專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)核桿菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的新型疫苗技術(shù)，具體涉及采用嵌合基因技術(shù)研制的可用于預(yù)防或治療結(jié)核病的結(jié)核桿菌嵌合基因疫苗，尤其是治療耐藥結(jié)核桿菌感染結(jié)核病人的嵌合型基因疫苗。
背景技術(shù)：
迄今已知卡介苗雖能預(yù)防兒童結(jié)核病，包括嚴(yán)重的腦結(jié)核和粟粒性結(jié)核病，但不能有效地預(yù)防成人肺結(jié)核病，故美國(guó)、加拿大等國(guó)一直不常規(guī)接種卡介苗。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，由于結(jié)核桿菌耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，以及艾滋病、移民和貧困等社會(huì)問(wèn)題使得結(jié)核病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)重新回升。世界衛(wèi)生組織(WHO) 2004年報(bào)告全球每年新增結(jié)核病人900多萬(wàn)，每年有200多萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)的結(jié)核病疫情和耐藥情況也相當(dāng)嚴(yán)重，結(jié)核病人數(shù)居世界第二，僅次于印度，每年新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核病人150多萬(wàn)人，現(xiàn)有肺結(jié)核病人450多萬(wàn)，每年約13萬(wàn)人死于此病，為全國(guó)各種傳染病之首。耐藥結(jié)核病人多，結(jié)核分枝桿菌總耐藥率為27. 8%，其中初始耐藥率為18. 6%，獲得性耐藥率為46. 5%，耐多藥率為 10. %。結(jié)核病是一種在感染、免疫、預(yù)防和治療等方面充滿矛盾和挑戰(zhàn)的慢性傳染病，經(jīng)合理的抗癆藥物治療不耐藥結(jié)核菌感染一般在1 2個(gè)月內(nèi)即可殺死病灶內(nèi)絕大多數(shù)結(jié)核菌，但仍有少量菌殘留，尤其是寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌不易被殺死，需繼續(xù)治療至少6 個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間。由于耐多藥結(jié)核病的流行、化療藥物長(zhǎng)期治療產(chǎn)生的毒副作用，以及艾滋病毒的感染、免疫抑制劑的使用和老年結(jié)核病等原因?qū)е碌臋C(jī)體免疫功能低下，使難治性結(jié)核病增多，抗結(jié)核治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病O(DR-TB)面臨無(wú)藥可治的困難局面。因此，研制新的抗結(jié)核藥物面臨更大的需求。但是，研制新的抗結(jié)核藥物投入大、周期長(zhǎng)，而且結(jié)核桿菌對(duì)新藥也可能很快產(chǎn)生耐藥性，故新的有效抗結(jié)核藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)展緩慢，近年來(lái)只開(kāi)發(fā)了采用免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)輔助治療結(jié)核病的方法。目前用于結(jié)核病輔助治療的已獲得批準(zhǔn)的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品主要有二類(lèi)。一類(lèi)是細(xì)胞因子如IFN-Y、IL-2等，其半衰期短，需反復(fù)注射，費(fèi)用高。另一類(lèi)是用結(jié)核分枝桿菌的同類(lèi)菌制成的非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，如(1)母牛分枝桿菌菌苗(商品名微卡菌苗)，系母牛分枝桿菌經(jīng)高溫滅活純化后制成的無(wú)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)劑，其活性成分主要為細(xì)胞壁，還含有蛋白質(zhì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)物質(zhì)，及具有較強(qiáng)免疫活性的DNA聚合體，能部分增強(qiáng)肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能，與化療聯(lián)用能縮短療程，不良反應(yīng)少且較輕微，使用安全，復(fù)發(fā)率低；( 草分枝桿菌制劑(商品名烏體林斯utilin’ s)，系滅活的草分枝桿菌制成的免疫調(diào)節(jié)劑，可部分提高肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)肺結(jié)核病灶的吸收好轉(zhuǎn)；(3)卡介苗多糖核酸注射液(商品名斯奇康)，系采用熱酚法去掉了卡介苗菌體可誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的菌體蛋白質(zhì)、再用乙醇沉淀提取的免疫活性較強(qiáng)的菌體脂多糖成分，可部分增強(qiáng)肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高誘生IL-2、IL-2受體表達(dá)和IFN-Y的水平，促進(jìn)細(xì)菌陰轉(zhuǎn)和結(jié)核病灶的吸收好轉(zhuǎn)而提高聯(lián)合化療的療效。但這三種調(diào)節(jié)劑都是非特異性細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑，不能誘導(dǎo)針對(duì)結(jié)核桿菌的特異性強(qiáng)效細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。
如果能采用疫苗治療結(jié)核病，幾個(gè)月中只需注射幾針，遠(yuǎn)比每天服藥打針?lè)奖?，且副作用較少費(fèi)用低，故治療性疫苗已成為重要的研究與開(kāi)發(fā)方向。治療性疫苗的應(yīng)用對(duì)象與預(yù)防性疫苗不同，前者用于結(jié)核菌感染者或結(jié)核病患者，而后者用于正常人群。有效的預(yù)防性疫苗不一定能用作治療性疫苗，如研究證明卡介苗用于治療結(jié)核病不僅無(wú)效可能還會(huì)加重病情?？贵w應(yīng)答對(duì)抗結(jié)核無(wú)效，而現(xiàn)有的多種蛋白質(zhì)鋁佐劑疫苗主要是誘導(dǎo)體液抗體免疫應(yīng)答因而效果不佳。要開(kāi)發(fā)的預(yù)防和治療性結(jié)核病疫苗必須能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)為主的免疫應(yīng)答，通過(guò)調(diào)節(jié)或選擇性地誘導(dǎo)結(jié)核病患者免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏的細(xì)胞免疫力來(lái)達(dá)到治療疾病的目的，因此需選擇適當(dāng)類(lèi)型的疫苗。自上世紀(jì)90 年代以來(lái)全世界研發(fā)的新型核酸(基因)疫苗的優(yōu)點(diǎn)就是主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答。采用各種結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原的編碼核酸(基因)疫苗預(yù)防結(jié)核感染的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已有許多成功研究，但采用特異性核酸疫苗聯(lián)合抗癆藥物治療結(jié)核病的研究論文只有幾篇，如(1). Lowrie et al. , Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature 400 :269-271,1999. (2). S-J Ha et al. , Therapeutic effect of DNAvaccines combined with chemotherapy in a latent infection model afteraerosol infection of mice with Mycobacterium tuberculosis. Gene TherapylO : 1592-1599,2003. (3). S-J Ha et al. ， Protective effect of DNA vaccineduring chemotherapy on reactivation and reinfection of Mycobacteriumtuberculosis. Gene Therapy(2005) 12 :1-5, 2005. (4). D-H YU,X-D and H Cai (北大蔡宏等)，Efficient tuberculosis treatmemt in mice usingchemotherapy and immunotherapy with combined DNA vaccine encodingAg85B, MPT-64 and MPT-83. gene Therapy (2008)，1-8。