)胞表型 時(shí)。在誘導(dǎo)分化的同時(shí)，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù)，空白對(duì)照組培養(yǎng)液 中加入等體積藥物溶劑PBS，每濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物與分化培養(yǎng)液同步更換至分化結(jié) 束。誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次后，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞 lOmin，吸去固定液，PBS漂洗，加入油紅0染液室溫染色15min。棄去油紅0染液，PBS漂洗 3次除去多余染液；置顯微鏡下觀察，拍片；加入異丙醇，抽提脂肪細(xì)胞中油紅0，510nm測(cè)定 0D值，計(jì)算細(xì)胞分化相對(duì)變化率。分化相對(duì)變化率(％ )=(實(shí)驗(yàn)組平均0D值/空白對(duì)照組平均0D值-1) X 100%未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈梭形，胞漿中無脂滴存在，形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似 (圖4-A)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和胰島素的共同作用 下，逐漸誘導(dǎo)分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴，并隨著分化程度的加深而積聚增 多(圖4-B)。油紅0為脂肪特征性染色劑，染色后胞漿中的脂滴呈紅色(圖4-C)。 注與空白對(duì)照組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；由表12，圖5可知，酒蒸黃連有2個(gè)劑量組明顯抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化(P <0.01)，這與陽性藥馬來酸羅格列酮作用恰好相反；同時(shí)，與黃連生品相比較，酒蒸黃連 抑制分化率均明顯高于黃連生品。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒蒸黃連在一定劑量下抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，提示 酒蒸黃連炮制品可能不會(huì)引起脂肪的聚集而造成體重增加，這對(duì)防治與胰島素抵抗相關(guān)的 代謝綜合征或并發(fā)癥具有一定的意義，而且其作用優(yōu)于黃連生品。試驗(yàn)例3酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞胰島素抵抗(IR)模型葡萄糖利 用的影響方法細(xì)胞分化完全后，除空白組加入正常培養(yǎng)基，其余各組均加入lymol/L的 地塞米松、lymol/L的胰島素進(jìn)行脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗，作用3d。待脂肪細(xì)胞胰島素抵 抗成立后，換用無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù) 3d，空白對(duì)照組培養(yǎng)液中加入等體積藥物溶劑PBS，每濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，觀察藥物對(duì)胰 島素抵抗的改善作用。72h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液505nm比色測(cè)定葡萄糖的含量，計(jì)算細(xì)胞葡 萄糖利用相對(duì)變化率。
葡萄糖利用相對(duì)變化率(％) 二 r聽且平丨髓-實(shí)爾<^ _跳xl00%
mmmmmmim表13酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡萄糖利用的影響
(> $，n=6) 注與模型對(duì)照組比較，*P < 0. 05，**P < 0.01 ；由表13，圖6可知，與空白組比較，3T3-L1脂肪細(xì)胞在地塞米松和胰島素作用下， 模型組對(duì)胰島素的敏感性明顯降低，培養(yǎng)液中葡萄糖的攝取明顯減少，表明脂肪細(xì)胞胰島 素抵抗模型造模成功(P <0.01)。與模型組比較，酒蒸黃連能明顯或部分降低培養(yǎng)液中葡 萄糖的含量(P < 0. 05 0. 01)，提高脂肪細(xì)胞葡萄糖的利用率，改善胰島素抵抗，作用與陽 性藥馬來酸羅格列酮相似，同時(shí)，酒蒸黃連有3個(gè)劑量組的葡萄糖利用相對(duì)變化率高于黃 連生品。試驗(yàn)例4酒蒸黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞PPAR γ的影響ilfi^^Blilli^^^Sf^ (Peroxisome Proliferator ActivatedReceptors, PPARs)，PPARs包括PAR α ,PPAR γ和PPAR δ等三種亞型。PPAR γ則主要在肝臟及脂肪、肌 肉組織表達(dá)，促進(jìn)脂肪組織的分化、脂肪酸合成和儲(chǔ)存，是脂肪形成的關(guān)鍵物質(zhì)。