專利名稱：編碼p185neu蛋白質(zhì)序列變體的質(zhì)粒及其治療用途的制作方法
編碼P185NEU蛋白質(zhì)序列變體的質(zhì)粒及其治療用途本申請(qǐng)是發(fā)明人于2005年10月13日提交的題為“編碼P185NEU蛋白質(zhì)序列變體 的質(zhì)粒及其治療用途”的中國(guó)專利申請(qǐng)200580040057. 3的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及包含編碼pl85neu蛋白質(zhì)的截短形式和嵌合形式的DNA序列的質(zhì)粒載 體，以及其在抗表達(dá)P185neu蛋白質(zhì)的Her-2/neu (ErbB-2)-陽(yáng)性腫瘤的DNA接種中的用 途。本發(fā)明的質(zhì)粒能夠引發(fā)抗表達(dá)P185-蛋白質(zhì)的腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答，該保護(hù)性免疫 應(yīng)答基于抗體和/或T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)。本發(fā)明還涉及包含此類質(zhì)粒的藥物組合物及其在 ρ15η -陽(yáng)性腫瘤的預(yù)防性或治療性治療中的用途。
背景技術(shù)：
由于贅生性細(xì)胞異常表達(dá)一些蛋白質(zhì)，它們通常不同于正常細(xì)胞。由于此異常表 達(dá)，一些蛋白質(zhì)可以作用為腫瘤相關(guān)抗原(TM)。這是因?yàn)樗拗髅庖呦到y(tǒng)可以識(shí)別這些異常 并且引發(fā)可以保護(hù)宿主免于腫瘤發(fā)作和發(fā)展的免疫應(yīng)答。作為抗腫瘤免疫治療的靶標(biāo)，TAA 必須 在瘤生長(zhǎng)的某些階段具有致病作用； 即使在當(dāng)腫瘤產(chǎn)生不再表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(HLA)糖蛋白的克隆變體 時(shí)，也可以被免疫系統(tǒng)檢測(cè)； 被抗體和T淋巴細(xì)胞識(shí)別。近年來(lái)，已經(jīng)在人癌中發(fā)現(xiàn)了一些TAA。在它們中，Her-2/neu (ErbB2)癌基 因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物Pl85neu是免疫治療特別適合的靶標(biāo)(Lollini和Forni, 2003, Trends Immunol. 24 62)。pl85neu是膜受體，屬于I類受體酪氨酸激酶家族，該家族還包括表皮生長(zhǎng) 因子受體(EGF-R或ErbB-I)和在細(xì)胞增殖和分化中起關(guān)鍵作用的其他相關(guān)受體(ErbB_3、 ErbB-4)(Hynes和 Stern，1994，BBA 1198 165)?？梢詫l85neu受體蛋白質(zhì)再分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域胞外結(jié)構(gòu)域(EC結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié) 構(gòu)域(TM結(jié)構(gòu)域)和胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域(IC結(jié)構(gòu)域)。近來(lái)，已經(jīng)公開了人和大鼠pl85neu蛋白 質(zhì)的EC結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)。已經(jīng)描述了此結(jié)構(gòu)域由4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(I/L1、II/CR1、III/L2和 IV/CR2)組成，總共有大約630個(gè)氨基酸。另外，還說(shuō)明了 pl85neu蛋白質(zhì)具有剛性構(gòu)象，這 允許其與其他ErbB受體相互作用、二聚化，并且即使該蛋白質(zhì)沒有直接結(jié)合配體也能誘導(dǎo) 增殖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Cho等人，2003，Nature 421 :756)。Her-2/neu (ErbB2)癌基因參與胚胎器官發(fā)生和上皮生長(zhǎng)的正常過(guò)程，盡管其在 成體中僅以微弱水平表達(dá)(Press等人，1990，Oncogene 5:953)。在人中，此癌基因的過(guò)量 表達(dá)主要是由于基因擴(kuò)增引起的。Her-2/neU(ErbB2)癌基因在大約30%的乳癌中過(guò)量表 達(dá)，并且此類過(guò)量表達(dá)與更快的腫瘤增殖相關(guān)(Slamon等人，1989，Science 244 707)。在 已經(jīng)提出的不同方案中，DNA接種似乎是引發(fā)抗Her-2/neu-陽(yáng)性腫瘤的免疫應(yīng)答的有效 方法。盡管Pl85neu蛋白質(zhì)是“自身”抗原，即在體內(nèi)正常存在的蛋白質(zhì)，患有pl85neu-陽(yáng) 性乳癌的患者通常表現(xiàn)出細(xì)胞和體液的免疫應(yīng)答(Signoretti等人，2000，J. Natl. Cancer Inst. 23 1918 ；Disis 等人，1994，Cancer Res. 54 16 ；Peoples 等人，1995，Proc. Natl.
