專利名稱：透腦屏障防治老年性癡呆的融合多肽的制作方法
技術領域：
發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及能穿過血腦屏障、防治老年性癡呆的神經(jīng) 營養(yǎng)因子多肽類藥物。老年性癡呆是最常見的神經(jīng)退行性病，嚴重威脅人類健康的疾病，其病理學特征 是大量神經(jīng)元內(nèi)形成以過度磷酸化的微管相關蛋白tau為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結 (neurofibrillary tangles, NFTs)及由 β-淀粉樣多肽(β-amyloid, A β )沉積與神經(jīng)元 外形成的大量老年斑(senile plaques，SP)，同時伴有膽堿能神經(jīng)元數(shù)量、神經(jīng)元突觸數(shù)量 的大量減少，臨床上表現(xiàn)為進行性認知功能表減退。目前尚沒有針對老年性癡呆病理特征的治療藥物和方法。美國FDA通過治療老年 性癡呆的藥物主要有乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑和NMDA受體拮抗劑兩類，這兩類藥物僅 對中晚期老年性癡呆患者的癡呆癥狀有所輕度改善或延緩癡呆進展。因此研發(fā)新的針對老 年性癡呆病理學特征的藥物，成為全球的期待。大量研究資料已證實神經(jīng)營養(yǎng)因子具有神經(jīng)保護、防治老年性癡呆的作用。如神 經(jīng)生長因子(NGF)是研究得最早、最多的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。神經(jīng)元存活、生長、遷移、分 化，神經(jīng)元與其它神經(jīng)元建立功能性、結構性聯(lián)系，神經(jīng)元損傷后修復與再生，神經(jīng)元退行 性變性等過程均受到NGF的影響。NGF是典型的靶向性神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進神經(jīng)元分化、 維持神經(jīng)元的生長和功能、促進損傷后修復。給老年性癡呆模型大鼠腦內(nèi)注射NGF，阻止了 90-100%的膽堿能神經(jīng)元的丟失，并改善了大鼠的學習記憶能力。目前，神經(jīng)營養(yǎng)因子已作為外周神經(jīng)損傷治療藥物在臨床使用，作為蛋白類藥物， 由于其分子量大不能通過血腦屏障大大限制了其臨床應用價值，盡管有報道采用腦室穿刺 給藥，但這種方法因操作復雜且容易感染不被廣泛應用。因此，突破血腦屏障并定向作用于 神經(jīng)元將使神經(jīng)營養(yǎng)因子在腦內(nèi)發(fā)揮其完美的生物學效應。如何讓藥物進入中樞，是制約中樞藥物研發(fā)的瓶頸。神經(jīng)營養(yǎng)因子最有可能通過 特異性載體進入中樞。目前已知的載體存在著明顯的局限性和缺點。如TFR缺乏中樞定 向性并可引起免疫反應；0X26/8D3易導致免疫反應；M6P受體只在哺乳動物幼年才有表達； RAP易被體內(nèi)清除機制清除。2007年科學家發(fā)現(xiàn)了一種多肽(29肽)可攜帶治療性的小干 擾RNA穿過血腦屏障到達神經(jīng)細胞；而且多次治療不會引起免疫反應、產(chǎn)生肽的抗體；29肽 可在血液中穩(wěn)定存在8小時以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務是提供一種融合多肽，使其具有透腦屏障防治老年性癡呆的功能。實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是本發(fā)明提供的這種融合多肽，由神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段和29肽，以及位于 神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段和29肽中間的連接肽構成。所述的29肽的氨基酸序列為 YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；所述的連接肽的氨基酸序列為AGT ；所述的神經(jīng)營養(yǎng)因 子活性肽段可以是以下所述神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一種
(1)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) DPAKR或PAAKR ；(2)神經(jīng)生長因子(NGF)KGKE 或 TDEKQ ；(3)睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF) LFEKKL。所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段可來源于鼠、人或重組合成。制備本發(fā)明融合多肽的制備可以直接化學合成，也可以采用以下方法制備構建 神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段-連接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基 因的大腸桿菌表達載體以及神經(jīng)營養(yǎng)因子-29肽(YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGKRASNG)融合 基因的大腸桿菌定向多拷貝表達載體，在大腸桿菌中表達后純化。本發(fā)明提供的融合多肽利用29肽穿透血腦屏障的優(yōu)勢，使神經(jīng)營養(yǎng)因子在中樞 神經(jīng)元富集并發(fā)揮對老年性癡呆的防治作用。所構建的融合多肽保留了神經(jīng)營養(yǎng)因子的生 物學活性，能穿透血腦屏障直接作用于腦發(fā)揮防治作用本發(fā)明融合多肽能通過外周靜脈注 射的方式給藥，多次治療不會引起免疫反應、不會產(chǎn)生肽的抗體。本發(fā)明融合多肽可按以下方法制備1.構建神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段-連接肽(AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTPOTIFTNSRGKRASNG)融合基因的大腸桿菌表達載體以及神經(jīng)營養(yǎng)因子-連 接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基因的大腸桿菌定向多拷貝表 達載體，在大腸桿菌中表達、純化。