PPARy與 配體或激活物結(jié)合后，可進(jìn)一步激活脂肪細(xì)胞分化過程，參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞特異基因的表 達(dá)、脂質(zhì)貯存和代謝。目前PPAR γ激動(dòng)劑中的典型藥物是羅格列酮，它是人工合成的PPAR 配體，它有胰島素增敏及降血糖作用，可通過激活靶組織中的PPARy發(fā)揮改善胰島素抵抗 (IR)、降低血糖、抑制血管平滑肌的增殖和遷移、改善內(nèi)皮功能等多種生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù)， Western blot檢測(cè)PPAR γ表達(dá)量，結(jié)果表明與生品比較，酒蒸黃連使PPAR γ的蛋白表達(dá) 量顯著上升，見圖7。體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)小檗堿干預(yù)，在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化過程中，小 檗堿組脂肪細(xì)胞的PPARYmRNA較對(duì)照組低48 %，蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果也顯示小檗堿抑制 PPARy的表達(dá)[周麗斌，楊穎，唐金鳳，等.小檗堿對(duì)脂肪細(xì)胞糖代謝的影響.上海第二 醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2002，22 (5) :412-414]。而PPAR γ表達(dá)的增加，可以促進(jìn)葡萄糖的利用以 及胰島素的增敏[成峰，蔣華良，陳凱先，等.PPAR γ激動(dòng)劑的研究進(jìn)展.中國藥物化學(xué)雜 志2003，13(2) 110-118,124]劉毅，婁少穎，何燕銘，等.小檗堿對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增 殖及分化相關(guān)基因PPARy、C/EBPamRNA何蛋白表達(dá)的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志.2008， 28(11) 10051009，小檗堿使PPAR γ表達(dá)量減少82%。按BandScan5. 0，默認(rèn)值
經(jīng)內(nèi)參校正后結(jié)果表明，與生品黃連比較，酒蒸黃連使PPARY表達(dá)量增加17.02倍。以上文獻(xiàn)與試驗(yàn)的結(jié)果表明與生品黃連、小檗堿不同，酒蒸黃連明顯增加 PPAR y的表達(dá)，可以促進(jìn)葡萄糖的利用以及胰島素的增敏，有希望成為一類2型糖尿病治 療藥物。該試驗(yàn)說明，本發(fā)明萸炙黃連可作為胰島素增敏劑使用，胰島素增敏劑是指噻唑 烷二酮(TZDs)衍生物，又稱羅格列酮。1982年研究其降脂作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)還有減肥降低血 糖作用。其主要通過結(jié)合和活化過氧化物酶增殖物激活受體PPARy起作用，PPARy受體 被激活后通過誘導(dǎo)脂肪生成酶和與糖代謝調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞 的分化，并提高細(xì)胞對(duì)胰島素作用的敏感性，減輕胰島素抵抗，故被稱為胰島素增敏劑。(張 文，治療糖尿病藥物的發(fā)展歷史，《中國執(zhí)業(yè)藥師》，2008年2期)胰島素增敏劑除了包含胰 島素增敏劑激動(dòng)劑外，還包括維甲酸受體激動(dòng)劑，3 3受體激動(dòng)劑等(蔡小花，等，胰島素增 敏劑類糖尿病藥物研究進(jìn)展，懷化醫(yī)專學(xué)報(bào)，2002，1 (2)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，酒蒸黃連具有改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，增強(qiáng)脂肪細(xì) 胞對(duì)葡萄糖攝取和利用的能力，從體外細(xì)胞水平上具有改善胰島素抵抗的作用；同時(shí)，酒蒸 黃連在一定劑量下抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，提示酒蒸黃連在增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝 取的同時(shí)不會(huì)引起脂肪的聚集而造成體重增加，這對(duì)防治與胰島素抵抗相關(guān)的代謝綜合征 或并發(fā)癥具有一定的意義。試驗(yàn)例5酒蒸黃連提取浸膏對(duì)糖尿病整體動(dòng)物模型的影響表14整體動(dòng)物試驗(yàn)的設(shè)計(jì)劑量
16 1對(duì)小鼠正常血糖的影響(1)試驗(yàn)方法取ICR小鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分成7組，每組 12只，即正常對(duì)照組、二甲雙胍對(duì)照組、鹽酸小檗堿對(duì)照組、黃連生品組、酒蒸黃連高、中、低 劑量組。各組小鼠按表14設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥(每只小鼠定量0. 3ml)，每日1次，連續(xù)7天。 末次給藥后45min (禁食不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min離心lOmin，分離血清，按試 劑盒測(cè)定說明書測(cè)定小鼠空腹血糖(FBG)。(2)試驗(yàn)結(jié)果由表15結(jié)果可知，酒蒸黃連各劑量組均對(duì)正常小鼠空腹血糖(FBG)無明顯影響(P > 0. 05)。
