專利名稱：微波促進(jìn)固相合成苦瓜mc-jj0106多肽類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MC-JJ0106多肽類似物及其微波促進(jìn)固相合成方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是當(dāng)今危害人類健康的重要疾病，目前全世界約有5% -7%的人受糖尿病 困擾，被認(rèn)為是繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后，導(dǎo)致人類傷殘、死亡的第三大殺手。糖尿病分為I型和II型，I型糖尿病是一種自身免疫疾病，患者的存活需要注射 胰島素。II型糖尿病占眾多糖尿病患者總數(shù)的95%左右。II型糖尿病的原因是胰島細(xì)胞 代謝發(fā)生障礙，胰島素分泌不足，或者產(chǎn)生胰島素抵抗，是以胰島素抵抗為主伴胰島素分泌 相對(duì)不足，或者以胰島素分泌相對(duì)不足為主伴胰島素抵抗導(dǎo)致的代謝性疾病。胰島素分泌 不足，或者產(chǎn)生胰島素抵抗都可造成血液中葡萄糖過量，當(dāng)血糖含量超過腎閾時(shí)，葡萄糖就 轉(zhuǎn)移到尿中排出，從而產(chǎn)生葡萄糖尿?？喙?Momordica charantia)是一種人類有長期安全食用歷史的蔬菜。近二十年 來，人們?cè)诳喙系墓麑?shí)中發(fā)現(xiàn)了許多具有降血糖活性的成分，其中的多肽成分逐漸得到人 們的認(rèn)識(shí)并得到一些運(yùn)用，但是由于苦瓜多肽的提取分離過于復(fù)雜，成本較高又難于得到 純的多肽，現(xiàn)在我們運(yùn)用現(xiàn)代多肽合成技術(shù)能夠解決這一問題。多肽可以通過基因工程的方法或者化學(xué)合成的方法得到?；蚬こ痰姆椒ㄔ讷@取 長肽(氨基酸殘基長度大于50)或蛋白質(zhì)上比化學(xué)方法有優(yōu)勢，但是多肽的化學(xué)合成方法 尤其是在固相合成策略出現(xiàn)后，在制備氨基酸殘基長度小于40的多肽或小肽上有基因工 程方法難以比擬的靈活性、多樣性和高效性等。1963年Merrifield創(chuàng)立并開發(fā)了固相合成 多肽的方法。固相多肽合成一般有兩種策略即Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略和Fmoc/ tBu正交保護(hù)固相合成策略，Merrifield創(chuàng)立的固相合成法即為Boc/Bzl正交保護(hù)固相合 成策略。但是，Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略中存在一些缺點(diǎn)，如副反應(yīng)多、條件苛刻以及 在延長肽鏈的過程中多肽鏈會(huì)從固相上丟失等。而隨后出現(xiàn)的Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合 成策略則反應(yīng)條件溫和的多。當(dāng)近年來微波技術(shù)運(yùn)用于多肽的固相合成中后，使多肽的合 成技術(shù)產(chǎn)生了一個(gè)飛躍。微波促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)是由于其使極性分子在微波場中快速旋轉(zhuǎn)，使 得一些反應(yīng)速率較常規(guī)加熱方法快10到1000倍，而且產(chǎn)率大大提高。1986年Gedye等人 首次報(bào)道了將微波應(yīng)用于有機(jī)合成中，微波可以促進(jìn)許多化學(xué)反應(yīng)，如Diels-Alder反應(yīng)， 皂化反應(yīng)等，可以顯著地加快反應(yīng)速率并提高收率。在1992年，Hui-ming Yu等首先報(bào)道 了將微波應(yīng)用于多肽固相合成領(lǐng)域中，他們完成了?；d體蛋白片斷十肽(acyl carrier protein, ACP 65 74)的合成。如何高效的合成長肽(大于30肽)在世界上仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槎嚯碾S著肽鏈 的增加，其合成難度成倍增加。用傳統(tǒng)的固相方法合成長肽，其收率往往很低雜質(zhì)較多純化 困難，從而從實(shí)用的角度上說失去了合成的意義。其次合成周期長，在中間不出現(xiàn)困難肽序 的情況下30肽一般需要近一個(gè)星期時(shí)間才能完成合成周期，如果出現(xiàn)困難肽序，往往就無 法合成得到目標(biāo)多肽。而使用微波促進(jìn)固相合成多肽，可以克服困難肽序，合成傳統(tǒng)固相方法無法得到的多肽，而且合成時(shí)間大大縮短，且顯著提高多肽粗品純度及收率，使得產(chǎn)品的 純化大大方便，只要經(jīng)過一次制備型HPLC就能得到純度較高的產(chǎn)品；此外還可以非常方便 的用D型氨基酸及非天然氨基酸等對(duì)多肽進(jìn)行定點(diǎn)修飾，去尋找活性更高、生物半衰期更 長的多肽，這更是基因工程技術(shù)無法做到的。因此，我們?cè)诳喙辖笛荕C-JJ0106多肽類似 物的合成中采用此種方法快速高效的合成得到MC-JJ0106系列類似物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明有兩個(gè)目的第一個(gè)母的是從具降血糖活性的藥食同源植物苦瓜中得到多 肽進(jìn)行修飾得到降血糖活性更高的MC-JJ0106多肽類似物。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了 MC-JJ0106衍生物的固相制備方法，本發(fā)明采用微 波促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略高效快速地合成得到系列MC-JJ0106類似物。其特征在于采用微波促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，于固相載體上先合 成得到載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護(hù)基得到 載有第一個(gè)氨基酸殘基的樹脂；再進(jìn)入下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護(hù)氨 基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護(hù)的步驟，依次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹 脂，最后用裂解劑將多肽從樹脂上切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相色譜純 化，凍干得多肽純品。