專利名稱：重組細胞球蛋白在延緩皮膚衰老中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及重組大鼠細胞球蛋白在延緩皮膚衰老中的應用。
背景技術：
衰老是機體各種組織、器官功能隨年齡增長所發(fā)生的退行性變化。衰老與人類壽命和死亡密切相關，它是一個復雜的生理過程，涉及諸多領域，是機體各種生化反應的綜合表現(xiàn)，同時也是體內(nèi)外許多因素共同作用的結(jié)果。衰老導致生物有機體對各種應激的抵抗能力降低，生物功能進行性衰退，同時更易受到各種疾病的影響。覆蓋機體全身的皮膚是機體衰老過程中最為明顯的器官之一。隨著年齡的增長，皮膚會發(fā)生退行性變，表現(xiàn)為皮膚變薄、含水量減少、萎縮、起皺、彈性降低等。有關衰老的機理，學者們曾提出許多學說。皮膚衰老分為兩種類型自然衰老，即隨年代增長造成的生理性衰老和光老化，即由外界環(huán)境因素主要是紫外線(ultraviolet，UV)照射引起的衰老。現(xiàn)已提出一系列衰老學說，主要包括自由基學說、線粒體DNA損傷學說、衰老的端區(qū)學說、免疫學說 (immunological theory)、光老化學說、內(nèi)分泌學說(endocrine theory)等。衰老的皮膚中，由于MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)的表達量提高或者活性增強，造成細胞外基質(zhì)重要組成成分膠原(I型和III型膠原為主)和彈性蛋白發(fā)生進行性退化。MMf3S表達過量和對細胞外基質(zhì)重建發(fā)揮重要作用的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inhibitor of MMP，TIMPs)表達量降低，是皮膚衰老的兩個重要特征。皮膚衰老的組織學改變主要是膠原蛋白減少和彈性纖維增加；分子學改變主要包括表皮增生和分化性標志表達異常。外界環(huán)境中UV照射對人類皮膚結(jié)締組織產(chǎn)生嚴重損傷，光老化導致細胞活力降低，細胞膜損傷和彈性組織變性(彈性蛋白/原纖維蛋白沉積)。與光老化皮膚外觀上相比較，自然衰老的皮膚更薄，色素沉積更加均勻，更加松弛而且細紋相對較多。細胞球蛋白(Cytoglobin，Cygb)，是近幾年來在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的六配位血紅素球蛋白(hxHb)超家族中的新成員，在多種生物及組織中表達。已有多項研究初步表明，細胞球蛋白Cygb可能具有促進皮膚等上皮組織的生長、減緩衰老、抗氧化和抗炎癥等功能。發(fā)明人通過構(gòu)建基因工程菌pET22b_Cygb/E. C01 i. BL21，篩選高表達大鼠Cygb 菌株，分離純化鑒定得到高純度重組大鼠Cygb。利用皮膚細胞H2A氧化應激損傷模型及 D-galactose致小鼠局部皮膚衰老模型等，研究了 Cygb的在延緩皮膚衰老中的抗氧化及相關功能，探討了 Cygb在抗炎癥及促進皮膚創(chuàng)傷愈合方面的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組大鼠細胞球蛋白(Cygb)，以及所述重組大鼠細胞球蛋白在延緩皮膚衰老中的應用。本發(fā)明所述的重組大鼠細胞球蛋白，通過構(gòu)建基因工程菌pET22b_Cygb/E. coli. BL21(DE3)，篩選高表達重組大鼠細胞球蛋白菌株，分離純化鑒定得到高純度重組大鼠細胞球蛋白。
本發(fā)明所述的重組大鼠細胞球蛋白，具體經(jīng)過以下步驟制備(1)采用基因工程的方法構(gòu)建高效表達重組大鼠細胞球蛋白的基因工程菌 pET22b-Cygb/E. coli. BL21(DE3)；(2)基因工程菌經(jīng)大量培養(yǎng)后，經(jīng)離心得到菌體沉淀經(jīng)反復凍融后，重懸得粗蛋白提取液，上清總蛋白分別經(jīng)DEAE-S^hadex A-50離子交換柱層析、S^hacryl S-100凝膠過濾層析及kphadex G25脫鹽層析純化，得到高純度重組Cygb蛋白，通過WfesternBlotting， 鑒定純化后重組大鼠細胞球蛋白的準確性。本發(fā)明制備重組大鼠細胞球蛋白更加詳細的過程記載在實施例中。本發(fā)明還包括，用本發(fā)明的重組大鼠細胞球蛋白作為藥物活性成分制備的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，根據(jù)需要可以含有藥物可接受的載體，其中所述的重組大鼠細胞球蛋白作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.01-99. 99%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒，口服液的每瓶，顆粒劑的每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括滴丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。