這些論文主要涉及小鼠接種標(biāo)準(zhǔn)(非耐藥)結(jié)核桿菌H37Rv株后，肺肝脾均有細(xì)菌生長(zhǎng)，單獨(dú)給予利福平等抗癆藥物治療3個(gè)月后，若用地塞米松抑制小鼠的免疫反應(yīng)，至6個(gè)月時(shí)細(xì)菌感染復(fù)發(fā)，但給予利福平同時(shí)注射單基因或混合基因核酸疫苗的動(dòng)物感染不復(fù)發(fā)，這是由于核酸疫苗誘導(dǎo)了 Thl型免疫應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答而致。然而，關(guān)于耐藥結(jié)核桿菌感染的治療卻鮮有研究，而結(jié)核桿菌易產(chǎn)生耐藥性，耐藥結(jié)核桿菌感染的治療難度大，正是該技術(shù)需要開(kāi)發(fā)的新領(lǐng)域。目前認(rèn)為結(jié)核病單基因DNA疫苗在大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的預(yù)防免疫效果不夠理想 (Gregorialdis等,“Genetic vaccines -strategies for optimization，，,Pharmaceutical Research, 15 :661-670,1998)；采用將兩個(gè)抗原編碼基因融合構(gòu)建的雙基因疫苗能夠達(dá)到用一種載體表達(dá)兩種不同抗原的目的，但兩種表達(dá)抗原之間沒(méi)有協(xié)同增效作用，也即融合基因疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答并不比單基因疫苗效果好(Stevenson et al ；DNA fusion gene vaccinesagainst cancer :from laboratory to the clinic.Immunology Research, 199 :156-180,2004.和師長(zhǎng)宏等，“結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B_ESAT6的融合表達(dá)及純化”，中華結(jié)核和呼吸雜志，27 (2) :89-92, 2004. ) 0近年的研究發(fā)現(xiàn)將來(lái)源于同一病原微生物的兩種抗原基因正確嵌合在一起產(chǎn)生的嵌合性基因疫苗有較好效果(Domingo et al ； “Immunological properties of aDNA plasmid encoding a chimeric protein of herpes simplex virus type 2glycoprotein B and glycoprotein D，，，Vaccine, 21 (25-26) 3565-3574,2003)。研究發(fā)現(xiàn)將一種免疫原性較弱的小抗原基因正確嵌合于另外一種免疫原性較強(qiáng)的大抗原基因中可提高小抗原的免疫原性，此即異源性嵌合基因技術(shù)。其成功的例子有在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的編碼基因中嵌合艾滋病病毒V3表位的編碼基因。艾滋病病毒外殼蛋白抗原的V3表位含有非常重要的保護(hù)性抗原表位，但其分子量很小，單用時(shí)難以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。然而，將編碼HIV V3的基因嵌合在編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 的基因中，使表達(dá)的HBsAg成為V3表位的載體蛋白，這種嵌合基因即能誘導(dǎo)出特異性抗HIV V3 的體液禾口細(xì)胞免疫應(yīng)答(Bryder etal ；"Improved immunogenicity of HIV-I epitopes in HbsAg chimeric DNAvaccine plasmids by structural mutations of HbsAg，，,DNA and Cell Biology, 18 (3) :219-225,1999.)。嵌合位點(diǎn)和嵌合方式的正確選擇十分重要，應(yīng)使插入的小基因不破壞作為載體蛋白的大基因構(gòu)型，從而表達(dá)時(shí)能保持二者原有的抗原表位和免疫原性。本發(fā)明者在中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL 2004100843761 (2008年3月28日授權(quán))及以其為優(yōu)先權(quán)的國(guó)際申請(qǐng)PCT/CN2005/001914 “結(jié)核桿菌嵌合基因疫苗及其制備方法”中，揭示了將編碼最小結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原的ESAT6基因嵌合到編碼最具免疫保護(hù)效果的結(jié)核桿菌較大抗原結(jié)構(gòu)蛋白AgSfe基因中，得到了結(jié)核桿菌嵌合基因Ag8fe-ESAT6。其中，在Ag85a 基因第245-250 (GGTACC)位的Kpn I限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或第430-435 (GTCTAC)位的 Acc I限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的嵌合，分別產(chǎn)生的兩種新型結(jié)核桿菌嵌合基因(HG856K和 HG856A)疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示出優(yōu)于單基因疫苗的免疫效果，即既保留了 AgSfe的免疫原性又增強(qiáng)了 ESAT6 的免疫原性(Li Z, Song D, Zhang H, et al. Improvedhumorol immunity against Tuberculosis ESAT—6 antigen by chimeric DNAprime and protein boost strategy. DNA Cell Biol, 2006, 25 (1) :25-29)。這是迄今結(jié)核桿菌嵌合基因疫苗構(gòu)建的一個(gè)成功例子。這兩種嵌合基因疫苗在預(yù)防結(jié)核桿菌感染的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示了良好效果，但是， 后來(lái)我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)將其用于結(jié)核桿菌(尤其是治療耐藥結(jié)核桿菌)感染的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療時(shí)，這種嵌合基因疫苗雖能有效減少感染組織中的結(jié)核桿菌數(shù)，但對(duì)減輕結(jié)核桿菌導(dǎo)致的病理?yè)p傷(如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)核病產(chǎn)生的結(jié)核結(jié)節(jié)等病理?yè)p傷)不能盡如人意。我們?cè)谏鲜霭l(fā)明專(zhuān)利的基礎(chǔ)上，不斷地進(jìn)行探索，在研究思路和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上均作了重大改進(jìn)，構(gòu)建了結(jié)核桿菌最具保護(hù)性免疫原性的AgSfe與Ag^b兩種蛋白(這兩種蛋白卡介苗菌均有所表達(dá))編碼基因的嵌合基因疫苗HGAg85ab，本發(fā)明的HGAg85ab嵌合基因疫苗不僅可用于預(yù)防，更重要的是可用于治療結(jié)核病，尤其是治療耐藥結(jié)核桿菌感染的結(jié)核病人。從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種嵌合基因Ag85ab。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種包含Ag85ab嵌合型基因的結(jié)核桿菌基因疫