3Acad. Sci.美國(guó)92:432)。針對(duì)pl85neu蛋白質(zhì)的抗腫瘤免疫治療的一個(gè)目標(biāo)是在有預(yù)先 存在的免疫應(yīng)答的患者中增加應(yīng)答強(qiáng)度，或在未檢測(cè)到此應(yīng)答的患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 P185-蛋白質(zhì)是“自身”抗原的事實(shí)使得該疫苗必須能夠克服免疫耐受狀態(tài)。本專利申請(qǐng)的發(fā)明人率先使用了 DNA接種并且評(píng)估了 DNA接種在引發(fā)對(duì)自發(fā)乳 癌和移植性Her-2/neu-陽(yáng)性腫瘤的免疫保護(hù)中的功效。這些研究已經(jīng)證明了癌前病變的 預(yù)防和治療是可達(dá)到的目標(biāo)。特別地，在旨在預(yù)防轉(zhuǎn)基因小鼠中由于大鼠Her-2/neu癌基 因(FVB/neuT小鼠和BALB-neuT小鼠)引起自發(fā)乳癌發(fā)展的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)表明與編碼全長(zhǎng) Pl85neu蛋白質(zhì)的質(zhì)?；騼H編碼其EC結(jié)構(gòu)域(分泌的抗原)的質(zhì)粒相比，編碼大鼠pl85-蛋 白質(zhì)EC和TM結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒能夠引發(fā)更有效的保護(hù)(Amici等人，2000，Gene Ther. 7 703 ； Rovero 等人，2000，J. Immunol. 165 :5133)。Chen 等人(1998，Cancer Res. 58 1965)報(bào)道了 類似的數(shù)據(jù)。另外，已經(jīng)表明當(dāng)肌內(nèi)接種質(zhì)粒時(shí)，如果隨后接著非常短的電脈沖，那么將強(qiáng) 烈增加用DNA質(zhì)粒接種的功效(Quaglino等人，2004，Cancer Res. 64 2858)。其他作者已 經(jīng)說(shuō)明了編碼全長(zhǎng)P185-蛋白質(zhì)的質(zhì)粒(根據(jù)需要突變以使其不具有酪氨酸激酶活性)有 效預(yù)防了 Pl85neu-陽(yáng)性癌細(xì)胞移植后腫瘤的發(fā)作(Wei-Zen等人，1999，Int. J. Cancer 81 748)。已經(jīng)證明了同樣的質(zhì)粒是非常有效的，即使是缺乏用于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工的前 導(dǎo)信號(hào)，它們也導(dǎo)致了 Pl85nw抗原的胞質(zhì)定位。當(dāng)使用編碼由于前導(dǎo)信號(hào)存在而定位在膜 中的P185-蛋白質(zhì)的質(zhì)粒時(shí)，保護(hù)依賴于依靠抗體的免疫應(yīng)答。相反，如果疫苗不包含前 導(dǎo)信號(hào)并且因此Pl85neu蛋白質(zhì)位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞質(zhì)中而不是它們的質(zhì)膜中，觀察到T淋巴 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(Pilon等人，2001，J. Immunol. 167 3201)。另外，通過(guò)使用具有前導(dǎo) 信號(hào)的質(zhì)粒和那些其中缺失了此前導(dǎo)信號(hào)的質(zhì)粒而得到的組合接種在防止腫瘤生長(zhǎng)中更 有效(Piechocki等人，2001，J. Immunol. 167 3367)。這證明了在pl85neu-陽(yáng)性癌的預(yù)防中 在體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答之間存在協(xié)同作用(Reilly等人，2001，Cancer Res. 61 :880)。