載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂的制備方法，其特征是通過在微波照射條件 下Fmoc保護(hù)氨基酸先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入1-羥基_苯并 三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有機(jī)堿中和反應(yīng)的酸性。載有第一個(gè)Fmoc保護(hù) 氨基酸的樹脂所使用的固相載體是Rink樹脂、Wang樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂?；罨瘎?是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、N, N"-羰基二咪唑(⑶I)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N， N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或使用的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(H0SU)、1_羥 基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羥基-1，2，3-苯并三嗪_4 (3H)-酮(HOOBT)。有機(jī)堿 為三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)；微波促進(jìn)條件是微波頻率 2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時(shí)間為5 15min。Fmoc保護(hù)基的脫除是通過使用含有0. lmol. L—1的1_羥基-苯并三氮唑(HOBT)的 六氫吡啶溶液在微波促進(jìn)下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亞砜(DMSO)、或N-甲基 吡咯烷酮(NMP)為反應(yīng)溶劑。微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C， 反應(yīng)時(shí)間為1 IOmin。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.提出的一種MC-JJ0106類似物可以在保留降糖活性的基礎(chǔ)上，提高M(jìn)C-JJ0106 的穩(wěn)定性，延長作用時(shí)間。2.微波促進(jìn)固相合成MC-JJ0106類似物大大的提高了偶合反應(yīng)速率，常規(guī)固相合 成方法充分偶合一個(gè)氨基酸到樹脂上去，往往需要2小時(shí)到20小時(shí)不等，甚至更長。而微 波促進(jìn)則平均只需要10分鐘左右；常規(guī)固相合成方法脫Fmoc保護(hù)基，往往需要30分鐘到 1小時(shí)不等，而微波促進(jìn)則平均只需要5分鐘左右，這極大的提高了多肽合成的效率，縮短
5了合成周期。3.微波促進(jìn)固相合成MC-JJ0106類似物合成得到的粗品的純度大于80%，較常規(guī) 固相合成方法大大提高，這方便了后續(xù)的純化工作，只需要經(jīng)過一次制備液相純化，凍干即 可得到目標(biāo)純品。4.微波促進(jìn)固相方法合成MC-JJ0106類似物，其成本低，由于偶合效率較高，所需 要保護(hù)氨基酸平均只需要2倍過量，較常規(guī)固相合成方法需要4到5倍過量大為降低。5.微波促進(jìn)固相合成MC-JJ0106類似物方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、大規(guī)模化，這使其 更適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此用本發(fā)明提供的微波促進(jìn)固相合成技術(shù)制備的MC-JJ0106類似物，收率高、 合成周期短、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動(dòng)化生產(chǎn)。制備得到的MC-JJ0106類 似物，比天然MC-JJ0106更加穩(wěn)定，適合作為治療糖尿病藥物的活性成分。
具體實(shí)施例方式在本說明書全文中采用以下縮寫Et3N 三乙胺；NMM =N-甲基嗎啉；DIEA :N，N，- 二異丙基乙胺；DMF 二甲基甲酰胺； DM SO 二甲亞砜；DCM 二氯甲烷；Fmoc :N_9芴甲氧羰基；DIC =N, N，-二異丙基碳二亞胺； CDI :N，N’-羰基二咪唑；DMAP :4_ 二甲氨基吡啶；HOSU :N_羥基琥珀酰亞胺；EDC. HCl 乙 基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；HATU 2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N，，N，-四 甲基脲六氟磷酸酯；HBTU 苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU :6_氯苯 并三氮唑_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT 羥基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT 羥 基-苯并三氮唑；PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC 高效液相色 譜；ESI-MS 電噴霧質(zhì)譜；Gly 甘氨酸；Ser 絲氨酸；Ala 丙氨酸；Thr 蘇氨酸；Val 纈氨 酸；Ile 異亮氨酸；Leu 亮氨酸；Tyr 酪氨酸；Phe 苯丙氨酸；His 組氨酸；Pro 脯氨酸； Asp 天門冬氨酸；Met 蛋氨酸；Glu 谷氨酸；Trp 色氨酸；Lys 賴氨酸；Arg 精氨酸。Asn 天冬酰胺；Gln 谷氨酰胺。本發(fā)明是通過下列實(shí)施列來進(jìn)行說明的，但這些實(shí)施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。實(shí)施例1Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser (SEQ. ID NO 2)的微波促進(jìn)固相合成(1)樹脂的溶脹稱取Fmoc-rink amide-MBHA Resin 50mg (取代量 0. 4mmol/g)，經(jīng) 7mL DCM 溶脹 30min，抽濾去DCM，再用IOmL NMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM, NMP 7mL沖洗干凈。(2)微波促進(jìn)Fmoc保護(hù)基的脫除將溶脹好的樹脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0. IM HOBT的25%哌啶/NMP (V/V)溶 液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)lmin，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在50°C以內(nèi)，使用空氣壓縮 機(jī)壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含0. IM HOBT的25%哌啶/NMP (V/V)溶 液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機(jī)壓 縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護(hù)基的 樹脂。