2.直接化學合成神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段-連接肽(AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合多肽。由于神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段在氧化成環(huán)的情況下效能更高，因此，在融合多肽合 成過程中，本發(fā)明在神經(jīng)營養(yǎng)因子活性片段兩端設計加入了成環(huán)氨基酸C。以下為本發(fā)明實施例合成的融合多肽的氨基酸序列融合多肽① CDPAKRC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD IFTNSRGKRASNG,命名為 TNPCl ；融合多肽②CPAAKRC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD I FTNSRGKRASNG,命名為 TNPC2 ；融合多肽③CKGKEC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD I FTNSRGKRASNG,命名為 TNPC3 ；融合多肽④CTDEKQC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD IFTNSRGKRASNG,命名為 TNPC4 ；融合多肽⑤CLFEKKLC-AGT-YTI WMPENPRPGTPCD I FTNSRGKRASNG,命名為 TNPC5。本發(fā)明在AD細胞模型水平和AD動物模型水平對本發(fā)明融合多肽防治老年性癡呆 的功能進行了鑒定。實驗用本發(fā)明融合多肽由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?。實驗資料TNPCl對老齡鼠的神經(jīng)保護作用( 一)TNPCl的制備、純度及結構的鑒定TNPCl直接通過化學合成和純化，經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜分析(MS)得到 TNPCl的純度為91.9% (見圖1)，其分子量為4267.8Da(見圖2)。(二)TNPCl 功能鑒定1.實驗對象C57BL/6J小鼠(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重25_30g， 18-21月齡，雄性，隨機分為兩組對照組、外周給藥組，每組10只。2.實驗模型制備本實驗均采用自然老齡小鼠
對照組給予實驗組等量生理鹽水。外周給藥組通過腹腔注射給予TNPC1，隔天給藥一次持續(xù)一周。3.研究方法腦組織中信號轉(zhuǎn)導相關因子含量測定蛋白免疫印跡。大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡程度尼氏染色。4.實驗結果①蛋白免疫印跡免疫印跡的結果顯示，外周給藥組和對照組相比，MAPK家族的ERK和JNK分子被 明顯激活，P13K途徑的AKT分子明顯激活(見圖3)，激活的ERK、JNK和AKT能進一步激活 下游的細胞轉(zhuǎn)錄因子促進細胞的生長、增殖與分化。②尼氏染色將對照組和外周給藥組的腦片進行尼氏染色，40倍光學顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)發(fā) 現(xiàn)外周給藥組的神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯高于對照組(P < 0. 05)，提示TNPC1能進入中樞抑制 神經(jīng)元細胞的凋亡(見圖4)。TNPC5對AD大鼠模型的神經(jīng)保護作用1.實驗對象Wistar大鼠(華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重250g，雄性。 隨機分為5組正常(nor)組、模型(con)組、TNPC5大劑量(H-TNPC5)組、TNPC5小劑量 (L-TNPC5)組、NGF 組，每組 10 只。2.實驗模型制備WT+GFX側(cè)腦室注射正常組不做處理。模型組手術后不治療。 TNPC5組從術后開始，腹腔注射TNPC5 (H-TNPC5、L-TNPC5)，連續(xù)給藥7天。NGF組從術后開始，腹腔注射NGF，連續(xù)給藥7天。3.研究方法海馬STAT3、CTNFR的含量免疫印跡STAT3、CTNFR陽性細胞的顯示免疫組化4.實驗結果①Stat3免疫組化結果(見圖5)齒狀回該區(qū)顯色深淺依次為H-TNPC5組顯色強于NGF組，正常(nor)組次之，其 余依次為模型(con)組和L-TNPC5組；海馬正常(nor)組海馬神經(jīng)元排列致密，分層清晰，整齊有序。模型(con)組陽 性細胞數(shù)顯著減少，并且排列紊亂，CA2、CA3、CA4區(qū)可見明顯的數(shù)量較多的未著色的細胞。 NGF組陽性細胞排列較模型(con)組整齊，陽性細胞數(shù)增多，但著色比較淺。L-TNPC5組比 NGF組著色稍深，陽性細胞數(shù)與排列無顯著差異。H-TNPC5組著色最深，在某些區(qū)域(CA2、 CA4)比正常(nor)組深，但CA1、CA2、CA3、CA4區(qū)細胞排列不如正常(nor)組整齊有序。此外，在TNPC5大劑量(H-TNPC5)組可觀察到大量陽性的膠質(zhì)細胞，數(shù)量顯著多于 正常(nor)組、模型(con)組、TNPC5小劑量(L-TNPC5)組、NGF組。各組陽性的膠質(zhì)細胞數(shù) 量依次為:TNPC5大劑量(H-TNPC5)組，TNPC5小劑量(L-TNPC5)組與模型(con)組，正常