已經(jīng)證明通過(guò)對(duì)腫瘤排斥起協(xié)同作用的一些效應(yīng)子免疫系統(tǒng)機(jī)制(T輔助細(xì)胞和 T殺傷細(xì)胞、抗體、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、Fc受體、IFN-Y和穿孔蛋白)的 參與，用編碼EC和TM結(jié)構(gòu)域(EC-TM質(zhì)粒)的質(zhì)粒接種不僅在預(yù)防自發(fā)pl85neu-陽(yáng)性癌中 有效，而且在治療直徑為2mm的腫瘤塊中也有效(Curcio等人，2003，J. Clin. Invest. Ill 1161)。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)構(gòu)建了編碼大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)TM結(jié)構(gòu)域和EC結(jié)構(gòu)域的減少部分的 一些質(zhì)粒。將通過(guò)缺失NH2-末端240個(gè)堿基對(duì)(bp)或該長(zhǎng)度的倍數(shù)得到的截短的質(zhì)粒使 用在旨在防止移植的大鼠過(guò)量表達(dá)P185-蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞(TUB0細(xì)胞)生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中。 此外，通過(guò)將人ErbB2cDNA的NH2-末端部分添加到截短形式的大鼠蛋白質(zhì)的編碼序列中以 重構(gòu)全蛋白質(zhì)序列，由此產(chǎn)生編碼嵌合P185-蛋白質(zhì)形式的一系列質(zhì)粒。在用編碼全長(zhǎng)EC和TM結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒接種后實(shí)現(xiàn)的保護(hù)主要是由于抗體的產(chǎn)生， 盡管通過(guò)使用編碼截短形式的大鼠P185-蛋白質(zhì)的質(zhì)粒達(dá)到的保護(hù)在很多情形中與顯著 性的抗體產(chǎn)生不相關(guān)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的抗體和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答 的質(zhì)粒。
一方面，本發(fā)明涉及包含pl85neu蛋白質(zhì)片段編碼序列或嵌合的pl85neu蛋白質(zhì)的 編碼序列的質(zhì)粒，所述Pl85neu蛋白質(zhì)片段編碼序列選自SEQ ID N0:l-5 ；所述嵌合pl85neu 蛋白質(zhì)的編碼序列選自SEQ IDNO :6-12(編碼人和大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的基因的參考序列儲(chǔ) 存在GeneBank中，登錄號(hào)分別為Ml 1730和X03362)。將編碼本發(fā)明pl85neu蛋白質(zhì)的截短形式和嵌合形式的DNA序列插入到適合用于 哺乳動(dòng)物特別是人中的任何質(zhì)粒載體中。除了上述編碼序列外，質(zhì)粒可以包含位于編碼序 列上游的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的功能性元件(特別是啟動(dòng)子，優(yōu)選是CMV啟動(dòng)子)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序 列、選擇性標(biāo)記，優(yōu)選是氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因、CpG基序、聚腺苷酸化位點(diǎn)，以及 任選的增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄激活子。調(diào)控轉(zhuǎn)錄的元件必須適合于在哺乳動(dòng)物特別是人中使用的載 體。另一方面，本發(fā)明涉及包含如上所定義的DNA質(zhì)粒以及可藥用載體和賦形劑的藥 物組合物?？蛇x地，該組合物可以包含編碼截短形式和嵌合形式的P185-蛋白質(zhì)的兩種或 多種不同的質(zhì)粒的混合物。適于腸胃外施用的藥物組合物(優(yōu)選是注射溶液形式)優(yōu)選用 于DNA接種。DNA接種的原理和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且描述在例如Liu，2003 ； J. Int. Med. 253 402 中。