(3)微波促進(jìn) Fmoc-Ala-rink amide-MBHA Resin 的合成將Fmoc-Ala-OH (0. 04mmol)，HBTU (0. 04mmol)，HOBT (0. 04mmol)禾口 DIPEA(0. 08mmol)溶于IOmL NMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng) 7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后 濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹脂3次。(4)偶合效率的檢測用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下 一個(gè)偶合循環(huán)。茚三酮法取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、 KCN吡啶溶液(2ml 0. 00IMKCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加 熱5分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽性。溴酚蘭法取少量樹脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴的 溴酚藍(lán)二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹脂顯藍(lán)色即為陽性。(5)肽鏈的延長按照Ala2-MC-JJO 106- (1 21) -NH2的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步 驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進(jìn)反應(yīng)時(shí)間5 20min不等。得到連有 Ala2-MC-JJ0106-(l 21)-NH2 的樹脂。(6)樹脂上多肽的裂解將上述得到的連有Ala2-MC-JJO 106-(1 21)_NH2的樹脂放入反應(yīng)瓶中，各加入 裂解劑 Reagent K (TFA/苯甲硫醚 / 水 / 苯酚/EDT，82. 5 5 5 5 2. 5, V/V) IOmL, 先在0°C下振搖30min，再在常溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次， 合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品。 最終得到 Gly8-GLP-(7 36)-NH2 粗品 63. 2mg，收率為 94. 3%0(7) Ala2-MC-JJ0106-(1 21)_NH2 粗品的純化將上面得到的Ala2-MC-JJ0106_(1 21)_NH2粗品，溶于少量的水中，用島津制 備型反相HPLC純化粗品。純化中采用C18反相制備柱(340mmX28mm，5ym)；流動(dòng)相A: 0. 1 % TFA/水(V/V)，流動(dòng)相B 0. 1% TFA/乙腈(V/V)；流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B 13 % 15 %， 30min ；流速為6mL/min ；檢測波長為214nm。收集的溶液凍干得純品，最終得到純品29. 7mg。 理論相對(duì)分子質(zhì)量 849. 9ESI-MSm/z found [M+3H] 3+284. 2，[M+4H]4+213. 5，[M+5H] 5+171. 2 ； calu[M+3H]3+284. 3，[Μ+4Η]4+213· 5，[M+5H] 5+171. 0實(shí)施例2 41根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實(shí)施例2 40的多肽，通過 電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。實(shí)施例2Pro-(D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser (SEQ. ID NO 3)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 849. 9ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+284. 3, [M + 4H] 4+213. 6, [M + 5H] 5+171. 1 ； calu[M+3H]3+284. 3，[Μ+4Η]4+213· 5，[M+5H] 5+171. 0實(shí)施例3
Pro-Ala-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala-Ser (SEQ. ID NO 4)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 849. 9ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+284. 2, [M + 4H] 4+213. 5, [M + 5H] 5+171. 0 ； calu[M+3H]3+284. 3，[Μ+4Η]4+213· 5，[M+5H] 5+171 0實(shí)施例4Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-(D-Ala)-Ala-Ser (SEQ. ID NO 5)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 849. 9ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+284. 3, [M + 4H] 4+213. 3, [M + 5H] 5+171. O ； calu[M+3H]3+284. 3，[M+4H]4+213. 5，[M+5H] 5+171. O實(shí)施例5Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-(D-Ala)-Ser (SEQ. ID NO 6)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 849. 9ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+284. 3, [M + 4H] 4+213. 3, [M + 5H] 5+171. O ； calu[M+3H]3+284. 3，[M+4H]4+213. 5，[M+5H] 5+171. O實(shí)施例6Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Gly-Ser (SEQ. ID NO :7)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 835. 9ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+279. 6 , [M + 4H] 4+210. 2, [M + 5H] 5+168. O ； calu[M+3H]3+279. 6，[M+4H]4+210. 0，[M+5H] 5+168. 2實(shí)施例7Pro-Ala-Cys-Tyr-Ile-Ser-Ala-Cys-Ser (SEQ. ID NO 8)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 914. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+305. 6 , [M + 4H] 4+229. 4, [M + 5H] 5+183. 9 ； calu[M+3H] 3+305. 7，[M+4H]4+229.，5 [M+5H] 5+183. 8實(shí)施例8Pro-(D-Ala)-Cys-Tyr-Ile-Ser-Ala-Cys-Ser (SEQ. ID NO 9)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 914. 1ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+305. 7, [M + 4H] 4+229. 4, [M + 5H] 5+183. 9 ； calu[M+3H] 3+305. 7，[M+4H]4+229. 5[M+5H]S+183. 8實(shí)施例9Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Arg-Ser (SEQ. ID NO 10)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 935. OESI-MSm/z f oun d [M + 3H] 3+3 1 2. 7, [M + 4H] 4+234. 7, [M + 5H] 5+1 88. 2 ； calu[M+3H] 3+312. 7，[M+4H]4+234. 8[M+5H]5+188. O實(shí)施例10Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Met-Ser(SEQ. ID NO 11)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 910. OESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+304. 4 , [Μ + 4Η] 4+228. 6, [Μ + 5Η] 5+183. 1 ； calu[M+3H] 3+304. 3，[Μ+4Η]4+228. 5[M+5H]S+183. O
實(shí)施例11Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ser-Ser(SEQ. ID NO 12)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 866. 0ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+289. 4 , [M + 4H] 4+217. 6, [M + 5H] 5+174. 1 ； calu[M+3H] 3+289. 6，[M+4H]4+217. 5[M+5H]S+174. 2實(shí)施例12Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser(SEQ. ID NO 13)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 907. 0ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+303. 2, [M + 4H] 4+227. 6, [M + 5H] 5+182. 4 ； calu[M+3H] 3+303. 3，[M+4H]4+227. 8[M+5H]5+182. 4實(shí)施例13Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 14)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 964. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+322. 4 , [Μ + 4Η] 4+242· 1，[Μ + 5Η] 5+193. 8 ； calu[M+3H] 3+322. 4，[Μ+4Η]4+242. 0[Μ+5Η]5+193. 8實(shí)施例14Pro-(D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 15)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 964. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+322. 4 , [Μ + 4Η] 4+242· 1，[Μ + 5Η] 5+193. 8 ； calu[M+3H] 3+322. 4，[M+4H]4+242. 0[M+5H]5+193. 8實(shí)施例15Pro-Ala-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 16)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 964. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+322. 4 , [Μ + 4Η] 4+242· 1，[Μ + 5Η] 5+193. 8 ； calu[M+3H] 3+322. 4，[M+4H]4+242. 0[M+5H]5+193. 8實(shí)施例16Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Gly-Lys-Ser(SEQ. ID NO 17)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 893. 0ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+298. 