表15對(duì)正常小鼠FBG的影響 2對(duì)高濃度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影響(1)試驗(yàn)方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分成8組，每 組12只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍對(duì)照組、鹽酸小檗堿對(duì)照組、黃連生品組、酒 蒸黃連高、中、低劑量組。各組小鼠按表14設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥(每只小鼠定量0. 3ml)，每日 1次，連續(xù)7天。第7天末次給藥后lOmin (禁食不禁水8h)，小鼠腹腔注射高濃度葡萄糖注 射液2g/kg(0. lml/只)復(fù)制模型，空白組給予等容積的生理鹽水。測(cè)定造模后120min的 血糖(Glu)。(2)試驗(yàn)結(jié)果由表16可知，與空白組相比較，模型組小鼠腹腔注射高濃度葡萄糖后立即引起空腹血糖急性升高。與模型組相比較，酒蒸黃連高、中劑量組均能明顯降低高濃葡萄糖引起的小鼠血 糖升高(P<0.01)；同時(shí)，與黃連生品相比較，酒蒸黃連的降糖作用明顯優(yōu)于黃連生品，且 作用優(yōu)于鹽酸小檗堿。表16對(duì)高濃度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影響 3對(duì)正常小鼠a -葡萄糖苷酶的抑制作用(1)試驗(yàn)方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分成8組，每組 12只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍對(duì)照組、鹽酸小檗堿對(duì)照組、黃連生品組、酒蒸 黃連高、中、低劑量組。各組小鼠按表14設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥(每只小鼠定量0.3ml)，每日1 次，連續(xù)7天。第7天，動(dòng)物禁食8h，測(cè)定小鼠空腹血糖(Omin)，測(cè)定后各組小鼠給藥1次， 并立即灌服蔗糖溶液5g/kg(50g-100ml，0. 3ml/只)復(fù)制模型，空白組給予等容積的生理鹽 水。測(cè)定灌胃前(Omin)及灌胃后30，60及120min血糖，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血糖的變化率，采用 近似梯形的計(jì)算公式計(jì)算曲線下面積(AUC)。(2)試驗(yàn)結(jié)果
表17對(duì)正常小鼠a-葡萄糖苷酶的影響 由表17結(jié)果可知，酒蒸黃連高劑量組和鹽酸小檗堿組能明顯抑制灌服蔗糖引起的血糖升高(P < 0. 05-0. 01)，作用與阿卡波糖相似，表明藥物對(duì)α -葡萄糖苷酶有一定的 抑制作用，可能與抑制淀粉類碳水化合物的吸收，降低餐后血糖相關(guān)，其作用可能是酒蒸黃 連治消渴的途徑之一。4對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠糖異生的影響(1)試驗(yàn)方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分成8組，每組 10只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍對(duì)照組、鹽酸小檗堿對(duì)照組、黃連生品組、酒蒸 黃連高、中、低劑量組。試驗(yàn)前小鼠禁食18h(建議前1日下午3點(diǎn)禁食，第2日早晨9點(diǎn)造 模)。第2日早晨小鼠尾靜脈注射的四氧嘧啶溶液60mg/kg造模，注射后4h模型小鼠灌胃 50%葡萄糖，0.4ml/只。造模次日，除空白組和模型組外，其余各組按表14劑量灌胃給藥 (每只小鼠定量0. 3ml)，每日1次，連續(xù)7天。第7天末次給藥后45min(禁食不禁水8h)， 腹腔注射L-丙氨酸(2g/kg)，測(cè)定注射前(Omin)及注射后60及120min血糖，采用近似梯 形的計(jì)算公式計(jì)算AUC。(2)試驗(yàn)結(jié)果由表18可知，與空白組比較，模型組小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶72h后，均出現(xiàn)多 食、多飲、多尿等癥狀，模型組空腹血糖含量明顯升高，表明四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型造 模成功，模型組腹腔注射L-丙氨酸后，血糖立即升高，模型組糖異生異常明顯(P < 0. 01)。與模型組比較，酒蒸黃連炮制品能明顯降低小鼠腹腔注射L-丙氨酸引起的血糖 升高(P < 0. 01)，表明藥物能減輕糖異生的異常，可能是酒蒸黃連治消渴的途徑之一。