田ο本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供這種嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法。本發(fā)明的第四個(gè)目的還在于提供這種嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗在制備預(yù)防和治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種嵌合基因，包含序列1所示編碼結(jié)核桿菌蛋白AgSfe的基因和序列2所示編碼結(jié)核桿菌AgS^3蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中編碼AgS^3蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在AgSfe基因的序列中，嵌合位點(diǎn)為AgSfe基因的第245-250位限制性?xún)?nèi)切酶Kpn I識(shí)別序列或第430-435位內(nèi)切酶Acc I識(shí)別序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，包含序列1所示編碼結(jié)核桿菌蛋白AgSfe的基因和序列2所示編碼結(jié)核桿菌AgS^3蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中編碼Ag8^3蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在AgSfe基因的序列中，嵌合位點(diǎn)為基因的第245-250位限制性?xún)?nèi)切酶Kpn I識(shí)別序列或第430-435位內(nèi)切酶 Acc I識(shí)別序列，編碼結(jié)核桿菌蛋白AgSfe基因連接于真核表達(dá)載體中。本發(fā)明的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗中，真核表達(dá)載體可以是JW4303，或 pcDNA3. 1，或pVAXl系列。優(yōu)選的是pVAXl系列。本發(fā)明的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法包括以下步驟(1)選擇基因中的第M5-250位Kpn I酶切位點(diǎn)，或第430-435位Acc I酶切位點(diǎn)，分別用內(nèi)切酶Kpn I或內(nèi)切酶Acc I消化真核表達(dá)載體中的AgSfe基因，使該表達(dá)載體線性化，并用堿性磷酸酶去磷酸化；(2)分別用帶有內(nèi)切酶Kpn I識(shí)別序列的引物對(duì)，或帶有內(nèi)切酶AccI識(shí)別序列的引物對(duì)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼Ag^b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA片段；(3)用連接酶分別連接步驟(1)的去磷酸化線性AgSfe基因載體與步驟O)的編碼Ag^b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA擴(kuò)增片段，獲得含Ag85ab嵌合基因的質(zhì)粒載體疫苗。本發(fā)明方法中，采用的真核表達(dá)載體優(yōu)選pVAXl。本發(fā)明方法中，采用的引物對(duì)優(yōu)選序列3所示的引物P1和序列4所示的引物P2。本發(fā)明方法中，采用的引物對(duì)優(yōu)選序列6所示的引物P3和序列7所示的引物P4。本發(fā)明還提供這種嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗在制備預(yù)防和治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。用本發(fā)明的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，加或不加左旋咪唑佐劑免疫動(dòng)物，誘導(dǎo)了比單基因質(zhì)粒更強(qiáng)的Thl型免疫應(yīng)答。與抗癆藥聯(lián)用，本發(fā)明的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗與單基因質(zhì)粒疫苗相比，在耐藥結(jié)核桿菌感染動(dòng)物的治療中誘導(dǎo)了相當(dāng)或更強(qiáng)的抗結(jié)核細(xì)胞免疫應(yīng)答和更佳治療效果。發(fā)明詳述文獻(xiàn)檢索顯示結(jié)核桿菌Ag85a與Ag^b抗原蛋白的1_125位氨基酸序列二者彼此差異不大，而125-282位氨基酸序列之間有較大差異，約有40個(gè)左右氨基酸不相同，此區(qū)段二者的編碼核酸序列中共有90多個(gè)堿基不同。在此區(qū)段中Ag^b存在有重要的可誘導(dǎo) Thl 型應(yīng)答反應(yīng)細(xì)胞因子 IFN- γ 和 IL-2 的表位(S. D' Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al ；Mapping ofMurine Thl Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January2003,71(1) :483-493)。本發(fā)明者通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件服務(wù)公司htenet-Based AppliedBioinformatics Company的Epitope Informatics軟件對(duì)結(jié)核桿菌結(jié)構(gòu)蛋白基因的抗原表位進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其抗原表位主要集中在Ag85a的氨基端和羧基端(S. D ‘ Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al ；Mapping ofMurine Thl Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January2003, 71 (1) :483-493)。在不含抗原表位的母體基因中間區(qū)段第245-250位含有Kpn I酶切位點(diǎn)(GGTACC)，第430-435位含有Acc I酶切位點(diǎn) (GTCTAC),故設(shè)計(jì)在此嵌合插入編碼Ag85b的125-282位氨基酸的核苷酸序列片段。本發(fā)明提供的嵌合基因包含序列1所示編碼結(jié)核桿菌蛋白AgSfe的基因和序列 2所示編碼結(jié)核桿菌Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中編碼Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在AgSfe基因的序列中，嵌合位點(diǎn)為AgSfe基因的第 245-250位限制性?xún)?nèi)切酶KpnI識(shí)別序列和/或第430-435位內(nèi)切酶Acc I識(shí)別序列。本發(fā)明提供包含編碼結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原AgSfe全部與保護(hù)性抗原Ag^b的 125-282位氨基酸的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，包括在以下序列1所示的結(jié)核桿菌保護(hù)性結(jié)構(gòu)蛋白基因的第245-250 (GGTACC)位Kpn I酶切位點(diǎn)，或第430-435 (GTCTAC)位 Acc I酶切位點(diǎn)嵌合插入以下序列2所示的編碼AgS^3的125-282位氨基酸的核苷酸序列片段，這種重組的Ag85ab嵌合基因連接于真核表達(dá)載體中。真核表達(dá)載體可選用JW4303， 或pcDNA3. 1，或pVAXl系列。優(yōu)選pVAXl系列。序列基因序列1TTTTCCCGGC CGGGCTTGCC GGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGT
61GACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC
121GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGG
181TACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCC
241GACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTC
301CTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGC
361GCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCC
421CAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGT
481CCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGG
541GGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTG
601ATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGT
661GGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTC
721CAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGT
781ACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGG
841GCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCTAG887序列2 編碼Ag86b蛋白125-282位氨基酸的基因片段序列，GTCTACTCGATGGCCGGCTCGTCGGCAATGATCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCA
TCTACGCCGGCTCGCTGTCGGCCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGGATGGGGCCTAGCCTGA
TCGGCCTCGCGATGGGTGACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGGGGTCCCTCGA
GTGACCCGGCATGGGAGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTGGTCGCAAACA
ACACCCGGCTATGGGTTTATTGCGGGAACGGCACCCCGAACGAGTTGGGCGGTGCCAACA
TACCCGCCGAGTTCTTGGAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGT
ACAACGCCGCGGGCGGGCACAACGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGCACGCACAGCT
GGGAGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGAAGGGTGACCTGCAGAGTTCGTTAG TCTAC 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法包括以下步驟(1)選擇在基因中可插入外源DNA片段的第245-250位KpnI酶切位點(diǎn)，或第430-435位Acc I酶切位點(diǎn)，分別用內(nèi)切酶Kpn I或內(nèi)切酶Acc I消化先前構(gòu)建好的含有AgSfe基因的真核表達(dá)載體pVAXl，使之線性化，并用堿性磷酸酶去磷酸化；(2)分別用一對(duì)帶有內(nèi)切酶Kpn I識(shí)別序列GGTACC的引物，或一對(duì)帶有內(nèi)切酶Acc I識(shí)別序列GTCTAC的引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼Ag^b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA片段；(3)用連接酶分別連接步驟(1)的去磷酸化線性AgSfe基因載體與步驟O)的編碼Ag^b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA擴(kuò)增片段，選擇獲得兩種連接方向正確的嵌合基因疫苗HG85abA和HG85abK載體質(zhì)粒。為擴(kuò)增編碼Ag^b基因125-282位氨基酸的核苷酸序列，本發(fā)明者設(shè)計(jì)了針對(duì)該序列5’端的上游引物Pl序列和3’端的下游引物P2序列(序列3和序列4)，二者均帶有 Acc I酶切位點(diǎn)(GTCTAC)；或上游引物P3序列和下游引物P4序列(序列5和序列6)，二者均帶有Kpn I酶切位點(diǎn)(GGTACC)。合成這兩對(duì)引物后，用PCR技術(shù)擴(kuò)增結(jié)核桿菌Ag85b基因的 PET28A-85B 質(zhì)粒中的該片段(S. D' Souza, V. Rosseels, M. Romano, A etal =Mapping of Murine Thl Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl TransferasesAg85A,Ag85B,and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection andlmmunity, January 2003,71 (1) 483-493)并通過(guò)凝膠電泳回收。同時(shí)用AccI酶或Kpn I酶酶切含結(jié)核桿菌基因的 pVAX-Ag85A 質(zhì)粒載體(Li Z, Song D, Zhang H, et al. Improved Humoral Immunity of Tuberculosis ESAT-6antigen by Chimeric DNA Prime and Protein Boost Strategy", DNA Cell Biol, 2006, 25 (1) :25-29)使之線性化，繼而用堿性磷酸酶對(duì)其作去磷酸化處理并通過(guò)凝膠電泳回收。然后將兩者用T4 DNA連接酶連接起來(lái)，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在卡那霉素抗性培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)生長(zhǎng)出菌落。挑選單個(gè)菌落分別小試管培養(yǎng)后，分別抽提質(zhì)粒作電泳鑒定，再作酶切和電泳鑒定，初步選出正確者經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，重組的Ag85ab嵌合型基因疫苗構(gòu)建成功。據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)和學(xué)術(shù)期刊檢索，均未發(fā)現(xiàn)關(guān)于這種AgSfe與Ag^b 的嵌合基因的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明制備的嵌合基因質(zhì)粒所表達(dá)的嵌合蛋白分子量約為40kD，符合AgSfe全部與Ag85b的125-282位氨基酸相加的分子量，既保留了和Ag85b的抗原性表位，又提供了 Ag85b的IFN- γ和IL-2誘導(dǎo)表位。本發(fā)明的嵌合基因質(zhì)粒單獨(dú)使用或與佐劑左旋咪唑聯(lián)用，免疫小鼠，誘生的血清特異性抗體IgG亞類(lèi)分析和活化淋巴細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子(mRNA)類(lèi)型檢測(cè)分析表明，其主要誘導(dǎo)了 Thl型免疫應(yīng)答，水平顯著優(yōu)于AgSfe和Ag^b單基因質(zhì)粒誘導(dǎo)的。采用本發(fā)明的嵌合質(zhì)粒疫苗聯(lián)用利福平，治療利福平耐藥結(jié)核桿菌感染的小鼠，效果相當(dāng)于或優(yōu)于單基因質(zhì)粒疫苗聯(lián)用利福平。顯示了臨床上用于治療結(jié)核桿菌感染者，尤其是耐藥結(jié)核桿菌感染者的應(yīng)用前景。附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明圖IA是本發(fā)明含有結(jié)核桿菌Ag85abA嵌合型基因的真核表達(dá)載體HG85abA質(zhì)粒的構(gòu)建圖。圖IB是用于構(gòu)建HG85abA質(zhì)粒的pVAX 1載體質(zhì)粒。