7, [M + 4H] 4+224· 1，[Μ + 5Η] 5+179. 8 ； calu[M+3H] 3+298. 7，[M+4H]4+224. 2[M+5H]5+179. 6實(shí)施例17Pro-Ala-Ala-Tyr-Ile-Ser-Tyr-Lys-Ser (SEQ. ID NO 18)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 999. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+334. O , [Μ + 4Η] 4+250. 9, [Μ + 5Η] 5+200. 8 ； calu[M+3H] 3+334. 0，[Μ+4Η]4+250. 8[Μ+5Η]5+200. 8實(shí)施例18Pro-Gly-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 19)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 950. 1ESI-MSm/z f oun d [M + 3H] 3+3 1 7. 8 , [Μ + 4Η] 4+238. 6, [Μ + 5Η] 5+191. 2 ；
9calu[M+3H] 3+317. 7，[M+4H]4+238. 5[M+5H]5+191. 0實(shí)施例19Pro-Ser-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 20)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 980. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+327. 9 , [Μ + 4Η] 4+246. 0, [Μ + 5Η] 5+197. 0 ； calu[M+3H] 3+327. 7，[Μ+4Η]4+246. 0[Μ+5Η]5+197. 0實(shí)施例20Pro-Ala-Arg-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 21)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1049.2ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+350. 8 , [Μ + 4Η] 4+263. 3, [Μ + 5Η] 5+210. 7 ； calu[M+3H] 3+350. 7，[Μ+4Η]4+263. 3[Μ+5Η]5+210. 8實(shí)施例21Pro-Ala-Cys-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 22)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 996. 2ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+333. 2 , [M + 4H] 4+2 5 0 · 1，[M + 5H] 5+200. 2 ； calu[M+3H] 3+333. 1，[M+4H]4+250. 0[M+5H]5+200. 2實(shí)施例22Pro-Ala-Gly-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 23)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 950. 1ESI-MSm/z f oun d [M + 3H] 3+3 1 7. 7, [M + 4H] 4+238. 6, [M + 5H] 5+191. 1 ； calu[M+3H] 3+317. 7，[M+4H]4+238. 5[M+5H]5+191. 0實(shí)施例23Pro-Ala-His-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 24)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1030.2ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+344. 6 , [Μ + 4Η] 4+258. 6, [Μ + 5Η] 5+207. 2 ； calu[M+3H] 3+344. 4，[Μ+4Η]4+258. 5[M+5H]s+207. 0實(shí)施例24Pro-Ala-Tyr-Ilr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 25)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1056.2ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+353. 1 , [M + 4H] 4+265. 0, [M + 5H] 5+212. 3 ； calu[M+3H] 3+353. 1，[M+4H]4+265. 1 [M+5H] 5+212. 2實(shí)施例25Pro-Ala-Ser-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 26)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 980. 1ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+327. 7 , [M + 4H] 4+246· 1，[Μ + 5Η] 5+197. 0 ； calu[M+3H] 3+327. 7，[M+4H]4+246. 0[M+5H]5+197. 0實(shí)施例26Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Gly-Ser(SEQ. ID NO 27)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 928. O
ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+3 10. 3, [M + 4H] 4+2 3 3 · 1，[M + 5H] 5+1 86. 5 ； calu[M+3H] 3+310. 3，[M+4H]4+233. 0[M+5H]5+186. 6實(shí)施例27Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Cys-Ser(SEQ. ID NO 28)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1027. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+343. 4 , [Μ + 4Η] 4+257. 9, [Μ + 5Η] 5+206. 5 ； calu[M+3H] 3+343. 4，[Μ+4Η]4+257. 8[Μ+5Η]5+206. 4實(shí)施例28Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Arg-Ser(SEQ. ID NO 29)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1027. 1ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+343. 6 , [Μ + 4Η] 4+257. 9, [Μ + 5Η] 5+206. 5 ； calu[M+3H]3+343. 4，[Μ+4Η]4+257· 8[Μ+5Η]5+ 206.4實(shí)施例29Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Met-Ser(SEQ. ID NO 30)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1002. 1ESI-MSm/z found [M + 3H] 3+335. 1 , [M + 4H] 4+2 5 1 · 4，[M + 5H] 5+201. 5 ； calu[M+3H] 3+335. 0，[M+4H]4+251. 5[M+5H]5+201. 4實(shí)施例30Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ser-Ser(SEQ. ID NO 31)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 958. 0ESI-MSm/z f ound [M + 3H] 3+320. 4 , [Μ + 4Η] 4+240. 4, [Μ + 5Η] 5+192. 5 ； calu[M+3H] 3+320. 3，[Μ+4Η]4+240. 5[M+5H]S+192. 6實(shí)施例31Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser(SEQ. ID NO 32)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 999. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+334. 0，[M+4H]4+250. 7，[M+5H] 5+200. 6 ；calu [M+3H] 3+334 .0 [M+4H] 4+250. 8 [M+5H] 5+200. 8實(shí)施例32Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ. ID NO 33)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 1056.2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+353. 0，[M+4H]4+265. 1，[M+5H] 5+212. 3 ；calu [M+3H] 3+353 l[M+4H]4+265. 1 [M+5H] 5+212. 2實(shí)施例33Pro-Gly-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 34)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 950. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+317. 7，[M+4H]4+238. 4，[M+5H] 5+191. O ；calu [M+3H] 3+317 .7[M+4H]4+238. 5[M+5H]5+191. O實(shí)施例34Pro-Ser-(D-Ala)-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 35)；理論相對(duì)分子質(zhì)量 980. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+327. 7，[M+4H]4+246. 0，[M+5H] 5+197. 1 ； calu [M+3H] 3+327
7 [M+4H] 4+246. 0 [M+5H] 5+197· 0實(shí)施例35Pro-(D-Ala)-Arg-Tyr-Ile-Ser-LYs-Lys-Ser (SEQ. ID NO 36)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 1049.2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+350. 8，[M+4H]4+263. 2，[M+5H] 5+210. 9 ；calu [M+3H] 3+350 .7[M+4H]4+263. 3[M+5H]5+210. 8實(shí)施例36Pro-(D-Ala)-Cys-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 37)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 996. 2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+333. 2，[M+4H]4+250. 0，[M+5H] 5+200. 3 ；calu [M+3H] 3+333 .1 [M+4H]4+250. 0[M+5H]5+200. 2實(shí)施例37Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO :38)；理論相對(duì)分子 質(zhì)量950. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+317. 7，[M+4H]4+238. 5，[M+5H] 5+191. 1 ；calu [M+3H] 3+317 .7[M+4H]4+238. 5[M+5H]5+191. 0實(shí)施例38Pro-(D-Ala)-His-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 39)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 1030.2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+344. 4，[M+4H]4+258. 5，[M+5H] 5+207. 1 ；calu [M+3H] 3+344 .4 [M+4H] 4+246. 0 [M+5H] 5+207. 0實(shí)施例39Pro-(D-Ala)-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 40)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 1056.2ESI-MSm/z found [M+3H] 3+353. 1，[M+4H]4+265. 2，[M+5H] 5+212. 3 ；calu [M+3H] 3+353