5對(duì)四氧嘧啶致糖尿病模型小鼠的影響(1)試驗(yàn)方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分成8組，每 組10只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍對(duì)照組、鹽酸小檗堿對(duì)照組、黃連生品組、酒 蒸黃連高、中、低劑量組。試驗(yàn)前小鼠禁食18h(建議前1日下午3點(diǎn)禁食，第2日早晨9點(diǎn) 造模)。第2日早晨小鼠尾靜脈注射的四氧嘧啶溶液60mg/kg造模，注射后4h模型小鼠灌 胃50%葡萄糖，0.4ml/只。造模次日，除空白組和模型組外，其余各組按表14劑量灌胃給 藥(每只小鼠定量0. 3ml)，每日1次，連續(xù)9天。⑵觀察指標(biāo)1)對(duì)小鼠葡萄糖糖耐量(OGTT)的影響第7天，動(dòng)物禁食8h，末次給藥后10分鐘，灌胃葡萄糖(3g/kg，10ml/kg)，測(cè)定灌 胃前(Omin)及灌胃后30，60及120min血糖，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血糖的變化率，采用近似梯形的 計(jì)算公式計(jì)算曲線下面積(AUC)。2)對(duì)小鼠血液生化的影響第9天末次給藥后120min(禁食不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min離心 lOmin，分離血清，按試劑盒測(cè)定說明書分別測(cè)定小鼠糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白 (GSP)、空腹血糖(FBG)、血乳酸(LD)、血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量。3)對(duì)小鼠肝組織肝糖原的影響小鼠處死后，迅速取出肝組織，稱重，轉(zhuǎn)移致液氮中凍存?zhèn)溆?。按肝糖原試劑盒說明書制備肝組織勻漿，測(cè)定小鼠肝糖原的含量。(3)試驗(yàn)結(jié)果1)對(duì)小鼠葡萄糖糖耐量(0GTT)的影響由表19可知，與空白組比較，模型組小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶72h后，均出現(xiàn)多 食、多飲、多尿等癥狀，模型組小鼠糖化血紅蛋白含量和空腹血糖含量明顯升高，表明四氧 嘧啶致小鼠糖尿病模型造模成功(P < 0. 01)。與模型組比較，酒蒸黃連炮制品能明顯降低小鼠糖耐量的異常(P < 0.01)，且隨 給藥時(shí)間的延長表現(xiàn)出一定的時(shí)效性。2)對(duì)小鼠血液生化的影響由表20可知，與空白組相比較，模型組小鼠糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白 (GSP)、空腹血糖(FBG)、血乳酸(LD)、血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量明顯升 高。與模型組相比較，酒蒸黃連能明顯或部分降低6恥、65 、？86、0)、1^和16的含量(P < 0. 05-0. 01)，改善糖尿病小鼠血液生化的異常。尤其酒蒸黃連能明顯降低模型小鼠血清 乳酸的異常，與陽性藥二甲雙胍增加血乳酸的作用相反，提示酒蒸黃連在降糖的同時(shí)不會(huì) 引起酮中毒的副作用。綜上所述，酒蒸黃連能通過減弱四氧嘧啶對(duì)胰島0細(xì)胞的損傷或改善受損傷的 3細(xì)胞的功能來發(fā)揮降血糖作用。小結(jié)酒蒸黃連具有明顯的改善糖尿病的作用，但對(duì)正常血糖無明顯影響，其作用 與改善胰島素抵抗，降低糖異生，抑制a “葡萄糖苷酶作用相關(guān)。試驗(yàn)例6酒蒸黃連提取浸膏對(duì)急性毒性試驗(yàn)表21藥物的分組及劑量設(shè)計(jì) ICR小鼠180只，雌雄各半，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為18組，分組及給藥劑量按表21 設(shè)計(jì)，每只小鼠均按20ml/kg給藥(禁食不禁水8h)，分別觀察小鼠給藥后14天內(nèi)出現(xiàn)的中 毒癥狀，死亡情況及死亡時(shí)間、體重變化及進(jìn)食情況，對(duì)死亡小鼠立即解剖，肉眼觀察記錄 主要損害的器官及病理變化情況，并將主要臟器保存于10%甲醛溶液中。最后清點(diǎn)各組動(dòng) 物的死亡數(shù)，計(jì)算出各藥物的LD5(i。(3)試驗(yàn)結(jié)果急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，生品黃連的LD5Q為4. 4679g/kg，依據(jù)《中國藥典2005版》
黃連人體臨床使用推薦最大量5g/天(人體質(zhì)量按60kg)計(jì)算，即0. 0833g/kg d，相當(dāng)于
人體用藥劑量的53. 6倍；酒蒸黃連的LD50為7. 5475g/kg，相當(dāng)于人體用藥劑量的90. 6倍，
接近于臨床安全劑量(相當(dāng)于人體的100倍)，黃連酒蒸炮制后毒性明顯降低。
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權(quán)利要求
