專利名稱：一種抑制血小板活化的方法及該方法的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制血小板活化的方法及其應(yīng)用，即通過抑制抑素蛋白 Kprohibitinl, PHB1)和抑素蛋白2(prohibitin 2，PHB2)而抑制血小板活化的方法及該 方法的應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前大規(guī)模調(diào)查結(jié)果證實，心血管病和癌癥已成為我國成年人的主要死亡原因。心血管病具有高發(fā)病、高致殘率和高死亡率等特點，發(fā)病年齡有年輕化的趨勢，是威脅人類 健康的重大疾病。近幾年來，中國心血管病患者的發(fā)病率和死亡率居高不下。從1958年到 現(xiàn)在，中國的高血壓患病率增加了 3倍，心腦血管病增加了 4倍，占中國總死亡率的36%。 為治療這兩種疾病，每年耗掉醫(yī)藥費近3000億元人民幣。當前，每15秒就有一位中國公民 被心腦血管疾病奪去生命，每22秒就有一位中國公民因此失去工作能力。預(yù)計到2020年， 缺血性心臟病將會成為危害中國人健康的頭號敵人。血小板主要參與止血與血栓形成，在動脈粥樣硬化、癌癥轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)等過程 中起重要作用。血小板活化過程是細胞膜接受外界刺激，通過下游一系列信號分子的活化， 最終產(chǎn)生血小板聚集，形成血小板栓塞。血小板的活化可通過血小板膜受體的激動首先活 化胞內(nèi)鈣庫的釋放，進一步活化蛋白激酶C，導(dǎo)致血小板GP II b-III a復(fù)合物的構(gòu)型改變， 形成黏附分子受體，并通過與纖維蛋白原的結(jié)合而使血小板之間相互黏附、聚集成團，在血 管破損處形成早期止血栓。此外通過血小板的釋放產(chǎn)物，可進一步引起血管收縮，刺激白 細胞，損傷內(nèi)皮細胞，促進血液凝固，有利于血栓形成。血小板活化可以是距常生理性的活 化，例如在血管受到損傷后發(fā)生的初級止血過程，也可以是病理性的，而異常的血小板聚集 會致使血管形成異常血栓，從而影響血液循環(huán)，產(chǎn)生缺血或阻塞，引發(fā)中風(fēng)、心肌梗死等疾 病。研制開發(fā)抑制血小板黏附、釋放、聚集功能和血小板活化的抗血小板藥物是抗血栓治療 的一個重要策略。阿司匹林是最早被應(yīng)用于抗栓治療的抗血小板藥物，已經(jīng)被確立為治療 急性心肌梗死(AMI)，不穩(wěn)定心絞痛及心肌梗死(MI) 二期預(yù)防的經(jīng)典用藥。阿司匹林作用 機制在于抑制血小板的環(huán)氧化酶而抑制血栓烷A2生成，從而阻止血小板聚集和釋放反應(yīng)。 vWF在介導(dǎo)血小板黏附、聚集、活化過程中發(fā)揮重要作用，因此，針對vWF功能結(jié)構(gòu)域(Al、 A3)的抗體具有顯著抑制血栓形成的作用，目前已用于抗血栓的治療。GP II b-IIIa復(fù)合物 在血小板活化后形成黏附分子受體，是血小板聚集和血栓形成的“最后共同通路”。因此利 用GP II b-III a受體拮抗劑(如替羅非班、依替巴肽以及阿昔單抗等)阻斷纖維蛋白原配 體與GP II b-III a受體的結(jié)合就能抑制血小板聚集，使血小板血栓不能形成，GP II b- III a 受體拮抗劑替羅非班、依替巴肽以及阿昔單抗等目前已廣泛應(yīng)用于臨床心腦血管疾病的治 療。鑒于心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率不斷上升，通過抑制血小板活化的新方法來防治 這類疾病的藥物還在不斷開發(fā)中。抑素蛋白是一類進化上保守的蛋白，英文名為prohibitin，縮寫為PHB，有兩個高 度同源的成員，PHBl和PHB2，人抑素蛋白prohibitin 1和2的美國GenBank序列號分別為P35232和Q99623。