專利名稱：融合蛋白mbp-nap及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白MBP-NAP，此外， 還涉及該融合蛋白的制備方法以及其在增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)細(xì)胞因子分泌模式，⑶4+T細(xì)胞可分為Thl和Th2亞群，Thl/Th2細(xì)胞平衡對(duì) 整個(gè)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵性作用。Thl和Th2有拮抗作用，它們之間的不平衡會(huì)導(dǎo)致 不同類型的疾病發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Thl/Th2平衡紊亂與腫瘤、自身免疫性疾病、微生物感染、 移植排斥反應(yīng)等多種疾病有關(guān)。自Yamamura和Kharkevitch最早發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生時(shí)免疫反 應(yīng)向Th2漂移后，許多研究均證實(shí)，進(jìn)展期腫瘤病人外周血中往往呈Th2優(yōu)勢狀態(tài)，在抗腫 瘤免疫中起重要作用的Thl免疫卻受到抑制，因而設(shè)法逆轉(zhuǎn)Thl/Th2漂移方向，增強(qiáng)Thl免 疫，將成為腫瘤免疫治療的新手段。此外，在多數(shù)寄生蟲病中，Th2優(yōu)勢應(yīng)答可加重疾病，而 Thl應(yīng)答具有治療作用；過敏性疾病的發(fā)生與抗原特異性Th2優(yōu)勢應(yīng)答密切相關(guān)，因此有人 提出治療過敏性疾病用藥物誘發(fā)Thl優(yōu)勢應(yīng)答的途徑；在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及治 療中，Thl/Th2也有非常重要的作用。微生物在進(jìn)化中已經(jīng)形成了若干免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(H. Pylori, 簡稱HP)感染胃粘膜常常伴隨大量中性白細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤。HP超聲上清和水抽提物 當(dāng)中存在能趨化和激活中性白細(xì)胞及其它炎癥細(xì)胞的成分，Doyle J等首先從H. pylori中 純化出150kDa的蛋白質(zhì)分子，并證實(shí)這種分子及其15kDa的同源亞基能上調(diào)中性白細(xì)胞 表面CDllb/CD18表達(dá)，促進(jìn)中性白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，這種可溶性蛋白成分被命名為 幽門螺桿菌中性白細(xì)胞激活蛋白(H. pylori neutrophil-activating protein，HP-NAP)。 HP-NAP是幽門螺桿菌重要致病因子及免疫保護(hù)性抗原之一。Rossi G等報(bào)道HP-NAP與幽 門螺桿菌另外兩種毒力因子空泡素VacA和毒力相關(guān)蛋白CagA聯(lián)合使用能有效治療實(shí)驗(yàn)感 染H. pylori的比格狗，具有免疫治療作用。發(fā)明者利用自己純化的重組HP-NAP在小鼠和 豚鼠中也獲得了較高的抗H. pylori免疫保護(hù)效果。但利用HP-NAP改造融合蛋白增強(qiáng)Thl 細(xì)胞免疫的專利國內(nèi)外還未見報(bào)道。研究表明HP-NAP是一種TLR2 (Toll-like receptor 2)激動(dòng)劑，能夠誘導(dǎo)人類中 性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和IL-23，使宿主抗原特異性T細(xì)胞由Thl/Th2向Thl漂 移。在抗腫瘤免疫反應(yīng)，過敏性疾病和寄生蟲感染等疾病防治中具有廣泛的應(yīng)用前景。H. pylori培養(yǎng)條件苛刻，通過病原菌培養(yǎng)大量分離純化HP-NAP成本較高，HP-NAP 的編碼基因HP-napA存在于幾乎所有的H. pylori分離菌株中而且高度保守，本發(fā)明以天然 微生物毒力因子基因HP-napA為藥物設(shè)計(jì)母本，利用生物信息技術(shù)對(duì)HP-napA進(jìn)行功能預(yù) 測和序列改造，DNA重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌(E. coli)TBl中實(shí)現(xiàn)重組蛋白 的高效表達(dá)，篩選具有增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫活性的新型基因工程重組蛋白候選藥物。為開發(fā) Thl/Th2漂移相關(guān)疾病免疫調(diào)節(jié)劑提供技術(shù)路線和制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種融合蛋白MBP-NAP。本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供了該融合蛋白MBP-NAP的制備方法。本發(fā)明另一目的在于提供了該融合蛋白在增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案融合蛋白MBP-NAP，具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。