使用編碼pl85neu截短形式和嵌合形式的質(zhì)粒從而針對(duì)pl85neu_陽(yáng)性(Her-2/ neU-、ErbB-2-陽(yáng)性)腫瘤進(jìn)行預(yù)防性和治療性接種具有多種改善其功效的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于編 碼截短形式的質(zhì)粒，這些優(yōu)點(diǎn)是1)可以得到僅編碼確定的TAA部分的疫苗，希望針對(duì)所述TAA部分產(chǎn)生免疫應(yīng)答； 該疫苗具有較小的機(jī)會(huì)引發(fā)自身免疫現(xiàn)象。2)僅誘導(dǎo)一些所選擇形式的免疫應(yīng)答，即抗體介導(dǎo)的形式或T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的形式。3)通過(guò)彼此結(jié)合編碼不同截短形式的cDNA片段(不必是順序的)，可以產(chǎn)生組合 了具有所定義免疫原性的多重表位的疫苗。通過(guò)組合來(lái)自不同動(dòng)物物種的截短形式的ρ 185-生成的嵌合質(zhì)?？捎糜赼)用編碼待免疫的相同物種(例如人)的蛋白質(zhì)決定簇的質(zhì)粒的接種，其能夠引 發(fā)特異性的高親和性應(yīng)答；b)將編碼待免疫的相同物種的抗原決定簇的質(zhì)粒與編碼來(lái)自其他物種的抗原決 定簇的cDNA序列組合，抗原決定簇表現(xiàn)基本類似，但是不同在于來(lái)自其他物種的那些決定 簇引發(fā)了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，因此克服了耐受狀態(tài)。這些異源決定簇(被識(shí)別為部分外源的) 作為誘導(dǎo)促進(jìn)更強(qiáng)的應(yīng)答和細(xì)胞因子釋放的輔助決定簇；c)將編碼相同物種的抗原決定簇的質(zhì)粒與cDNA序列組合，所述cDNA序列通過(guò)編 碼其他物種的決定簇在一些個(gè)體中引起heteroclytic決定簇，該決定簇更高親和性地結(jié) 合HLA分子并且誘導(dǎo)具有更高親和性的更強(qiáng)的免疫應(yīng)答；d)具有組合了 a)的優(yōu)點(diǎn)和來(lái)自b)和C)的那些優(yōu)點(diǎn)的疫苗。將本發(fā)明的適當(dāng)配制的DNA質(zhì)粒用在下列的預(yù)防性或治療性治療中表現(xiàn)出發(fā)展 pl85neu_陽(yáng)性癌高危險(xiǎn)性的人或動(dòng)物，或者患有pl85neu_陽(yáng)性原發(fā)腫瘤、其復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移瘤的 患者。當(dāng)腫瘤還不明顯時(shí)，預(yù)防是首要的；當(dāng)腫瘤處于其初期作為癌前病變時(shí)，預(yù)防是次要 的；或如果觀察到了腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移過(guò)程，預(yù)防是第三位的。
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可用本發(fā)明質(zhì)?；蚪M合物治療的腫瘤主要是上皮來(lái)源的那些，特別是肺、卵巢和 乳腺腺癌；鱗狀頭部和頸部癌，以及更普遍地為表達(dá)P185-蛋白質(zhì)的腫瘤。發(fā)明詳述編碼截短形式的大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒主鏈pCMV3. 1(在我們實(shí)驗(yàn)室中從來(lái)自Invitrogen，Milan，意大利的 pcDNA3. 1起始得到的)用來(lái)產(chǎn)生編碼大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)TM結(jié)構(gòu)域和EC結(jié)構(gòu)域縮 短部分的DNA質(zhì)粒。pCMV3. 1包含大鼠Her-2/neu 5’ UTR核苷酸序列(其被轉(zhuǎn)錄但是未 被翻譯)和前導(dǎo)序列(neuL)。使用pCMV-EC-TM載體(Amici等人，2000，Gene Ther.