抑素蛋白參與調(diào)節(jié)衰老及很多疾病，如炎癥、肥胖、癌癥等。抑素蛋白主 要定位在線粒體上，與線粒體的發(fā)生、形態(tài)及功能的維持有關(guān)。此外，細胞核上的抑素蛋白 可以參與調(diào)節(jié)細胞周期，抑制腫瘤細胞的增殖及細胞凋亡過程。在某些特定的細胞系中，抑 素蛋白也能定位在細胞外膜上。例如在B-淋巴細胞表面，抑素蛋白1和2與IgM表面抗 原受體結(jié)合，可能與淋巴細胞的分化有關(guān)。在人小腸上皮細胞中，抑素蛋白1和2作為傷寒 桿菌的Vi夾膜多糖的作用位點，使得傷寒桿菌免于被機體的免疫系統(tǒng)識別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制血小板活化的方法及該方法的應(yīng) 用，通過抑制抑素 蛋白prohibitin 1和2來抑制血小板活化，可用于心血管治療藥物的制備、用于生物醫(yī)學(xué) 試劑制備和制藥。本發(fā)明提供一種通過抑制抑素蛋白1和2來抑制血小板活化的方法。對抑素蛋白 1和2的抑制作用可通過抗體而實現(xiàn)。該抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體或嵌合抗體。本發(fā)明所述的抑制血小板活化的方法的用途，是將該方法用于心血管病治療藥物 的制備。本發(fā)明的積極作用在于通過對血小板活化作用的深入研究，證明了抑素蛋白1和 2存在于血小板膜表面并在血小板活化過程中發(fā)揮了作用；抗抑素蛋白1和2的抗體可抑 制凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化，用于心血管疾病治療藥物的制備。


圖1為本發(fā)明的血小板膜人抑素蛋白1和2鑒定圖譜。圖2為本發(fā)明的人抑素蛋白1和2的免疫雜交(Western-Blot)鑒定圖譜。圖3為本發(fā)明的通過流式細胞儀檢測人抑素蛋白1和2在血小板上的分布圖。圖4為本發(fā)明的人抑素蛋白1和2在血小板不同亞細胞組分的定位圖。圖5為本發(fā)明的抗人抑素蛋白1和2的抗體對血小板聚集的抑制作用圖。圖6為本發(fā)明的抗人抑素蛋白1和2的抗體對血小板鈣動員的抑制作用圖。圖7為本發(fā)明的人抑素蛋白1和2在血小板激動時的分布變化圖。
具體實施例方式實施例1 親和層析及質(zhì)譜法鑒定人抑素蛋白prohibitinl (PHBl)和 prohibitin2(PHB2)(一)血小板洗滌健康人富血小板血漿用臺氏液A液(137mM氯化鈉，0. 3mM磷酸二氫鈉，12mM碳酸 氫鈉，0. 35%牛血清白蛋白，2mM乙二胺四乙酸，ImM氯化鎂，5mM葡萄糖，pH6. 5)洗滌兩次 后，血小板用臺氏液B液(137mM氯化鈉，0. 3mM磷酸二氫鈉，12mM碳酸氫鈉，0. 35%牛血清 白蛋白，2mM乙二胺四乙酸，ImM氯化鎂，5mM葡萄糖，pH7. 35)懸浮，并調(diào)整濃度至5 X IO8/毫 升待用。(二)親和層析及鑒定將人血小板裂解液(IOOmMTris-HCl, pH 7. 4，150mM 氯化鈉，1 % Triton X-100，IOmM EGTA, 3mM PMSF，3mM 釩酸鈉，10 微克 / 毫升 Ieup印tinh 和 aprotinin)經(jīng)過偶聯(lián)了大 蹼鈴蟾具有血小板激活作用的三葉因子(Bm-TFF2)的親和層析柱后，發(fā)現(xiàn)有35kDa和31kDa 的兩個分子能夠被特異性吸附；而等量人血小板裂解液分別經(jīng)過偶聯(lián)了甘氨酸(Glysine) 及血小板膜GPVI受體特異性激動劑(Stejnulxin)的親和層析柱后在相應(yīng)位置無明顯特異 性被吸附分子，見圖1。通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，這兩個分子分別是人抑素蛋白prohibitinl和2，MS/MS 二級 質(zhì)譜鑒定，見下表。