上述融合蛋白MBP-NAP的制備方法，包括以下步驟(1)基因 HP-napA 的 PCR 擴(kuò)增根據(jù)H. pylori 26695和H. pylori J99全基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，所述引 物序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3 ‘以MEL-HP27基因組DNA為模板，擴(kuò)增包含基因HP-napA的DNA片段，PCR產(chǎn)物長 度為435bp ；(2)重組質(zhì)粒pNEB-napA的構(gòu)建PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒pNEB193經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，用Vitagene凝膠回收試劑 盒分別回收雙酶切片段，將兩者的雙酶切片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接；用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 TBl感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，小提質(zhì)粒，EcoR I和Sal I雙酶切，特異PCR方法鑒定陽性克 隆，得到含HP-napA的重組質(zhì)粒pNEB-napA ；(3)重組質(zhì)粒 pMAL-c2X_napA 的構(gòu)建重組質(zhì)粒pNEB-napA、表達(dá)載體pMAL_c2X經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，用 Qiaquick凝膠回收試劑盒分別回收napA基因片段、pMAL_c2X雙酶切片段；然后將兩片段 以1 6的摩爾比混合，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接；用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TBl感受態(tài)細(xì)胞，得到 E.coli TBlpMAL-c2X-napA ；(4)制備融合蛋白MBP-NAP大量誘導(dǎo)E. coli TBI pMAL-c2X-napA,超聲破碎，取上清液，上清經(jīng)硫酸銨沉淀得 粗提物，粗提物脫鹽，收集組分真空泵凍干保存即得。所述融合蛋白MBP-NAP在增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫方面的應(yīng)用。本發(fā)明有益效果本發(fā)明構(gòu)建的pMAL-c2X-napA表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了 HP-NAP與麥芽糖結(jié)合蛋白MBP在 大腸桿菌中的高效融合表達(dá)，經(jīng)篩選基因工程菌表達(dá)效率高達(dá)43%，可溶性產(chǎn)物占總誘導(dǎo) 表達(dá)蛋白的88 %。融合蛋白MBP-NAP表達(dá)量高達(dá)43. 31 %，而且主要以可溶性形式存在于 細(xì)胞質(zhì)中。將克隆化基因?qū)氪竽c桿菌malE基因下游用于表達(dá)融合蛋白的方法，對(duì)于病原 菌新抗原的純化、鑒定及功能分析都十分可取。由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由大腸桿菌序列所 控制，外源基因往往可以得到高效表達(dá)，且比天然蛋白更穩(wěn)定。蛋白質(zhì)MBP-NAP可以與直鏈 淀粉樹脂特異結(jié)合，通過親合層析濃縮樣品。MBP不僅可用于親合層析，還有商品化的MBP 抗血清，用于免疫反應(yīng)跟蹤鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這對(duì)一種新的重組蛋白鑒定尤為重要。MBP與 NAP之間有凝血因子Xa識(shí)別的四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg，可以在精氨酸后特異性地將NAP切下，產(chǎn)生天然蛋白質(zhì)分子，用于生物學(xué)功能研究。MBP-NAP比天然NAP分子更大，可以提 高NAP的免疫原性，而且在SDS凝膠電泳中易于鑒定，可將融合蛋白條帶切下，凍干后直接 用作抗原，制備NAP抗體。本發(fā)明制備的重組蛋白rHP-NAP作為幽門螺桿菌的抗原用于疫苗的研發(fā)已有所 報(bào)道(見鄭州大學(xué)2005年題目為幽門螺桿菌中性白細(xì)胞激活蛋白基因克隆表達(dá)及免疫評(píng) 價(jià)的博士論文，作者康巧珍)，但MBP-NAP作為一種廣譜基因工程Thl免疫增強(qiáng)劑國內(nèi)未見 同類專利報(bào)道。


圖1是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是本發(fā)明中重組質(zhì)粒pNEB-napA酶切鑒定圖譜；圖3是本發(fā)明中重組質(zhì)粒pMAL-c2X-napA酶切鑒定圖譜；圖4是本發(fā)明中重組質(zhì)粒pMAL-c2X-napA特異PCR鑒定圖譜；圖5是本發(fā)明E. coli. TBlpMAL-c2-napA可溶性蛋白2D電泳圖譜；圖6是本發(fā)明融合蛋白MBP-NAP的SDS-PAGE和Western blot鑒定圖譜；圖7是本發(fā)明2D SDS-PAGE分離MBP-NAP的Western blot鑒定圖譜；圖8是本發(fā)明增強(qiáng)Thl細(xì)胞因子分泌鑒定圖譜。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 此。一融合蛋白的制備(一)基因 HP-napA 的 PCR 擴(kuò)增根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(Naional Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)網(wǎng)站上公開發(fā)表的H. pylori 26695和H. pylori J99全基因組序 列，設(shè)計(jì)PCR引物，并在上游引物5'端引入限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)(劃線部分)和 保護(hù)堿基GGA，保留起始密碼子ATG;在下游引物5'端引入Sal I酶切位點(diǎn)(劃線部分)和 保護(hù)堿基AA，保留終止密碼子TAA。所述引物序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3 ‘