本發(fā)明的藥物組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？梢酝ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中。口服液體制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑， 或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉齊U、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的藥物組合物，在制備成藥劑時可選擇性地加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA 二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、 麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的藥物制劑在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，如每日1-3次，每次 1-3 支。本發(fā)明還包括，本發(fā)明的重組大鼠細胞球蛋白在制備延緩皮膚衰老藥物中的應用。本發(fā)明的重組大鼠細胞球蛋白在制備減輕細胞氧化損傷藥物中的應用。本發(fā)明的重組大鼠細胞球蛋白在制備提高細胞抗氧化能力藥物中的應用。本發(fā)明的重組大鼠細胞球蛋白在制備抗炎癥藥物中的應用。本發(fā)明的重組大鼠細胞球蛋白在制備促進皮膚創(chuàng)傷愈合藥物中的應用。通過以下實驗進一步研究重組大鼠Cygb在延緩皮膚衰老方面的作用。實驗一重組Cygb抗細胞氧化損傷功能研究細胞氧化應激模型構(gòu)建FB細胞氧化應激模型從

圖1中可以看出，F(xiàn)B細胞經(jīng)H2A處理后，隨H2A濃度增加，細胞增殖活力逐漸降低，1300 μ m H2O2處理細胞Mi后，與空白組相比細胞增殖活力下降至21 士 1. 94) % ； 而同等濃度H2A處理24h與處理他相比，細胞活力明顯增強(ρ < 0. 01)，說明較高濃度 H2O2 (500 900 μ m)長時間(Mh)作用于FB細胞后，細胞RGR有一定增強。曾有文獻報道， PC12 細胞經(jīng) 10 μ mol/L H2O2 預處理 9Omin 后，在 100 μ mol/L H2O2 作用 24h 后，與未經(jīng) H2O2 預處理的PC12細胞相比，其細胞凋亡率明顯下降，而且差異極顯著(P < 0. 01)，表明H2A預處理對H2A誘導PC12細胞凋亡具有保護作用。從圖2中可看出，低濃度(0. 1,0. 5mM) tBHP對細胞RGR沒有明顯影響(ρ > 0. 05)， 隨tBHP濃度升高和處理時間延長，細胞RGR明顯降低(ρ < 0. 01)，如4mM tBHP作用FB細胞乩后，細胞RGR只有對照組的(50. 98 士 2. 79) %。HaCAT細胞氧化應激模型低濃度H2O2(0. 1、0· 2、0· 3、0· 4、0. 5mM)和低濃度 tBHP(0· 1、0· 2、0· 3、0· 4mM)分別作用于:3h、6h、9h HaCAT后(圖3)，觀察實驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比，低濃度 H2O2 (0. 1 0. 4mM)作用9h對HaCAT細胞RGR沒有明顯影響(ρ > 0. 05)，而0. 5mMH202處理HaCAT 6h及9h后，細胞RGR分別只有對照組的(68. 53 士 3. 21) %和(53. 10 士 1. 44) % ； 而低濃度t-BHP作用于HaCAT后隨濃度增加和處理時間延長，HaCAT細胞RGR明顯降低(ρ <0. 01)，如0. 4mM tBHP處理細胞9h后，HaCAT細胞的RGR只有對照組的(30. 98 士 0. 59) % 提示低濃度H2A在短時間內(nèi)對HaCAT細胞沒有造成明顯損傷，而低濃度tBHP在短時間 (9h)內(nèi)就能夠?qū)aCAT細胞造成很強的氧化應激損傷。較高濃度H2O2 (0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. OmM)和較高濃度 tBHP (0. 5、1、1. 5mM)分別作用于HaCAT 3h，6h，12h (圖4)后，與對照組相比，兩者均對HaCAT造成嚴重氧化損傷，細胞 RGR均顯著下降(ρ < 0. 01)。如ImM H2O2禾Π 1. 5mM tBHP作用于HaCAT12h后，細胞RGR均下降至正常細胞的30%左右。