Mascot mass search results against Swiss-Prot利用Mascot軟件在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進行質(zhì)譜搜索的結(jié)果 同時還利用羊源anti-PHBl (美國R&D公司，貨號AF3470)和兔源anti_PHB2(美 國Millipore公司，貨號07-234)特異性抗體對這兩個分子用免疫雜交(Western-blot)進 一步驗證。結(jié)果表明這兩個分子是PHBl和PHB2，見圖2。上述結(jié)果表明來自大蹼鈴蟾的具有人血小板激活活性的三葉因子BM-TFF2能通 過與人抑素蛋白prohibitin 1和2的相互作用激動人血小板。而來自竹葉青蛇毒的特異 性作用血小板膜糖蛋白受體GPVI誘導(dǎo)血小板聚集的C-型凝集素樣蛋白Stejnulxin則不 作用于血小板人抑素蛋白prohibitin 1和2。實施例2 =PHB 1和PHB 2在血小板上的定位(一 )激光共聚焦免疫熒光檢測將洗滌好人血小板包被膠原的蓋玻片上，加入4%多聚甲醛固定10分鐘，把蓋玻 片吹干，移到新的6孔板，用血小板用臺氏液B液洗3遍，接下來用含有3%牛血清白蛋白的 臺氏液B液封閉1小時。洗掉封閉液，加一抗(羊源anti-PHBl，美國R&D公司，貨號AF3470 ； 兔源anti-PHB2，美國Millipore公司，貨號07-234 ；鼠源anti_CD61 (CD61為血小板膜表面 標志蛋白)，美國BD公司，貨號555752) (1比1000稀釋)，于室溫放置1小時，然后用臺氏 液B液洗3遍，再加入相應(yīng)的熒光標記的二抗(PHB1檢測驢抗羊二抗，美國Santa Cruz公 司，貨號sc-2042 ；PHB2檢測羊抗兔二抗，美國Santa Cruz公司，貨號sc_2040 ；CD61檢測 羊抗鼠二抗，美國Santa Cruz公司)(1比1000稀釋)，室溫放置1小時后用臺氏液B液洗 3遍，用50%甘油封片，最后在激光共聚焦上使用油鏡觀察。結(jié)果表明血小板膜表面標志 蛋白⑶61以及PHBl和PHB2均分布于血小板膜表面。( 二)流式細胞檢測血小板洗滌后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，使用3%牛血清白蛋白封閉30分鐘，加入相 應(yīng)的一抗(羊源anti-PHBl，美國R&D公司，貨號AF3470 ；兔源anti_PHB2，美國Millipore公司，貨號07-234) (1比100稀釋)室溫孵育1小時后用臺式液B液洗3遍，再加入相應(yīng) 的熒光標記的二抗(PHB1檢測驢抗羊二抗，美國Santa Cruz公司，貨號sc_2042 ；PHB2檢 測羊抗兔二抗，美國Santa Cruz公司，貨號sc-2040) (1比100稀釋)，室溫孵育30分鐘 后用臺式液B液洗1遍，采用相應(yīng)波長的激發(fā)光通過流式細胞儀(LCRII)檢測細胞的熒光 強度。結(jié)果表明與灰色填充部分同型IgG對照相比，黑線部分特異性抗體結(jié)合血小板膜表 面PHBl或PHB2后熒光強度增強，充分證明PHBl和PHB2分布于血小板膜表面，見圖3。血小板亞細胞組分分離血小板膜蛋白制備600毫升過期血小板中加入3mM阿司匹林，室溫避光處理25分鐘后，離心10分 鐘，沉淀的血小板團塊懸浮于60毫升的緩沖液A(25mM Tris-HCl，5mM氯化鎂，pH7. 4)，離 心15分鐘，沉淀的血小板團塊懸浮于30毫升的緩沖液A，懸浮液超聲處理，然后離心10分 鐘，取出上清，上清超速離心(100，OOOXg) 30分鐘，沉淀的血小板膜團塊懸浮于24毫升 的緩沖液B(50mM Tris-HCl, IOmM CHAPS, pH 7. 4)，懸浮液于玻璃勻漿器中勻漿10次，4°C 100，OOOXg超速離心30分鐘，收集上清液，測定蛋白濃度，分裝，-20°C凍存。