圖2顯示初步篩選的含嵌合型HG85abA基因質(zhì)粒(Cl質(zhì)粒)的電泳圖。泳道1. C3 質(zhì)粒；泳道2. C2質(zhì)粒；泳道3. Cl質(zhì)粒；泳道4. pVAXl-Ag85a質(zhì)粒圖3顯示PCR擴(kuò)增的Ag^b基因片段(0. 5kb)與用Acc I酶酶切Cl質(zhì)粒產(chǎn)生預(yù)期的0. 5kb片段的電泳圖。泳道1. 2000DL標(biāo)志；泳道2. PCR擴(kuò)增的Ag^b片段 (0. 5kb 大小與預(yù)期相符)；泳道3. Cl質(zhì)粒經(jīng)AccI酶酶切產(chǎn)生的二片段，圖4顯示Cl質(zhì)粒用Acc I和KpnI雙酶切產(chǎn)生了預(yù)期的三個(gè)片段的電泳圖。泳道 1和7. λ -EcoT14-I digest ；泳道2-4. Cl質(zhì)粒經(jīng)Acc I和KpnI 雙酶酶切產(chǎn)生了預(yù)期大小的三個(gè)片段 0. 2kb+0. 5kb+3. 7kb ；泳道 5. IOObp marker ；泳道 6. 2000DL 標(biāo)志圖5A-I顯示用利福平抗藥性結(jié)核桿菌HB361菌株攻擊后，分別采用對(duì)照或幾種不同質(zhì)粒和/或利福平治療小鼠的肺組織切片病理學(xué)檢查的代表性顯微照片。
具體實(shí)施例方式以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例中主要采用常規(guī)的基因工程分子生物學(xué)克隆方法， 這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例如盧圣棟主編“現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)”， (第二版，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999年12月，北京)；和J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第三版，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)中的有關(guān)章節(jié)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照以下實(shí)施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實(shí)施本發(fā)明，這些修改和變換均屬于本申請(qǐng)書(shū)的權(quán)利要求范圍內(nèi)。實(shí)施例1 含Ag85ab嵌合基因pVAXl質(zhì)粒(HG85abA質(zhì)粒)核酸疫苗的制備主要實(shí)驗(yàn)材料pVAX 1載體質(zhì)粒購(gòu)自hvitrogen公司源自pVAX 1質(zhì)粒載體的含結(jié)核桿菌基因的pVAXl_8fe和含結(jié)核桿菌Ag85b 基因的PET28A-85B質(zhì)粒由上海海規(guī)生物科技有限公司制備(Li Z, Song D，Zhang H，et al. ， Improved humorol immunity againstTuberculosis ESAT-6 antigen by chimeric DNA prime and protein booststrategy. DNA Cell Biol,2006,25(1) :25-29)。堿性磷酸酶、Taq DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品。限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、Hind III和dNTP Mix (混合物)為T(mén)akara公司產(chǎn)品。限制性?xún)?nèi)切酶Acc I, Kpn I和T4 DNA連接酶為MBI公司產(chǎn)品。AXYGEN質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、蛋白胨為0X0ID公司產(chǎn)品。NaCl等化學(xué)品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。硫酸卡那霉素購(gòu)自上海新先鋒藥業(yè)有限公司。凝膠成象拍攝處理系統(tǒng)為上海天能公司產(chǎn)品。制備方法(1)引物設(shè)計(jì)與合成利用軟件PerPrimer設(shè)計(jì)用PCR法擴(kuò)增Ag85b基因(編碼 125-282位氨基酸)片段含有Acc I酶切位點(diǎn)|GTCTAC |的上游引物Pl和下游引物P2寡核苷酸的序列如下Pl :5，-CACATCACGATACCG |GTCTAC[ TCGATGGCCGGCTCGTC-3’ (序列 3)
9
P2 :5，-CACATGCGAATACCG jGTAGACf TAACGAACTCTGCAGGTC-3，(序列 4)將此二序列送hvitrogen公司進(jìn)行合成。(2)卩0 擴(kuò)增汕8513基因(編碼125-282位氨基酸)片段用上沭P1/P2引物(濃度各為lOpmol/μ 1)、以PET28a-^b質(zhì)粒DNA為模板，采用高保真pfu DNA聚合酶，按基因工程分子克隆技術(shù)的常規(guī)方法(參見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”，第三版，85-86頁(yè)，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94°C變性 ^iin ；940C 30s,60°C 30s,72°C 40s 共 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。反應(yīng)體系(50 μ 1)為:10x buffer 5 μ l、Taq DNA 聚合酶 1 μ UMgCl2 5 μ 1 (Mg2+濃度為 1. 5mM)、 dNTP mix (四種 dNTP 的濃度分別為 20 μ Μ) 1 μ l、ddH20 35 μ 1、Ρ1 和 Ρ2 各 1μ l、PET28a_85b 1 μ 1。同樣的反應(yīng)體系共4管，反應(yīng)后合并4管內(nèi)容物用0. 6倍異丙醇沉淀，離心IOmin收集產(chǎn)物用ddH20重溶解，共得到100 μ 1的Ag^b基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳顯示目標(biāo)條帶約為0.5ΚΒ，與8 基因片段的大小相符。將此PCR產(chǎn)物取樣用Acc I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系(50 μ 1)為10x buffer 5 μ 1、Ag85b產(chǎn)物30 μ 1、酶1 μ 1、ddH20 14μ1。37°C水浴過(guò)夜。用DNA凝膠回收試劑盒按照說(shuō)明書(shū)(參見(jiàn)J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”，第三版，第404-407頁(yè)，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)操作，回收該基因DNA片段產(chǎn)物。(3)制備去磷酸化線性pVAXl_Ag85A質(zhì)粒用Acc I限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化含 Ag85a 基因的 pVAXl-Ag85A 質(zhì)粒，酶切反應(yīng)體系(50 μ 1)為10x buffer 5 μ 1 ；pVAXl_85A 30 μ 1 (5 μ g)；酶液1 ；ddH20 14 μ 1。37°C水浴過(guò)夜。酶切產(chǎn)物取樣作瓊脂糖凝膠電泳(見(jiàn)J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”，第三版，387-399 頁(yè)，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京)和成像掃描確定酶切完全，用DNA凝膠回收試劑盒按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法回收此線性質(zhì)粒，再經(jīng)凝膠電泳和成像掃描，顯示回收的DNA條帶與預(yù)計(jì)的3. 9KB大小相符。用堿性磷酸酶對(duì)此3. 9KB的pVAXl-85A線性化質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化處理，反應(yīng)體系為堿性磷酸酶 1 μ 1，pVAXl-85A 線性化載體 30μ 1、ddH2014y l、10x buffer 5 μ 1。37°C 水浴1小時(shí)。反應(yīng)完畢后用DNA凝膠回收試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作，回收此去磷酸化粘性末端的線性PVAX1-85A質(zhì)粒。(4)連接Ag^b基因片段與去磷酸化線性PVAXl_Ag85A質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 反應(yīng)體系OO μ 1)為10x buffer 2μ 1、T4 DNA連接酶2 μ l、Ag85b基因片段14μ 1、去磷酸化pVAXl-Ag85A線性載體2 μ 1，22°C恒溫孵育過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM108感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，取200 μ 1涂布接種卡那霉素抗性LB平板，置37°C培養(yǎng)過(guò)夜。