，7 703 ；Rovero等人，2000，J. Immunol. , 165 5133)作為模板、T7引物作為有義寡核苷酸(寡 核苷酸#1)，以及具有末端EcoRI位點(diǎn)的寡核苷酸(寡核苷酸#2)作為反義寡核苷酸，通 過(guò)DNA的酶促擴(kuò)增，得到大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的分泌信號(hào)DNA片段。在純化和用HindIII和 EcoRI限制酶消化后，將擴(kuò)增的片段克隆到已經(jīng)用同樣的酶消化的pCMV3. 1質(zhì)粒中，因此得 到pCMV3. 1-neuL。隨后，將編碼大鼠pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域缺失片段和全長(zhǎng)TM結(jié)構(gòu)域的 7種不同的序列符合讀框地插入到用EcoRI和XbaI限制酶消化的pCMV3. 1-neuL載體中。 將這樣得到的新質(zhì)粒稱作pCMV3. l-neuL-rECl-TM(-70 個(gè)氨基酸)(圖 1)、pCMV3. l-neuL-rEC2-TM(-150 個(gè)氨基酸)(圖 2)、pCMV3. l-neuL-rEC3-TM(-230 個(gè)氨基酸)(圖 3)、pCMV3. l-neuL-rEC4-TM(-310 個(gè)氨基酸)(圖 4)、pCMV3. l-neuL-rEC5-TM(-390 個(gè)氨基酸)(圖 5)、pCMV3. l-neuL-rEC6-TM(-470 個(gè)氨基酸)(圖 6)和
pCMV3. l-neuL-rEC7-TM(-550個(gè)氨基酸)(圖7)。這些質(zhì)粒中的第一個(gè)編碼的片 段減少70個(gè)氨基酸(包括分泌信號(hào)氨基酸序列在內(nèi))。所有其他片段逐個(gè)減少80個(gè)氨基酸。使用7種不同的都具有末端EcoRI的限制性位點(diǎn)的有義寡核苷酸(寡核苷 酸#3-#9)，和能夠識(shí)別在pCMV3. 1多克隆位點(diǎn)3 ’端的被稱作“pcDNA3. 1/BGH反向引 發(fā)位點(diǎn)”(830-850nt)的位點(diǎn)的反義寡核苷酸，通過(guò)DNA的酶促擴(kuò)增，產(chǎn)生這些片段。 使用 pCMV-EC-TM 載體(Amici A.等人 2000，Gene Ther. 7 703 ；Rovero 等人，2000， J. Immunol. 165 5133)作為用于PCR的DNA模板。在用EcoRI和XbaI限制酶酶促消化后， 將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到PCMV3. Ι-neuL質(zhì)粒中。用pCMV3. l-neuL-rEC4-TM質(zhì)粒接種以及用編碼全長(zhǎng)EC和TM結(jié)構(gòu)域的 PCMV3. 1-neuL-rEC-TM質(zhì)粒接種保護(hù)了 100%的BALB/c小鼠免于發(fā)展由TUBO細(xì)胞接種誘 導(dǎo)的腫瘤。另一方面，用編碼前3個(gè)截短形式的pl85neu蛋白質(zhì)的pCMV3. 1-neuL-rECl-TM、 pCMV3. l-neuL-rEC2-TM 和 pCMV3. l-neuL-rEC3_TM 質(zhì)粒接種保護(hù) 了 70-80 % 的 BALB/c 小 鼠。編碼第5個(gè)截短形式的pCMV3. l-neuL-rEC5-TM質(zhì)粒保護(hù)50 %的BALB/c小鼠，而編 碼第6個(gè)和第 個(gè)截短形式的pCMV3. l-neuL-rEC6-TM和pCMV3. l_neuL-rEC7_TM質(zhì)粒沒 有誘導(dǎo)出保護(hù)。得到的結(jié)果證明了由定位在胞質(zhì)中的P185-蛋白質(zhì)截短形式激活的細(xì) 胞應(yīng)答在抗腫瘤預(yù)防中是充分的。但是，細(xì)胞和體液應(yīng)答的組合激活可用來(lái)得到更有效 的治療(Rielly等人，2001，Cancer Res. 61 :880)。為了實(shí)現(xiàn)抗體產(chǎn)生，接種必須用編碼pl85neu蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)EC和TM結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行。