重組Cygb細胞毒性檢測將無菌抽濾后的重組Cygb進行梯度稀釋，按終濃度分別為4X10_4，2X10_3， 1 X IO"2, 5 X IO"2, 25 X IO"2,1，5，12. 5，50 μ g/ml 作用于 FB 和 HaCAT，作用時間分別為 24h, 48h，72h，96h，待作用時間結(jié)束后顯微鏡下觀察記錄細胞形態(tài)并用MTT法測得0D492值。從圖5和圖6中經(jīng)統(tǒng)計學分析可以發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，各種濃度的Cygb作用于兩種細胞后，各組細胞RGR均無顯著差異(ρ >0.05)。提示重組Cygb對兩種皮膚細胞均無毒性。按圖5、6實驗設計HaCAT細胞做相同處理后，采用結(jié)晶紫染色法測得各組細胞 0D578值。從圖7和圖8中經(jīng)統(tǒng)計學分析可以看出，各種濃度的Cygb對兩種細胞的RGR沒有明顯影響(P >0.05)，與空白對照組相比，均無顯著差異(ρ >0.05)。結(jié)晶紫染色法實驗結(jié)果同樣表明，重組Cygb對兩種皮膚細胞均無明顯毒性。重組Cygb抗細胞氧化應激損傷功能檢測重組Cygb抗H2A細胞氧化應激損傷功能研究FB細胞模型將FB接種于96孔板中，待細胞貼壁后，開始實驗處理。實驗分為空白對照組，模型組(H2O2處理組)，實驗組(Cygb預處理組，終濃度分別為2，10，50 μ g/ml)，陽性對照組(Ve 終濃度為25 μ m)，每組設立6個平行孔，實驗組和陽性對照組分別加Cygb和25 μ m Ve進行預處理，然后用H2O2處理(700 μ m, 3h)，模型組只用H2O2處理。對于FBjH2O2濃度為700 μ m， 處理時間為汕；對于HaCAT，H2O2濃度為500 μ m,處理時間為乩。模型組FB細胞經(jīng)700 μ m H2O2處理池后產(chǎn)生明顯細胞毒性，RGR下降至 (62.觀士3. 27) % ；而重組Cygb對細胞進行預處理能顯著降低H2A對細胞的毒性，其中 50 μ g/ml Cygb預處理能顯著降低H2O2對細胞的毒性(RGR= (88. 15士9. 27) % )，25 μ m VE也能發(fā)揮抗氧化作用(68. 00士2. 60) % (P < 0. 01)，但保護作用不及50 μ g/ml Cygb (P <0.01)，其中低濃度2 μ g/ml Cygb預處理細胞對于提高細胞RGR沒有明顯效果，中等濃度 10 μ g/ml Cygb預處理細胞對于減輕H2A的氧化應激作用也有顯著作用(P < 0. 05)。證明重組Cygb預處理細胞能夠明顯減輕H2A對細胞的氧化應激損傷。模型組中700 μ m H2O2作用于FB細胞池后，相差顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)FB細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，與對照組的長梭形細胞相比，多數(shù)細胞變的較皺縮，有的甚至變?yōu)榍蛐危?同時貼壁細胞數(shù)量減少，而Cygb預處理組和陽性對照組中大部分細胞形態(tài)仍為長梭形，而且與模型組相比細胞數(shù)量較多；其中高濃度Cygb預處理組FB細胞形態(tài)和數(shù)量均優(yōu)于低濃度Cygb預處理組。HaCAT細胞模型對于HaCAT，重組Cygb梯度稀釋后進行預處理(終濃度分別為5 X 10_2，25 X 10_2， 1，5，12. 5，25，50 μ g/ml)，然后用500 μ m H2O2作用6h，模型組只用H2O2處理，相差顯微鏡下觀察并記錄各組細胞形態(tài)及貼壁情況。從MTT結(jié)果(圖9)可以分析看出，與模型組(model group)相比，50 μ g/ml Cygb 預處理組能夠顯著提高細胞的RGR(ρ < 0. 01)，且隨著Cygb濃度增加，細胞的RGR越高，說明Cygb預處理能夠降低H2A導致的細胞損傷，并且具有劑量依賴性，但是25 μ mVe預處理的保護作用不及50 μ g/ml Cygb。模型組(model group)貼壁細胞數(shù)量明顯減少，同時細胞變得皺縮，而Cygb預處理后細胞形態(tài)和數(shù)量相比模型組都有很大改善，50 μ g/ml Cygb 預處理組中細胞形態(tài)和數(shù)量與對照組相比無明顯差別，但是陽性對照組的細胞狀態(tài)不及 50 μ g/ml Cygb預處理組。由此判斷，50 μ g/ml Cygb的抗氧化應激作用優(yōu)于25 μ m VE。500 μ m H2O2處理細胞后，與空白對照組相比，模型組中細胞數(shù)量和形態(tài)發(fā)生均發(fā)生明顯改變，細胞數(shù)量明顯減少而且變得皺縮；Cygb預處理組與模型組相比細胞數(shù)量有所增加，而且細胞形態(tài)也比較正常，以50 μ g/ml Cygb效果最好；另外25 μ m VE預處理的陽性對照組細胞與模型組相比在細胞數(shù)量和細胞形態(tài)方面均有明顯改觀。