pVAXl載體質(zhì)粒中含有抗卡那霉素基因，被基因重組HG85abA克隆載體質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能在卡那霉素抗性培養(yǎng)基平皿上生長(zhǎng)成為菌落。次日出現(xiàn)數(shù)十個(gè)單菌落，挑取3個(gè)單菌落(C1、C2和 C3)分別接種含卡那霉素抗性LB培養(yǎng)液(約5ml)的三個(gè)試管中，37°C搖床200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。(5)含Ag85ab嵌合基因重組PVAXl質(zhì)粒(HG85abA質(zhì)粒)的提取與鑒定分別取三個(gè)菌落生長(zhǎng)產(chǎn)生的的菌液(分別標(biāo)號(hào)為Cl、C2、C3)各Iml用AXYGEN質(zhì)粒提取試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作抽提質(zhì)粒，取樣作凝膠電泳，電泳條帶顯示Cl質(zhì)粒分子量比pVAXl-8fe質(zhì)粒略大，約為4. 4KB,符合預(yù)期的大小。如圖2所示，Cl質(zhì)粒電泳位置比pVXAl-Ag8fe對(duì)照質(zhì)粒略高，表明Cl質(zhì)粒分子量比pVAXl-8fe質(zhì)粒略大，符合預(yù)期大小(約4. 4KB)，因此初步篩選出此質(zhì)粒作下一步鑒定。取Cl質(zhì)粒作Acc I單酶切鑒定。反應(yīng)體系(10 μ 1)為Acc I Ιμ IOxbufferl μ 1、Cl質(zhì)粒8μ 1，37°C孵育2小時(shí)。取樣作凝膠電泳成像顯示，圖3中泳道3 為Cl質(zhì)粒經(jīng)AccI酶酶切產(chǎn)生的二片段，分子量較小片段的大小(0. 5kb)與預(yù)期的Ag^b 擴(kuò)增片段分子量相符。表明Cl可能為陽(yáng)性克隆子，宜進(jìn)一步鑒定。再用Acc I和Kpn I雙酶切Cl質(zhì)粒，見(jiàn)圖4，泳道2_4為Cl質(zhì)粒經(jīng)AccI和KpnI 雙酶酶切產(chǎn)生了預(yù)期大小的三個(gè)片段0. 2kb+0. 5kb+3. 71Λ，進(jìn)一步確認(rèn)其為正確的陽(yáng)性克隆子PCR擴(kuò)增Cl質(zhì)粒作進(jìn)一步鑒定反應(yīng)體系(50 μ 1)為10x buffer 5 μ l.Taq DNA 聚合酶 1μ UMgCl2 5 μ l.dNTP mix 1 μ l、ddH20 35 μ、引物 Pl 1 μ 1、引物 Ρ2 1μ 1、C1 質(zhì)粒1 μ 1 (0. 1 μ g)。同樣的反應(yīng)體系共3管，陽(yáng)性對(duì)照管為模板AgS^3基因片段，陰性對(duì)照無(wú)基因片段。反應(yīng)條件為94°C變性^iin ；940C 30s,60°C 30s,72°C 40s，共30輪循環(huán)；72°C 延伸5min。分別取3管PCR產(chǎn)物各3 μ 1進(jìn)行凝膠電泳，顯示均擴(kuò)增出0. 5ΚΒ的條帶，與設(shè)計(jì)的Ag^b片段大小吻合，說(shuō)明其為所要的陽(yáng)性克隆子，將Cl質(zhì)粒送^witrogen公司進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序引物為Τ7啟動(dòng)子通用引物和BGH POLY A通用引物，雙向測(cè)通。
0096]Invitrogen公司基因測(cè)序結(jié)果如下(序列5)0097]ATG(Ag85A蛋白氨基端編碼序列)0098]GTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGT0099]GACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC0100]GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGG0101]TACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCC0102]GACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTC0103]CTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGC0104]GCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCC0105]CAGCAGTTCGTCTACTCGATGGCCGGCTCGTCGGCAATGATCTTGGCCGCCTACCACCCC0106]CAGCAGTTCATCTACGCCGGCTCGCTGTCGGCCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGGATGGGG0107]CCTAGCCTGATCGGCCTCGCGATGGGTGACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGG0108]GGTCCCTCGAGTGACCCGGCATGGGAGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTG0109]GTCGCAAACAACACCCGGCTATGGGTTTATTGCGGGAACGGCACCCCGAACGAGTTGGGC0110]GGTGCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGGAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTC0111]CAGGATGCGTACAACGCCGCGGGCGGGCACAACGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGC0112]ACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGAAGGGTGACCTGCAGAGT0113]TCGTTAGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGT0114]CCCACCCTGAT0GGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGG0115]GGCCOGAAGG AGGACCCGGC GTGGCAGCGC AACGACCCGC TGTTGAAOGT OGGGAAGCTG ATCGCCAACA0116]ACACCCGCGTCTGGGTGTACTG0GGCAA0GGCAAGC0GTCGGATCTGGGTGGCAACAACC0117]TGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGA0GCCT
ACAAOGCCGG TGGCGGCCAC AAOGGCGTGT TOGACTTCCC GGACAGCGGT A0GCACAGCTGGGAGTACTG GGG0G0GCAG CTCAACGCTA TGAAGCCCGA CCTGCAAOGG GCACTGGGTG CCA0GCCCAACACCGGGCCC GCGCCCCAGG GCGCCTAG TAAGGATCTCGTC GTTTTGT0GTTTTGTCGTTG GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGCGGCCGCTCGA GTCTAGAGTC CT (Ag85A 蛋白羧基端編碼序列)下劃線表示AccI酶識(shí)別位點(diǎn)。將以上測(cè)定的序列與上文設(shè)計(jì)的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST排列對(duì)比檢索，結(jié)果表明1365個(gè)堿基中除結(jié)構(gòu)基因的第一個(gè)堿基G與原基因中的T不同外，其余都相同。由于pVAXl載體要求在起始密碼子ATG后的第四個(gè)堿基必須是G (稱(chēng)Kozak序列)，才能獲得基因在真核生物體內(nèi)較高的表達(dá)。此第一個(gè)堿基G是先前設(shè)計(jì)pVAXl-Ag85A時(shí)為增強(qiáng)表達(dá)而更改，因此，獲得的重組HG85abA質(zhì)粒中的Ag85abA嵌合基因序列正確。(6)核酸疫苗(HG85abA質(zhì)粒)的配制與貯存將用AXYGEN質(zhì)粒抽提試劑盒純化的重組HG85abA質(zhì)粒溶解于磷酸生理鹽水(PBS)中，濃度為lmg/ml ；或制備為凍干制劑貯存，用前溶解于PBS中。