l[M+4H]4+265. 1 [M+5H] 5+212. 2實(shí)施例40Pro-(D-Ala)-Ser-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-Ser (SEQ. ID NO 41)；理論相對(duì)分子質(zhì) 量 980. 1ESI-MSm/z found [M+3H] 3+327. 6，[M+4H]4+246. 2，[M+5H] 5+197. 1 ；calu [M+3H] 3+327
7 [M+4H] 4+246. 0 [M+5H] 5+197. 0實(shí)施例41MC-JJO106及其類似物體內(nèi)降糖活性實(shí)驗(yàn)取10周齡雄性昆明小鼠(體重18 22g)，隨機(jī)分組，每組6只。尾靜脈注射四 氧嘧啶給藥建模，給藥劑量為60mg/kg，72小時(shí)后，小鼠禁食5 6小時(shí)測血糖挑選血糖值 范圍在13 23的小鼠隨機(jī)分組，每組6只。成模后的小鼠lmg/kg連續(xù)給藥IOd腹腔注射 MC-JJ2多肽及其類似物。在0，30，60，90，120用血糖儀測定血糖值。
如表1所示，MC-JJ0106多肽及其類似物的降血糖活性強(qiáng)于二甲雙胍。表1MC-JJ0106及其類似物降血糖的效應(yīng)
權(quán)利要求
一種具有降血糖活性含有式I(SEQ.ID NO1)結(jié)構(gòu)的苦瓜MC JJ0106多肽類似物，得到的苦瓜MC JJ0106多肽類似物；其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式Pro Xaa1 Xaa2 Tyr Ile Ser Xaa3 Xaa4 Ser(SEQ.ID NO1)Xaa1Ala，D Ala，Gly或SerXaa2Ala，D Ala，Arg，Cys，Gly，Hi s，Lys，Met，Tyr或SerXaa3Ala，D Ala，Gly，Lys，Tyr或SerXaa4Ala，D Ala，Gly，Cys，Arg，Lys，Met或Ser
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，具有如下序列Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Ala-Ala-Ser(SEQ.IDNO2)Pro-(D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala--Ser(SEQ.IDNO3)Pro-Ala-(D-Ala)--Tyr-Ile-Ser-Ala-Ala--Ser(SEQ.IDNO4)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser- (D-Ala)-Ala--Ser(SEQ.IDNO5)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Ala-(D-Ala)--Ser(SEQ.IDNO6)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Ala-Gly-Ser(SEQ.IDNO7)Pro-Ala-Cys-Tyr--Ile-Ser-Ala-Cys-Ser(SEQ.IDNO8)Pro-(D-Ala)-Cys--Tyr-Ile-Ser-Ala-Cys-Ser(SEQ.IDNO9)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Ala-Arg-Ser(SEQ.IDNO10)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser—Ala—Met—Ser(SEQ.IDNO11)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Ala-Ser-Ser(SEQ.IDNO12)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Ala-Lys-Ser(SEQ.IDNO13)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO14)Pro- (D-Ala)-Ala-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO15)Pro-Ala-(D-Ala)--Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO16)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Gly-Lys-Ser(SEQ.IDNO17)Pro-Ala-A1a-Tyr--Ile-Ser-Tyr-Lys-Ser(SEQ.IDNO18)Pro-Gly-Ala-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO19)Pro-Ser-Ala-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO20)Pro-Ala-Arg-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO21)Pro-Ala-Cys-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO22)Pro-Ala-Gly-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO23)Pro-Ala-His-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO24)Pro-Ala-Tyr-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO25)Pro-Ala-Ser-Tyr--Ile-Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO26)Pro-Ala-Tyr-Tyr--Ile-Ser-Ala-Gly-Ser(SEQ.IDNO27)Pro-Ala-Tyr-Tyr--Ile-Ser-Ala-Cys-Ser(SEQ.IDNO28)Pro-Ala-Tyr-Tyr--Ile-Ser-Ala-Arg-Ser(SEQ.IDNO29)Pro-Ala-Tyr-Tyr--Ile-Ser—Ala—Met—Ser(SEQ.IDNO30)Pro-Ala-Tyr-Tyr--Ile-Ser-Ala-Ser-Ser(SEQ.IDNO31)Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile-Ser-Ala-Lys-Ser(SEQ.IDNO32)Pro-Ala-Tyr-Tyr-Ile--Ser-Lys-Lys-Ser(SEQ.IDNO33)Pro-Gly-(D-Ala)-