血小板線粒體制備14毫升人富血小板血漿用Ifepes-NaCl緩沖液(145mM氯化鈉，IOmM Hepes, IOmM 葡萄糖，5mM氯化鉀，ImM硫酸鎂，0. 牛血清白蛋白和0. 2單位/毫升apyrase，pH 7. 45) 洗滌，466g離心，沉淀懸于5ml預(yù)冷的低滲緩沖液MgRSB (IOmM氯化鈉，1. 5mM氯化鎂，IOmM Tris-Cl, pH 7. 5，外加各種蛋白酶抑制劑)中10分鐘，轉(zhuǎn)到勻漿器中勻漿30次，加入4毫 升2.5\1^緩沖液(210福甘露醇，701111蔗糖，51111乙二胺四乙酸，51111 Tris, pH 7. 6)溫和 的上下翻轉(zhuǎn)六次，以穩(wěn)定線粒體。將勻漿液離心，1300g，4°C，10分鐘，取上清，去除沒有裂 解完全的血小板。上清繼續(xù)離心，17000g，4°C，10分鐘，沉淀即為線粒體粗品。將沉淀懸 于1毫升1XMS，置于疊加的蔗糖濃度依次為1. 5M，1. 2M，IM的離心管頂部，進行超速離心， 110，000g，4°C，30分鐘，線粒體存在于1·2Μ與1. 5M的交界處。將分離的亞細胞組分利用抗PHB1、抗PHB2、抗線粒體標志蛋白CoxIV以及抗膜蛋 白⑶41進行Western-blot檢測，發(fā)現(xiàn)抑素蛋白1和2存在于血小板的線粒體及血小板膜 組分里，結(jié)果見圖4。上述3個結(jié)果表明人抑素蛋白prohibitin 1和2在血小板外膜及血小板線粒體 均有分布。實施例3 抗PHB 1和PHB 2的抗體制備抗原制備1)質(zhì)粒構(gòu)建ΡΗΒ1/2構(gòu)建入pET_17b方法如下。設(shè)計上下游引物，在 下游引物上引入組蛋白標簽，分別為PHBl，F(xiàn) :5-ggaattccatatggctgccaaagtgtttgagtc-3, R :5_ccggaattc ttagtggtggtggtggtggtgctggggaagctggagaagc—3 ；PHB2, F :5_ggaattc catatggcccagaacttgaaggacttag-3，R :5_ccg gaattc ttagtggtggtggtggtggtgatttcttacccttaatgagg-3 利用 PHBl 或 2的cDNA作模板擴增，產(chǎn)物酶切后插入pET-17b中，分別轉(zhuǎn)化至表達菌株大腸桿菌BL21 (DE3 plus)(購自Novagen)中，選取陽性克隆進行插入片段的核酸測序進行鑒定。測序正確的的 陽性單克隆菌株接種到5ml LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，將5ml培養(yǎng)液接種到1升培養(yǎng)基中放 大培養(yǎng)， 待600nm OD值達到0. 6后，加入0. 5mM IPTG，再培養(yǎng)3. 5小時后收集菌液，8，OOOg離心10分鐘，細菌再用100毫升平衡緩沖液(50mM磷酸鈉，PH 8. 0，含0. 3M氯化鈉和IOmM 咪唑)重懸。在冰浴上超聲破碎細菌(Ultrasonic Cell CrusherJY92-2D，350W，60個循 環(huán))。16，OOOg離心15分鐘后收集上清可溶性部分，過鎳親和柱，用20倍柱體積的洗滌緩 沖液(50mM磷酸鈉，pH 8. 0含0. 3M氯化鈉和20mM咪唑)沖洗后，用洗脫緩沖液(50mM磷 酸鈉，PH 8. 0，含0. 3M氯化鈉和250mM咪唑)洗脫，洗脫后分別得到PHBl或PHB2帶組蛋白 標簽的融合蛋白。2)抗體制備新西蘭兔2. 2公斤左右，抽取免疫前血清2毫升備用。第一次注射 每只兔子用1毫克融合蛋白，加入等體積(Iml)的進口福氏完全佐劑。8號針頭，0.5ml打 左腳掌(先去毛)，0.5ml打右腳掌。剩下的Iml打背部皮內(nèi)16-18個點，沿著脊柱兩側(cè)皮 內(nèi)注射。