實(shí)施例2 含Ag85ab嵌合基因PVAXl質(zhì)粒(HG85abK質(zhì)粒)核酸疫苗的制備主要實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)施例1相同制備方法(1)引物設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增^8 基因(編碼125-282位氨基酸)片段含有Kpn I酶切位點(diǎn)|GGTACq的以下上游引物P3和下游引物P4寡核苷酸序列P3 5，-CACATCACGATACCG |GGTACC[ TCGATGGCCGGCTCGTC-3，(序列 6)P4 5，-CACATGCGAATACCG |GGTACC| TAACGAACTCTGCAGGTC-3，(序列 7)將此二序列送hvitrogen公司進(jìn)行合成。(2)PCR擴(kuò)增Ag85b基因(編碼125-282位氨基酸)片段方法與實(shí)施例1相同， 但采用上述P3/P4引物。(3)制備去磷酸化線性PVAXl-A勸5A質(zhì)粒方法與實(shí)施例1相同，但采用Kpn I酶。(4)連接Ag^b基因片段與去磷酸化線性PVAXl_Ag85A載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌方法與實(shí)施例1相同。(5)含Ag85ab嵌合基因重組pVAXl質(zhì)粒(HG85abK質(zhì)粒)的提取與鑒定方法與實(shí)施例1相同，但所得的Kl質(zhì)粒單酶切鑒定采用Kpn I酶，雙酶切鑒定采用Nhe I和BamH I酶，單酶切得到一條0. 5kb大小的條帶，與預(yù)期的Ag^b基因片段相符；雙酶切產(chǎn)生了 31Λ 的載體PVAXl和1. 4kb的HG 85ab嵌合基因兩個(gè)預(yù)期條帶，進(jìn)一步確認(rèn)Kl為正確陽(yáng)性克隆子。Kl質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增作進(jìn)一步鑒定采用P3和P4引物，其方法與實(shí)施例1相同。Kl質(zhì)粒送Ivitrogen公司測(cè)序方法也與實(shí)施例1相同。測(cè)序結(jié)果表明獲得的重組HG85abK質(zhì)粒中的Ag85abK嵌合基因序列正確。Invitrogen公司基因測(cè)序結(jié)果如下(序列8)ATG (Ag85A蛋白氨基端編碼序列)GTTTCCCGGC CGGGCTTGCC GGTGGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGTGACATCAAGG TCCAATTCCA MGTGGTGGT GCCMCTCGC CCGCCCTGTA CCTGCTCGAC
GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGG
TACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCC
GACTGGTACCTCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCA
TCTACGCCGGCTCGCTGTCGGCCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGGATGGGGCCTAGCCTGA
TCGGCCTCGCGATGGGTGACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGGGGTCCCTCGA
GTGACCCGGCATGGGAGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTGGTCGCAAACA
ACACCCGGCTATGGGTTTATTGCGGGMCGGCACCCCGAACGAGTTGGGCGGTGCCAACA
TACCCGCCGAGTTCTTGGAGMCTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGT
ACAACGCCGCGGGCGGGCACMCGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGCACGCACAGCT
GGGAGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGMGGGTGA CCTGCAGAGT TCGTTAGGTA CC
AGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTCCTGACCAGCG
AGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGCGCCGTCGTCG
GTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCG
TCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGA
TCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACMGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGG
AGGACCCGGCGTGGCAGCGCMCGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACA
ACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGTGGCMCMCC
TGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCMGTTCCAAGACGCCT
ACMCGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCT
GGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGGGCACTGGGTG
CCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCTAG TAAGGATCTCGTCGTTTTGTCGT
TTTGTCGTTGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGC
GGCCGCTCGAGTCTAGAGTCCT(Ag85A蛋白羧基端編碼序列)
0164] (6)核酸疫苗(HG85abK質(zhì)粒)的配制與貯存方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3 嵌合型結(jié)核桿菌核酸疫苗HG85abA質(zhì)粒或HG85abK質(zhì)粒的體外基因表達(dá)采用InT體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)(ftOmega，Madison, WI, USA)按照美國(guó)Promega公司說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟，將每份12. 5微升反應(yīng)系統(tǒng)中含有0. 25 μ g HG85ab質(zhì)粒DNA禾Π 9 μ 1 TnT Τ7快速反應(yīng)母液，30°C與每毫升含400uCi[S35]標(biāo)記的甲硫氨酸液孵育90分鐘。將該嵌合基因表達(dá)的蛋白質(zhì)(帶有[S35]放射性)作常規(guī)10% SDS-PAGE電泳，用放射自顯影法觀察蛋白質(zhì)泳動(dòng)位置，顯示所表達(dá)的嵌合蛋白分子量約為40kDa，符合AgSfe蛋白分子量(約 32kDa)與Ag^b片段(125-282氨基酸)分子量(約18kDa)之和。實(shí)施例4 結(jié)核桿菌嵌合基因HG85abA或HG85abK質(zhì)粒接種小鼠誘導(dǎo)血清特異性抗體應(yīng)答水平的測(cè)定(ELISA法)和Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的檢測(cè)(逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR 法)(1)材料和免疫方法取8周齡雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分組，每組6只，飼養(yǎng)在上海公共衛(wèi)生中心的 SPF(Specific Pathogen Free)級(jí)動(dòng)物房中。第1組(pVAXl_Ag8fe單基因質(zhì)粒)，第二組 (pVAXl-Ag85b單基因質(zhì)粒，上海海規(guī)生物科技有限公司制)，第三組(HG85abA嵌合基因質(zhì)粒)和第四組(HG85abK嵌合基因質(zhì)粒)小鼠每次分別于脛前肌注射10μ g各質(zhì)粒液，或各質(zhì)粒與0. 