一種酒蒸黃連炮制品，其特征在于它是將黃酒或白酒加入生黃連中蒸制而成，制備的黃連炮制品的指紋圖譜如圖1所示，主要指標(biāo)成分包括藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿及其以上生物堿成分的鹽酸鹽，其中，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為4-7∶5-9∶11-17∶23-35∶23-27∶100。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酒蒸黃連炮制品，其特征在于藥根堿、非洲防己堿、表小檗 堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為4. 7-6. 8 5.7-8.3 11.5-16.7 23.9-34.5 2 3.4-26.5 100。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃連炮制品，其特征在于所述的藥根堿、非洲防己堿、表小 檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為5. 6 7. 1 14. 8 31.0 24.5 100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的黃連炮制品，其特征在于它是由如下方法制備 而成取凈黃連，加黃酒或白酒悶潤1-6小時(shí)，加熱蒸制3 8小時(shí)，取出，干燥，即得，其中 黃連與黃酒或白酒的用量配比為黃連100份、黃酒或白酒20 120份。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃連炮制品，其特征在于所述的酒蒸黃連的炮制工藝中，每 100份黃連，用黃酒或白酒40份拌勻，悶潤6小時(shí)，加熱蒸制8小時(shí)，取出，干燥。
6.一種制備權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的黃連炮制品的方法，它是由如下方法制備而 成取凈黃連，加黃酒或白酒悶潤1-6小時(shí)，加熱蒸制3 8小時(shí)，取出，干燥，即得，其中黃 連與黃酒或白酒的用量配比為黃連100份、黃酒或白酒20 120份。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃連炮制品的制備方法，其特征在于所述的酒蒸黃連的炮 制工藝中，每100份黃連，用酒40份拌勻，悶潤6小時(shí)，加熱蒸制8小時(shí)，取出，干燥。
8.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的酒蒸黃連炮制品在制備PPARY激動(dòng)劑的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的藥物是抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分 化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率的藥物或胰島素增敏劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其特征在于所述的藥物是降低血脂功能、改善 胰島素抵抗，降低糖異生的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療糖尿病及其并發(fā) 癥的藥物。
12.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的酒蒸黃連炮制品在制備a-葡萄糖苷酶抑制劑的藥 物中用途。
13.一種具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率的藥 物組合物，其特征在于它是由下述方法制備而成取權(quán)利要求1-4所述的酒蒸黃連，加水 煎煮1 3次，每次0. 5 3小時(shí)，每次加水量為6 10倍量，濾過，合并提取液，濃縮，備 用，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于它是由下述方法制備而成取酒 蒸黃連，加水煎煮3次，每次3小時(shí)，每次加水量為10倍量，濾過，合并提取液，濃縮，備用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑是口服制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酒蒸黃連，本發(fā)明還提供了該酒蒸黃連的制備方法和用途。本發(fā)明酒蒸黃連作為胰島素增敏劑及PPARγ激動(dòng)劑，具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率及降低血脂，改善胰島素抵抗和糖尿病藥物。本發(fā)明涉及的酒蒸黃連及其提取浸膏，制備，具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率或降低血脂功能及在改善胰島素抵抗或糖尿病藥物中的用途，具有明確的藥效，藥效優(yōu)于鹽酸小檗堿和生品黃連及其提取浸膏，安全性明顯優(yōu)于生品黃連。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101874832SQ20101017485
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者孟憲麗, 張藝, 李佳川, 賴先榮, 鄭海杰 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)