第二次免疫打胭窩淋巴結(jié)(第一次注射的24天后)，0. 5mg融合蛋白溶于同等體 積(0.5mL)的進口福氏完全佐劑)。第三次免疫(第一次注射后的42天)打胭淋巴結(jié)，有 的胭窩淋巴結(jié)已腫大，0. 5mg融合蛋白溶于同等體積(0. 5ml)的進口福氏不完全佐劑。第一 次注射的56天后，固定兔子，抽0.5ml耳垂血，做瓊脂雙擴散檢測(效價> 1 16)。第二 天，心臟放血或耳動脈放血。4°C冰箱放置3小時，分離抗血清，加入0. 05% NaN3后于_70°C 保存抗血清。實施例4 抗PHB 1和PHB 2的抗體抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集血小板聚集抑制實驗在恒定轉(zhuǎn)速(1100轉(zhuǎn)/分)轉(zhuǎn)動的血液聚集儀(普利生，北 京)上進 行分析。洗滌好的血小板用臺式液B液稀釋至終濃度為5 X 108/毫升，300微升反 應(yīng)體系，加凝血酶(10單位/毫升)5微升，記錄5分鐘內(nèi)光吸收值的變化，并以此為對照?？谷薖HBl的抗體來源于美國R&D公司(貨號為AF3470)或自制；抗人PHB2的抗 體來源于美國Millipore公司(貨號為07-234)或自制。對于抑制實驗，在反應(yīng)體系中加入30微克/毫升抗人抑素蛋白1的抗體(商品化 或自制)及30微克/毫升抗人抑素蛋白2的抗體(商品化或自制)，保溫10分鐘后，再加 入IOnM的凝血酶，記錄5分鐘內(nèi)的光吸收值的改變。然后在反應(yīng)體系分別加入30微克/ 毫升抗抑素蛋白1的抗體或抗抑素蛋白2的抗體，分別記錄他們各自的抑制效果。實驗結(jié)果表明同時加入抗抑素蛋白1的抗體及抗抑素蛋白2的抗體后，可以完全 抑制IOnM凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集；單獨加入抑素蛋白1的抗體或抗抑素蛋白2的抗體對 IOnM凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率約為50%，見圖5。實施例5 抗PHB 1和PHB 2的抗體抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板鈣動員2ml的人富血小板血漿(PRP) (1. 4 X 109血小板/ml)先與阿斯匹林(終濃 度100 μ M)在37 °C避光保溫40分鐘，加入終濃度為0. 2U/ml的三磷酸腺苷雙磷酸酶 (Apyrase)后，PRP與胞內(nèi)鈣離子熒光指示劑Fluo 3_AM(終濃度5 μ M)在37 °C避光保溫標 記45分鐘，再加入80 μ 1的檸檬酸-葡萄糖緩沖液，500g離心2分鐘，沉淀的血小板團塊 懸浮于羥乙基哌嗪乙磺酸Ofepes)緩沖液A，pH 6. 6(136mM NaCl，IOmM葡萄糖，5mMH印es， 2. 7mM KCl,2mM MgCl2,0. 2U/ml Apyrase,0. 1% (w/v)BSA)，重復(fù)離心一次后，沉淀的血小 板團塊懸浮于Ifepes緩沖液B，pH 7. 5 (成分相同于H印es緩沖液A，pH用Tris堿上調(diào))， 血小板濃度用Ifepes緩沖液B調(diào)至為5X 107個血小板/ml。所有緩沖液中加入2. 5mM的 丙磺舒(Probenecid)阻止鈣離子的外流。在加激動劑刺激血小板之前，加終濃度為0. ImM 的乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，以螯合血小板胞外鈣。Fluo3-AM-Ca2+復(fù)合物的熒光用Perkin-Elmer LS50B型熒光分光光度儀測定，激發(fā)波長505nm，發(fā)射波長530nm，熒光強 度的變化經(jīng)公式[Ca2+]i = Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)換算成血小板胞內(nèi)鈣離子的變化。