25mg左旋咪唑的混合液，注射后立即用帶電極的夾子夾住注射部位，用WJ-2002 活體基因?qū)雰x(寧波新芝生物科技股份有限公司)進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(電壓100V ；脈沖次數(shù)正反各6次；波寬60毫秒；間隔10毫秒)。每隔兩周質(zhì)粒免疫一次，共3次。三次質(zhì)粒免疫后第10天經(jīng)小鼠心臟穿刺采血分離血清-20°C保存。(2)常規(guī)ELISA間梓法檢測(cè)丨各小鼠血清杭Ag85a的IgG亞類(lèi)杭體的效價(jià)以純化的重組Ag85a蛋白(1. 25 μ g/mL) 4°C包被96孔酶標(biāo)板(50 μ 1/孔)過(guò)夜， 用0. 15Μ PBS-吐溫20洗滌3次后每孔用100 μ 1 0. 5%牛血清白蛋白封閉1小時(shí)。洗滌3 次后各孔中分別加入1 100小鼠血清的2倍倍比(1 200-1 102400)稀釋液(50 μ 1/ 孔)37°C孵育2小時(shí)。洗滌后分別加入1 10，000稀釋的堿性磷酸標(biāo)記羊抗小鼠IgGl或羊抗小鼠IgG^i抗體(Sigma，Cat#A3688)37°C孵育1. 5小時(shí)。再經(jīng)洗滌后加入底物液顯色， 30分鐘后加入3M NaOH終止反應(yīng)用酶標(biāo)儀作OD4tl5nm檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表1。(3) RT-PCR檢測(cè)相關(guān)Th細(xì)胞因子mRNA的表汰小鼠心臟穿刺采血后無(wú)菌取各小鼠雙腹股溝淋巴結(jié)同組合并，分離淋巴細(xì)胞。各組取等量淋巴細(xì)胞以TRIzoL試劑提取總RNA，各取4 μ IRNA在同樣條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后取獲得的各cDNA 5μ1用以下三對(duì)特異性引物作PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C變性5min ； 94 0C 45s、55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35輪循環(huán)。各取12μ1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳，用天能公司成象系統(tǒng)拍攝和作相對(duì)定量處理。所述引物序列為擴(kuò)增管家基因(GAPDH)的上下游引物5，-CTGCACCACCAATGCTTAG-3，(序列 9)禾口5，-GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3，(序列 10)擴(kuò)增IL-4基因的上下游引物5，-TCCACGGTAGCGACAAAAAT-3，(序列 11)禾口5，-TGAAATCCAGGCATCGAAAAG-3，(序列 12)擴(kuò)增IFN- γ基因的上下游引物5，-TCTGAGACAATGAACGATAC-3，(序列 13)禾口5，-GGACCTGTGGGTTGTTGA-3，(序列 14)將得到的IL-4基因與IFN- γ基因mRNA表達(dá)量與GAPDH基因表達(dá)量作比較，并求得二者比值，結(jié)果見(jiàn)表2。表1 不同結(jié)核桿菌基因質(zhì)粒疫苗接種及相應(yīng)蛋白質(zhì)疫苗加強(qiáng)后小鼠血清結(jié)核桿菌AgSfe特異性抗體水平檢測(cè)(ELISA)
權(quán)利要求
1.一種嵌合基因，包含序列1所示編碼結(jié)核桿菌蛋白AgSfe的基因和序列2所示編碼結(jié)核桿菌AgS^3蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中所述編碼AgS^3蛋白125-282 位氨基酸序列片段的基因嵌合在AgSfe基因的序列中，嵌合位點(diǎn)為AgSfe基因的第對(duì)5-250 位限制性?xún)?nèi)切酶Kpn I識(shí)別序列和/或第430-435位內(nèi)切酶Acc I識(shí)別序列。
2.一種嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的嵌合基因，所述嵌合基因連接于真核表達(dá)載體中。
3.如權(quán)利要求2所述的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，其中所述真核表達(dá)載體為JW4303， 或 pcDNA3. 1，或 pVAXl 系列。
4.如權(quán)利要求2所述的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，其中所述真核表達(dá)載體為pVAXl系列。
5.權(quán)利要求2所述嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)選擇Ag85a基因中的第M5-250位KpnI酶切位點(diǎn)，或第430-435位Acc I酶切位點(diǎn)，分別用內(nèi)切酶Kpn I或內(nèi)切酶Acc I消化真核表達(dá)載體中的AgSfe基因，使該表達(dá)載體線性化，并用堿性磷酸酶去磷酸化；(2)分別用帶有內(nèi)切酶KpnI識(shí)別序列的引物對(duì)，或帶有內(nèi)切酶AccI識(shí)別序列的引物對(duì)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼Ag^b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA片段；(3)用連接酶分別連接步驟(1)的去磷酸化線性AgSfe基因載體與步驟O)的編碼 Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA擴(kuò)增片段，獲得含Ag85ab嵌合基因的質(zhì)粒載體疫苗
6.權(quán)利要求5所述嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法，其中所述的引物對(duì)為序列3 所示的引物Pl和序列4所示的引物P2。
7.權(quán)利要求5所述嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法，其中所述的引物對(duì)為序列6 所示的引物P3和序列7所示的引物P4。
8.權(quán)利要求2所述嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗在制備預(yù)防和治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述結(jié)核病是耐藥結(jié)核桿菌感染的結(jié)核病。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗是單獨(dú)使用或與抗結(jié)核藥物聯(lián)用。
11.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗在應(yīng)用中可加疫苗佐劑。
12.如權(quán)利要求11所述的的應(yīng)用，其中所述佐劑是左旋咪唑。
全文摘要
提供一種嵌合基因，包含編碼結(jié)核桿菌蛋白Ag85a的基因和嵌合在Ag85a基因第245-250位Kpn I識(shí)別序列和/或第430-435位Acc I識(shí)別序列的編碼結(jié)核桿菌Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因。提供包含上述嵌合基因的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗，其中Ag85a基因連接于真核表達(dá)載體中。還提供該嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗的制備方法，包括PCR擴(kuò)增所述的Ag85b基因片段；將擴(kuò)增的Ag85b基因片段插入到包含Ag85a基因的真核表達(dá)載體中；然后用連接酶進(jìn)行連接。本發(fā)明的嵌合型結(jié)核桿菌基因疫苗可用于治療耐藥結(jié)核桿菌感染，也可與佐劑左旋咪唑聯(lián)用，誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗結(jié)核細(xì)胞免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P31/06GK102268446SQ20101019124
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者劉慶良, 吳雪瓊, 張俊仙, 張平靜, 李忠明, 梁艷, 陽(yáng)幼榮 申請(qǐng)人:上海海規(guī)生物科技有限公司, 中國(guó)人民解放軍第三○九醫(yī)院