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO34)Pro-Ser-(D-Ala)-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO35)Pro- (D-Ala)-Arg-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO36)Pro- (D-Ala)-Cys-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO37)Pro-(D-Ala)-Gly-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO38)Pro- (D-Ala)-His-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO39)Pro- (D-Ala)-Tyr-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO40)Pro- (D-Ala)-Ser-Tyr--Ile--Ser-Lys-Lys--Ser(SEQ.IDNO41)
3.—種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的MC-JJ0106多肽類似物或 者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
4.權(quán)利要求1中所述的MC-JJ0106多肽類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接 受的載體或稀釋劑在制備用于治療糖尿病的藥物中的運(yùn)用。
5.權(quán)利要求1中所述的MC-JJ0106多肽類似物的制備方法，其特征在于采用微波促 進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，于固相載體上先合成得到載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基 酸的樹脂，茚三酮法檢測為陰性后脫去Fmoc保護(hù)基得到載有第一個(gè)氨基酸殘基的樹脂；再 進(jìn)入下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護(hù)氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護(hù)的步驟，依 次延長所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹脂，最后用裂解劑將多肽從樹脂上 切割下來得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相色譜純化，凍干得多肽純品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進(jìn)固相合成MC-JJ0106多肽類似物方法，其特征是載 有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂的制備方法，是通過在微波照射條件下Fmoc保護(hù)氨基酸 先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)或其 衍生物抑制消旋，并使用有機(jī)堿中和反應(yīng)的酸性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹脂的制備方法，其特征在 于使用的固相載體是Rink樹脂、Wang樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂；使用的活化劑是二環(huán) 己基碳二亞胺(DCC)、N，N' - 二異丙基碳二亞胺(DIC)、N，N"-羰基二咪唑(⑶I)、1_乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'， N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)或6-氯苯并三氮唑_1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)；使用的1_羥基-苯并 三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)U-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT) 或3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮(HOOBT)；使用的有機(jī)堿為三乙胺(TEA)、N-甲基 嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA)；微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng)時(shí)間為5 15min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進(jìn)固相合成MC-JJ0106多肽類似物合成方法，其特征 是Fmoc保護(hù)基的脫除是通過使用含有0. lmol. L—1的1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)的六氫 吡啶溶液在微波促進(jìn)下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DM F)、二甲亞砜(DM SO)、或N-甲基吡咯 烷酮(NMP)為反應(yīng)溶劑；微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20 100°C，反應(yīng) 時(shí)間為1 IOmin。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型高效降血糖苦瓜MC-JJ0106多肽類似物及其微波促進(jìn)固相合成方法。通過對(duì)天然苦瓜多肽的2，3，7或8位點(diǎn)進(jìn)行改造得到具有更長藥理作用時(shí)間的MC-JJ0106多肽類似物；其化學(xué)合成是通過微波促進(jìn)固相合成方法而得以高效快速實(shí)現(xiàn)，粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相純化，最后凍干得到MC-JJ0106多肽類似物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101942010SQ20101017798
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者張惠斌, 杜闊, 王敬杰, 金晶, 錢海, 陳巍, 黃文龍 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)