用編碼缺乏氨基酸1-310的第4個(gè) 截短pl85neu形式的pCMV3. l-neuL-rEC4-TM質(zhì)粒接種仍能夠賦予全保護(hù)，但是抗體應(yīng)答比 pCMV3. 1-neuL-rEC-TM 質(zhì)粒低 10 倍(表 1)。表 1 能夠編碼pl85neu蛋白質(zhì)的7種不同融合形式的嵌合人-大鼠質(zhì)粒(HuRTl-7)的 構(gòu)建HLA具有的大多數(shù)表位位于pl85neu蛋白質(zhì)的第一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(I/L1)。因此，構(gòu) 建編碼人ErbB2蛋白質(zhì)序列的嵌合質(zhì)粒以誘導(dǎo)針對(duì)這些表位的特異性免疫應(yīng)答，所述的人 ErbB2蛋白質(zhì)序列從朋2端(EC結(jié)構(gòu)域的最外側(cè)部分)開始逐漸增長(zhǎng)。通過(guò)將人ErB2cDNA 的缺失部分添加到編碼大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)截短形式中來(lái)產(chǎn)生這些新質(zhì)粒(被稱作HuRT，人 大鼠跨膜)。用HindIII和EcoRI限制酶消化編碼大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)TM結(jié)構(gòu)域和EC 結(jié)構(gòu)域的減少片段的前5個(gè)截短質(zhì)粒。將通過(guò)PCR及在其末端消化得到的5種不同的 人cDNA片段克隆到這5個(gè)截短的質(zhì)粒中，從而保持閱讀框。通過(guò)使用pcDNA3. lerbB2質(zhì) 粒作為模板，擴(kuò)增產(chǎn)生待插入的編碼人pl85neu蛋白質(zhì)部分的cDNA片段，其包含5’ UTR區(qū) 和穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌信號(hào)。將6個(gè)寡核苷酸用作引物。對(duì)于所有六種引物，有義寡核苷 酸是相同的，并且對(duì)應(yīng)著T7引物(寡核苷酸#1)，而設(shè)計(jì)5種反義寡核苷酸使得它們識(shí) 別在序列逐漸靠前的位置中的人ErbB2癌基因cDNA(寡核苷酸#11-#15)。在純化以及 用HindIII和EcoRI限制酶消化后，將擴(kuò)增的片段插入相應(yīng)的質(zhì)粒(pCMV3. 1-rECl-TM、 pCMV3. l-rEC2-TM、pCMV3. l_rEC3_TM、pCMV3. l_rEC4_TM、pCMV3. l_rEC5_TM)，所述質(zhì)粒已經(jīng) 預(yù)先用相同的限制酶消化。以這種方式得到了 5個(gè)編碼長(zhǎng)度為689個(gè)氨基酸的嵌合蛋白質(zhì) 的新質(zhì)粒(PCMV3. l-HuRTl-5)，其中的兩個(gè)氨基酸(Glu-Phe)屬于用來(lái)連接人和大鼠DNA的 EcoRI限制性位點(diǎn)。這些嵌合質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)增加人pl85neu蛋白質(zhì)部分和減少大鼠 pl85neu蛋白質(zhì)部分而彼此不同。為了得到編碼大鼠ρ185-蛋白質(zhì)的第6和第7個(gè)截短形式的嵌合質(zhì)粒，構(gòu)建2個(gè)新質(zhì)粒，其中由于EcoRI限制性位點(diǎn)存在于人ErbB2基因序列中的第1450位，使用除EcoRI 外的克隆位點(diǎn)。通過(guò)使用由有義寡核苷酸(寡核苷酸#16)和反義寡核苷酸(寡核苷酸 #17)構(gòu)成的合成序列修飾PCMV3. 1，從而刪除了 PmeI酶的兩個(gè)限制性位點(diǎn)中的一個(gè)并且倒 轉(zhuǎn)了位于其多克隆位點(diǎn)中的HindIII和NheI限制酶的限制性位點(diǎn)。將這樣得到的新質(zhì)粒 主鏈稱作 pCMV3. ΙΗ/Νο 通過(guò)使用 pCMV-EC-TM 質(zhì)粒(Amici 等人，2000，Gene Ther.，7 703 ； Rovero等人，2000，J. Immunol.，165 5133)作為模板，以及在其末端具有NheI限制性位點(diǎn) 的2個(gè)不同的有義寡核苷酸(寡核苷酸#18和#19)，以及反義寡核苷酸#10來(lái)擴(kuò)增產(chǎn)生大 鼠pl85-蛋白質(zhì)的第6和第7個(gè)截短形式的片段。