細胞內(nèi)超氧化物陰離子水平檢測通常用含有10 μ m Dihydroethidium(DHE)的 D-Hank，s 溶液與細胞一起 37°C孵育30分鐘左右進行熒光探針裝載，隨后用D-Hank’S洗滌。DHE被活細胞攝入后，可以在細胞內(nèi)的超氧化物陰離子作用下脫氫，產(chǎn)生ethidium。Khidium可以和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。當細胞內(nèi)的超氧化物陰離子水平較高時，產(chǎn)生的ethidium較多，紅色熒光就較強，反之則較弱。DHE本身為藍色熒光，最大激發(fā)波長為370nm，最大發(fā)射波長為420nm，脫氫后和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光，最大激發(fā)波長為300nm，最大發(fā)射波長為610nm。700 μ m H2O2處理FB池后，熒光顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組細胞內(nèi)紅色熒光量明顯增多，提示H2O2處理FB后，細胞內(nèi)超氧化物陰離子含量明顯增加； 另外重組Cygb預處理細胞后，發(fā)現(xiàn)預處理組細胞內(nèi)紅色熒光含量相比模型組明顯降低，提示重組Cygb預處理細胞明顯降低了細胞內(nèi)超氧化物陰離子的含量，比較各預處理組可發(fā)現(xiàn)，其中50 μ g/ml Cygb預處理具有最佳抵抗H2A細胞氧化應激效果，效果優(yōu)于陽性對照組 (25 μ m VE)；另外25 μ m VE陽性對照組預處理細胞后，與模型組相比，細胞內(nèi)超氧化物的含量也有較明顯降低。此結(jié)果與之前細胞氧化應激模型中實驗結(jié)果相一致。熒光顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)，500 μ m H2O2處理HaCAT 6h，模型組細胞與空白對照組相比，細胞內(nèi)超氧化物陰離子含量明顯增加，表明H2A處理細胞導致細胞產(chǎn)生明顯氧化應激損傷；另外重組Cygb預處理(2 μ g/ml, 10 μ g/ml, 50 μ g/ml Cygb)后，均明顯降低了細胞內(nèi)超氧化物陰離子的含量，其中50 μ g/ml Cygb預處理具有最好的抗氧化應激效果，其效果優(yōu)于25μπι VE預處理組；另外，與模型組相比，陽性對照組(25μπι VE)預處理后，細胞內(nèi)超氧化物的含量也有所降低。提示較高濃度重組Cygb預處理細胞，對于降低細胞內(nèi)超氧化物陰離子含量、減輕細胞氧化應激損傷具有良好作用。相關抗氧化因子水平測定FB細胞模型中相關因子水平測定表1處理后的FB細胞培養(yǎng)液中SOD、MDA、LDH含量測定
權利要求
1.一種重組大鼠細胞球蛋白，經(jīng)過以下步驟制成構(gòu)建基因工程菌pET22b-Cygb/ Ε. coli. BL21菌株，經(jīng)培養(yǎng)，分離，純化，得到重組大鼠細胞球蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組大鼠細胞球蛋白，其特征在于，經(jīng)過以下步驟制成(1)采用基因工程的方法構(gòu)建基因工程菌pET2^-Cygb/E.coli.BL21 ；(2)培養(yǎng)后，經(jīng)離心得到菌體沉淀，經(jīng)反復凍融后，重懸得粗蛋白提取液，上清總蛋白分別經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析、Sephacryl S-100凝膠過濾層析及kphadex G25脫鹽層析純化，得到高純度重組Cygb蛋白。
3.權利要求1或2所述重組大鼠細胞球蛋白在制備延緩皮膚衰老藥物中的應用。
4.權利要求1或2所述重組大鼠細胞球蛋白在制備減輕細胞氧化損傷藥物中的應用。
5.權利要求1或2所述的重組大鼠細胞球蛋白在制備提高細胞抗氧化能力藥物中的應用。
6.權利要求1或2所述的重組大鼠細胞球蛋白在制備抗炎癥藥物中的應用。
7.權利要求1或2所述的重組大鼠細胞球蛋白在制備促進皮膚創(chuàng)傷愈合藥物中的應
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組大鼠細胞球蛋白在延緩皮膚衰老中的應用，所述重組大鼠細胞球蛋白，通過構(gòu)建基因工程菌pET22b-Cygb/E.coli.BL21(DE3)篩選高表達重組大鼠細胞球蛋白菌株，分離純化鑒定得到高純度重組大鼠細胞球蛋白。
文檔編號A61P39/06GK102268085SQ201010189909
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權日2010年6月2日
發(fā)明者刁勇, 張亭亭, 李招發(fā), 許瑞安 申請人:許瑞安