下游引物 P2 5 ‘ -AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3 ‘引物由大連TaKaRa公司合成(2個(gè)0D)。以H. pylori臨床分離株MEL-HP27基因組DNA為模板，擴(kuò)增克隆包含HP-NAP編碼 基因HP-napA的DNA片段，PCR目的基因產(chǎn)物長度為435bp。分離株MEL-HP27在題目為幽門螺桿菌中性白細(xì)胞激活蛋白基因克隆表達(dá)及免疫 評(píng)價(jià)的博士論文中公開過，公眾可通過鄭州大學(xué)生物工程系獲取該分離株。PCR擴(kuò)增體系共50 μ 1，其中Pyrobest高保真DNA聚合酶(TaKaRa生 產(chǎn))0. 25 μ 1(1. 25U)，H. pylori DNA 2 μ 1(1 μ g)，10 X PCR Buffer5μ 1，dNTPs(TaKaRa 生 產(chǎn))4μ 1(各200μΜ)，上、下游引物各1μ 1(0.5μΜ)，再用Mi 11 iQ_H20 (超純水)將反應(yīng)體 系補(bǔ)充至50 μ 1。
PCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 50s，50°C退火 30s，72°C延伸 50s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min即得PCR產(chǎn)物。( 二 )重組質(zhì)粒pNEB-napA的構(gòu)建(I)PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，用Vitagene凝膠回收試劑盒(杭州維 特潔生化技術(shù)有限公司)回收雙酶切片段。(2)作為克隆載體的質(zhì)粒pNEB193 (英國NEB公司)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后， 用Vitagene凝膠回收試劑盒回收雙酶切片段。(3)將上述的雙酶切片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。用連接產(chǎn)物與25 μ ITBl感 受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5min，加熱到42°C保持2min，然后加入100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，置于 37°C水浴中20min，玻棒涂布于含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)12h，藍(lán) 白斑篩選，小提質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶酶切和特異PCR方法(引物與融合蛋白制備中，基因 HP-napA的PCR擴(kuò)增所使用的上、下游引物相同)鑒定陽性克隆，得到含HP-napA的重組質(zhì) 粒 pNra-napA。所述LB液體培養(yǎng)基為lg胰蛋白胨(0X0ID公司)、lg氯化鈉、0.5g酵母浸出粉 (0X0ID公司)，加入IOOml蒸餾水中，調(diào)pH至7. 2，121°C高壓滅菌20min即得。所述LB平 板為在IOOmlLB液體培養(yǎng)基中加入1. 5g瓊脂粉(0X0ID公司)，121°C高壓滅菌20min，冷 卻至60°C左右時(shí)傾倒平板即得。(三)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-napA的構(gòu)建(1)重組質(zhì)粒pNEB-napA經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，用Qiaquick凝膠回收試劑 盒(Qiagen生產(chǎn))回收napA基因片段；(2)作為原核表達(dá)載體的質(zhì)粒pMAL_c2X (英國NEB公司)經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切 后，用Qiaquick膠回收試劑盒回收pMAL_c2X雙酶切片段；(3)將napA基因片段和pMAL_c2X雙酶切片段以1 6的摩爾比混合，用T4DNA連 接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物與25 μ ITBl感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5min，加熱到42°C保持2min， 加入100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，置于37°C水浴中保持20min，然后玻棒涂布于含100 μ g/ml氨 芐青霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)12h。(四)制備融合蛋白MBP-NAP(I)E. coli TBI pMAL-c2X_napA 的大量誘導(dǎo)及超聲破碎取上述37°C培養(yǎng)12h的菌液10ml，倒入IOOOml含100 μ g/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基 中(培養(yǎng)基中含0. 