5(nor)組與NGF組。②Stat3免疫印跡結果(見圖6)圖6為海馬Stat3免疫印跡結果，圖*P < 0. 05，與正常組比較##P < 0. 01，與模型組比較 P < 0. 05，與 TNPC5 (小劑量)比較 P < 0. 05，與 NGF 組比較模型(con)組海馬stat3水平顯著低于正常(Nor)組(p < 0. 05)，NGF組、TNPC5 小劑量(L-TNPC5)組、TNPC5大劑量(H-TNPC5)組海馬stat3水平顯著高于模型(con)組 (p < 0. 01)，TNPC5 大劑量(H-TNPC5)組顯著高于 NGF 組、TNPC5 小劑量(L-TNPC5)組(p < 0. 05)，NGF組、TNPC5小劑量(L-TNPC5)組海馬stat3水平無顯著差異(p > 0. 05)。③CNTFR免化結果(見圖7)左圖顯示的是海馬40X放大結果，右圖顯示為齒狀回100X的放大結果。模型(con)組CA1和CA2區(qū)顯色強于正常(Nor)組，但CA3區(qū)顯色較正常(Nor) 組弱； L-TNPC5 (小劑量)組CA1和CA2區(qū)顯色強于NGF組； H-TNPC5 (大劑量)組CA1和CA2區(qū)顯色弱于NGF組；但較模型(con)組強。


圖1:HPLC 分析 TNPC1 純度為 91.9%。
圖2質(zhì)譜分析(MS)TNPCl分子量為4267. 8Da。
圖3:TNPC1激活腦組織中MAPK和PI3K途徑。
圖4:TNPC1能抑制神經(jīng)元細胞的凋亡。
圖5:Stat3免疫組化結果。
圖6海馬Stat3免疫印跡結果。
圖7:CNTFR免化結果。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明融合多肽的制備1.神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段-連接肽AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGKRASNG)融合基因的大腸桿菌表達載體以及神經(jīng)營養(yǎng)因子-連 接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基因的大腸桿菌定向多拷貝表 達載體。在大腸桿菌中表達、純化；或直接通過化學合成融合多肽。1. 1在人類基因庫中篩選目標神經(jīng)營養(yǎng)因子及其可能的活性片段；1. 2確定目標神經(jīng)營養(yǎng)因子及其可能的活性片段的序列；1. 3構建目標神經(jīng)營養(yǎng)因子及其可能的活性片段與-29肽的融合基因大腸桿菌表 達載體；1. 4構建目標神經(jīng)營養(yǎng)因活性片段與-連接肽(AGT)_29肽的大腸桿菌定向多拷貝表達載體1. 5在大腸桿菌中表達、純化。在大腸桿菌中表達目標神經(jīng)營養(yǎng)因子及其可能的活性片段與-29肽的融合基因；1. 6收獲、并純化上述融合肽；篩選高效定向多拷貝表達載體。2.直接化學合成神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段-連接肽AGT)_29肽 (YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合多肽。2. 1合成方法是用經(jīng)典的SPPS合成方法在合成時選用0. 21mmol/g的 Gly-ffangResin以5的投料比在0. lmmol的合成規(guī)模下進行，首先應用Asn的偶聯(lián)選用 HBTU、H0BT、DIEA反應，在茚檢呈透明時用DMF、甲醇和DMF洗滌，再選用20%六氫吡啶溶液 脫除Fmos并繼續(xù)用DMF、甲醇、二氯甲烷洗滌。重復偶聯(lián)和洗滌脫除Foms后依次偶聯(lián)剩余 氨基酸，在最后一個AA偶聯(lián)完全后脫除Fmoc并用DMF洗滌，最后用甲醇收縮，抽干樹脂。再 使用經(jīng)典裂解液裂解2h后用冰乙醚沉降即可獲得粗肽。2. 2純化方法應用30*250mm的C18色譜柱進行純化，其中A相選用0. 1 % TFA，B 相用100% ACN, 20ml/min的流速下在230nm下進行純化。
0093]
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0115]
0116] 0117]
序列表
<110>華中科技大學
<120>透腦屏障防治老年性癡呆的融合多肽
<130>/
<160>11
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>人工
<220>
<221>DISULFID <222>(1). . (7) <400>1
Cys Asp Pro Ala Lys 15
Glu Asn Pro Arg Pro 20
Gly Lys Arg Ala Ser 35
<210>2 <211>39 <212>PRT <213>人工 <220>
Arg Cys Ala Gly Thr Pro Asn Gly
Gly Thr Tyr Thr lie Trp 10
Cys Asp lie Phe Thr Asn 25
Met Pro 15
Ser Arg 30
70118]
0119]
0120] 0121] 0122]
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0154]
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0156]
<221>DISULFID <222>(1). . (7) <400>2
Cys Pro Ala Ala 1
Glu Asn Pro
Gly Lys
Arg 35
Arg 20 Ala
Lys Arg Cys Ala Gly Thr Tyr Thr lie Trp Met Pro
51015
Pro Gly Thr Pro Cys Asp lie Phe Thr Asn Ser Arg 2530
SerAsn Gly
<210>3 <211>38 <212>PRT <213>人工 <220>
<221>DISULFID <222>(1). . (6) <400>3
Cys Lys Gly Lys 1
Asn Pro Arg Pro 20
Lys Arg Ala Ser 35
<210>4 <211>39 <212>PRT <213>人工 <220>
<221>DISULFID <222>(1). . (7) <400>4
Cys Thr Asp Glu 1
Glu Asn Pro Arg 20
Gly Lys Arg Ala 35
<210>5 <211>40 Glu Cys Ala Gly Thr Tyr Thr lie Trp Met Pro Glu
51015
Gly Thr Pro Cys Asp lie Phe Thr Asn Ser Arg Gly
2530
Asn Gly