對于凝血酶誘導(dǎo)血小板內(nèi)鈣動員測定，2ml反應(yīng)體系，加入凝血酶5 1 (100U/ml)， 記錄5分鐘內(nèi)光吸收值的改變。對于抑制實驗，2ml反應(yīng)體系，加入商品化或自制10 1人 prohibitin 1 (lmg/ml)及商品化或自制 10 1 人 prohibitin2 的抗體(lmg/ml)，37°C 攪拌 5分鐘，再加入5 1凝血酶(100U/ml)，測定5分鐘內(nèi)的光吸收值。結(jié)果表明同時加入人prohibitin 1和人prohibitin 2的多克隆抗體能夠完全 抑制低劑量凝血酶誘導(dǎo)的血小板內(nèi)的鈣動員，而分別單獨加入抗人prohibitin 1及抗人 prohibitin2的多克隆抗體，其抑制效果只能達到50%左右，見圖6。實施例6 血小板活化時PHB 1和PHB 2在脂筏中的招募
使用蔗糖密度梯度離心的方法分離人血小板脂筏。洗滌血小板樣品250微升(靜 息及活化的血小板)使用等體積的2 X裂解液裂解(IOOmM Tris, pH 7. 4，150mM氯化鈉， Triton X-100, IOmM EGTA, 3mM PMSF，3mM釩酸鈉，10 微克 /毫升 Ieup印tinh和 aprotinin)， 冰上放置15分鐘，裂解液與等體積的冰冷的80%蔗糖混勻，放置在離心管的底部，上面依 次鋪上1. 5毫升30%蔗糖，0. 75毫升5%蔗糖，在100，OOOXg離心18個小時，由上至下，一 次取0. 32毫升為一管，共收集11管。將分離的樣品進行Western-blot檢測，所用的檢測抗體為抗人抑素蛋白1和2 的抗體(商品化或自制)、抗蛋白酶激活受體PAR 1、抗血小板脂筏標志物flotilin-1抗體 以及抗胞內(nèi)標志蛋白P85/PI3K的抗體來檢測。結(jié)果表明活化狀態(tài)與靜息狀態(tài)的血小板相比，抑素蛋白1和2的分布有明顯的差 異，活化狀態(tài)下，抑素蛋白1和2的分布與flotillin-Ι的分布相同，說明它們在血小板激 動時，被招募到脂筏中而富集，見圖7。
權(quán)利要求
一種抑制血小板活化的方法，其特征在于通過抑制抑素蛋白1和2來抑制血小板活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制血小板活化的方法，其特征在于對抑素蛋白1和2的 抑制作用可通過抗體而實現(xiàn)，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制血小板活化的方法，其特征在于該抗體可以是多克隆 抗體、單克隆抗體或嵌合抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的抑制血小板活化的方法的應(yīng)用，其特征在于將該方法用于心 血管病治療藥物的制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制血小板活化的方法及該方法的應(yīng)用，是通過抑制抑素蛋白1(prohibitin 1，PHB1)和抑素蛋白2(prohibitin 2，PHB2)而抑制血小板活化。抑素蛋白prohibitin 1和2定位在血小板細胞外膜上，調(diào)節(jié)血小板活化。通過對血小板活化作用的深入研究，抗抑素蛋白1和2的抗體能夠抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化和聚集，可用于心血管病治療藥物的制備。
文檔編號A61P7/02GK101843903SQ20101018334
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者余果宇, 張云, 張勇, 李文輝, 王嚴戒 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所