02%葡萄糖)，37°C恒溫?fù)u床，230r/min培養(yǎng)至2 X IO8細(xì)胞/ml時(shí)，加入 IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至終濃度為0. 3mM，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h。4°C條件下 4000g/min離心20min收集細(xì)菌，棄去上清。將細(xì)菌重懸于50ml Column Buffer (含20mM pH 值 7. 4 的 Tris-HCl 緩沖溶液，200mM NaCl, ImM EDTA, IOmM β-巰基乙醇)中。_20°C 凍 存12h后，在冷水中解凍，然后將樣品置于冰水浴中，進(jìn)行超聲破碎。粉碎條件為300W超 聲15s，間歇15s，超聲30次至菌液清亮，9000g/min4°C離心30min。(2)粗提物制備取50ml上述離心后的上清液，將其放在磁力攪拌器上攪拌，并逐滴加入等體積過 飽和硫酸銨溶液，4°C靜置30min后，4000g/min離心30min，沉淀即為粗提物，-20°C凍存。(3)脫鹽
用Column Buffer 重懸粗提物，濃度調(diào)為 lmg/ml，HiPr印 Desalt 5ml 柱在 FPLC 系統(tǒng)控制下快速脫鹽，上樣量為每次2ml，流速設(shè)4ml/min，自動(dòng)收集峰組分(2ml)，收集組 分真空泵凍干保存，即得融合蛋白MBP-NAP。二、實(shí)驗(yàn)測定1、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)取5 μ 1 PCR產(chǎn)物與0. 5 μ 1 IOX溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，于含有5 μ g/ml溴化乙 錠的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓5V/cm，用IOObp DNA ladder做分子量標(biāo)記，電泳緩 沖液為IXTAE，凝膠圖像掃描儀分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。圖1中，帶1 IOObp的DNA ladder ； 帶2 3 =PCR產(chǎn)物HP-napA。圖中顯示出PCR產(chǎn)物為435bp，為目的產(chǎn)物HP-napA。2、重組質(zhì)粒pNEB-napA的測定實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒pNEB-napA 轉(zhuǎn)化的 TBl 菌液在含 40 μ 1 X-gal (20mg/ml)、4 μ 1 IPTG(200mg/ml)和100 μ g/ml氨卞青霉素的LB平板上培養(yǎng)12_16h，篩選白色單菌落，增 菌培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoR I和Sal I雙酶切后，在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，Ikb DNA ladder (6 μ 1)作相對(duì)分子量標(biāo)記，重組質(zhì)粒pNEB-napA酶切鑒定圖譜見圖2。圖 2 中，帶 1 :1Kb DNA ladder,帶 2 :pNEB_napA 雙酶切，帶 3 :pNEB193 雙酶切，帶 4 =PCR產(chǎn)物。重組質(zhì)粒pNEB-napA經(jīng)雙酶切后，分別在435bp和2. 7kb的位置出現(xiàn)特異條 帶，與PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pNEB193的雙酶切產(chǎn)物位置相對(duì)應(yīng)(分別為435bp和2. 7kb)，說明重 組質(zhì)粒pNEB-napA中已插入HP-napA片段。3、重組質(zhì)粒pMAL-c2X_napA的測定實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒pMAL-c2X_napA轉(zhuǎn)化TBl感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含100 μ g/ml氨卞青 霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12h，篩選陽性克隆子，提取質(zhì)粒，酶切鑒定圖譜見圖3。圖3中， 帶 1 :IKbDNA Ladder ；帶 2 :pMAL-c2X_napA 經(jīng) Ε· coRI 酶切；帶 3 :pMAL-c2X_napA 經(jīng) EcoR I 和 Sal I 雙酶切；帶 4 :pMAL-c2X 經(jīng) E. coRI 酶切；帶 5 HP-napA PCR 片段。pMAL-c2X_napA 經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，1 %瓊脂糖電泳檢測，分別在HP-napA和pMAL_c2X片段的位 置出現(xiàn)特異條帶，證明HP-napA已經(jīng)以正確的閱讀框架定向插入pMAL_c2X質(zhì)粒的tac啟動(dòng) 子下游。 以重組質(zhì)粒pMAL-c2X-napA為模板，用HP-napA的特異性引物(即與融合蛋 白制備中，基因HP-napA的PCR擴(kuò)增所使用的上、下游引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重組質(zhì)粒 pMAL-c2X-napA的特異PCR鑒定圖譜見圖4。圖4中，帶1 :100bp DNA Ladder ；帶2 4 以重組質(zhì)粒pMAL-c2X-napA為模板，PCR擴(kuò)增napA。