Lys Gin Cys Ala Gly Thr Tyr Thr
510
Pro Gly Thr Pro Cys Asp lie Phe 25
Ser Asn Gly
lie Trp Met Pro 15
Thr Asn Ser Arg 300157]<212>PRT0158]<213>人工0159]<220>0160]<221>DISULFID0161]<222>(1). . (8)0162]<400>50163]Cys Leu PheGlu0164]10165]Pro Glu AsnPro0166]200167]Arg Gly LysArg0168]350169]<210>60170]<211>290171]<212>PRT0172]<213>人工0173]<400>60174]Tyr Thr lieTrp0175]10176]lie Phe ThrAsn0177]200178]<210>70179]<211>50180]<212>PRT0181]<213>鼠、人0182]<400>70183]Asp Pro AlaLys0184]10185]<210>80186]<211>50187]<212>PRT0188]<213>鼠、人0189]<400>80190]Pro Ala AlaLys0191]10192]<210>90193]<211>40194]<212>PRT0195]<213>鼠、人
Ala Gly Thr Tyr Thr 10
Pro Cys Asp lie Phe 25
lie Trp Met 15
Thr Asn Ser 30
40
Pro Arg Pro Gly Thr 10
Arg Ala Ser Asn Gly 25
Pro Cys Asp 15
5
<400>9
Lys Gly LysGlu
1
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>鼠、人
<400>10
Thr Asp GluLys Gin
15
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>鼠、人
<400>11
Leu Phe GluLysLys
1權利要求
一種融合多肽，由神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段和29肽，以及位于神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段和29肽中間的連接肽構成，所述的29肽的氨基酸序列為YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG，所述的連接肽的氨基酸序列為AGT，所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 是DPAKR或PAAKR ；所述的神經(jīng)生長因子(NGF)是KGKE或TDEKQ ；所述的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 (CNTF)是 LFEKKL。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于，在所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段 的兩端加入了成環(huán)氨基酸C。
4.一種融合多肽，具有以下序列①至⑤中任一項所示的氨基酸序列①CDPAKRC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；②CPAAKRC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；③CKGKEC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ；④CTDEKQC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG ； CLFEKKLC-AGT-YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG。
5.根據(jù)權利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段來源 于鼠、人或重組合成。
6.一種防治老年性癡呆的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽類藥物，其特征在于，含有權利要求1至4 中任一項所述的融合多肽。
7.權利要求1至4中任一項所述的融合多肽的制備方法，其特征在于直接化學合成。
8.權利要求1至4中任一項所述的融合多肽的制備方法是構建神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽 段-連接肽(AGT)-29肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)融合基因的大腸桿菌表達載 體以及神經(jīng)營養(yǎng)因子-29肽(YTIWMPENPRPGTP⑶IFTNSRGKRASNG)融合基因的大腸桿菌定向 多拷貝表達載體，在大腸桿菌中表達后純化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組防治老年性癡呆的神經(jīng)營養(yǎng)因子融合多肽，該融合多肽由神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段和29肽，以及位于神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段和29肽中間的連接肽構成，29肽的氨基酸序列為YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG，連接肽的氨基酸序列為AGT，神經(jīng)營養(yǎng)因子活性肽段是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。該融合多肽能透過血腦屏障，用于老年性癡呆的預防和治療。
文檔編號A61K38/08GK101891822SQ201010182630
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權日2010年5月28日
發(fā)明者王建枝, 田青 申請人:華中科技大學