結(jié)果表明所篩選的3個(gè)陽性克隆，在 435bp位置均擴(kuò)增出特異條帶，進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒中含有外源基因目的片段。4、融合蛋白MBP-NAP的鑒定E. coli. TBlpMAL-c2X-napA 可溶性蛋白 2D SDS-PAGE 電泳圖譜見圖 5。 PDQuest7. 32-D軟件分析MBP-NAP分子量約為59000，pi值約為5. 2與理論值一致。以兔抗MBP血清為第一抗體(1 1000)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為第 二抗體(1 5000)，分別對(duì)SDS-PAGE ID和2D電泳分離的MBP-NAP進(jìn)行Western blot鑒 定，結(jié)果見圖6、7。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出誘導(dǎo)表達(dá)量最高的蛋白能被MBP特異抗血清識(shí)別， 進(jìn)一步證實(shí)融合表達(dá)載體構(gòu)建成功，外源基因與MBP基因融合表達(dá)。5、融合蛋白MBP-NAP增強(qiáng)小鼠Thl細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)
使用ELISA試劑盒(BD Pharmingen生產(chǎn))檢測小鼠⑶4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-2和IFN γ的分泌情況。結(jié)果見圖8。由圖8可知，使用融合蛋白MBP-NAP刺激的Thl 細(xì)胞相關(guān)因子IL-2和IFNy分泌量明顯增高，Thl陽性細(xì)胞由原來的23%上升至37%。因 此，融合蛋白MBP-NAP可以增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫。
權(quán)利要求
1.融合蛋白MBP-NAP，具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述融合蛋白MBP-NAP的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)基因HP-napA的PCR擴(kuò)增根據(jù)H. pylori J99全基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，所述引物序列如下上游引物 P1 5 ‘ -GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3 ‘下游引物 P2 5 ‘ -AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3 ‘以MEL-HP27基因組DNA為模板，擴(kuò)增包含目的基因HP-napA的DNA片段，HP-napA基 因長度為435bp ；(2)重組質(zhì)粒pNEB-napA的構(gòu)建PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒pNEB193經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，用Vitagene凝膠回收試劑盒 分別回收雙酶切片段，將兩者的雙酶切片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接；用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TBl 感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，小量提質(zhì)粒，EcoR I和Sal I雙酶切，特異PCR方法鑒定陽性克 隆，得到含HP-napA的重組質(zhì)粒pNEB-napA ；(3)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-napA的構(gòu)建重組質(zhì)粒pNEB-napA、表達(dá)載體pMAL_c2X經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，用Qiaquick 凝膠回收試劑盒分別回收雙酶切片段；然后將兩片段以1 6的摩爾比混合，用T4DNA連接 酶進(jìn)行連接；用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TBl感受態(tài)細(xì)胞，得到E. coli TBI pMAL-c2X-napA ；(4)制備融合蛋白MBP-NAP大量誘導(dǎo)E. coli TB lpMAL-c2X-napA，超聲破碎，取上清液，硫酸銨沉淀法得粗提物， 粗提物脫鹽，收集組分真空泵凍干保存即得。
3.權(quán)利要求1所述融合蛋白MBP-NAP在增強(qiáng)Thl細(xì)胞免疫方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白MBP-NAP，它的氨基酸序列如SEEQ ID NO.1所述。此外，本發(fā)明還公開了該融合蛋白MBP-NAP的制備方法，該方法具有操作簡便、條件溫和等特點(diǎn)，本發(fā)明所述融合蛋白MBP-NAP通過增強(qiáng)Th1細(xì)胞免疫，使其相關(guān)細(xì)胞因子IL-2和IFNγ的分泌量明顯增高，從而增強(qiáng)Th1免疫。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102002106SQ20101017787
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者劉偉, 周晴晴, 康巧珍, 段廣才, 汲振余, 祁元明, 高艷鋒 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)