在用限制酶NheI和PmeI酶促消化后，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCMV3. 1H/N質(zhì)粒中，因 此得到新的 pCMV3. lH/N-rEC6-TM 和 pCMV3. lH/N-rEC7_TM 質(zhì)粒。使用 pcDNA3. lerbB2 質(zhì)粒 作為模板，T7引物作為有義寡核苷酸(寡核苷酸#1)，以及兩種引物(設(shè)計(jì)其使得它們?cè)谶m 當(dāng)?shù)奈恢米R(shí)別cDNA并且在其末端具有NheI限制性位點(diǎn))(寡核苷酸#20和#21)作為反義 寡核苷酸，通過(guò)擴(kuò)增得到待插入以產(chǎn)生嵌合的PCMV3. 1H/N-HURT6和pCMV3. 1H/N_HuRT7質(zhì) 粒的編碼人Pl85neu蛋白質(zhì)部分的cDNA片段。在純化以及用HindIII和NheI限制酶消化后，將擴(kuò)增片段插入到預(yù)先用同樣限制 酶消化的相應(yīng)質(zhì)粒(pCMV3. lH/N-rEC6-TM ；pCMV3. lH/N-rEC7_TM)中。以這種方式得到了 2 個(gè)新的嵌合PCMV3. 1H/N-HURT6和pCMV3. 1H/N_HuRT7質(zhì)粒，其編碼長(zhǎng)度為689個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)，它們的2個(gè)氨基酸(Val-Ser)屬于用來(lái)連接人和大鼠DNA的NheI限制性位點(diǎn)。這些操作得到下列質(zhì)粒· pCMV3. I-HuRTl質(zhì)粒(圖8)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的70個(gè)氨基 酸、屬于EcoRI位點(diǎn)的2個(gè)氨基酸和大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的618個(gè)氨基酸· pCMV3. 1-HURT2質(zhì)粒(圖9)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的150個(gè)氨基 酸和大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)的538個(gè)氨基酸· pCMV3. 1-HURT3質(zhì)粒(

圖10)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的230個(gè)氨基 酸和大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)的458個(gè)氨基酸· pCMV3. 1-HURT4質(zhì)粒(圖11)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的310個(gè)氨基 酸和大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)的378個(gè)氨基酸· pCMV3. 1-HURT5質(zhì)粒(圖12)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的390個(gè)氨基 酸和大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)的298個(gè)氨基酸· pCMV3. 1H/N-HURT6質(zhì)粒(圖13)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的470個(gè) 氨基酸和大鼠P185-蛋白質(zhì)的218個(gè)氨基酸· pCMV3. 1H/N-HURT7質(zhì)粒(圖14)，其編碼人pl85neu蛋白質(zhì)EC結(jié)構(gòu)域的550個(gè) 氨基酸和大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)的138個(gè)氨基酸。通過(guò)用7 個(gè)新質(zhì)粒(pCMV3. I-HuRT 1-5 和 pCMV3. 1H/N-HuRT6_7)免疫小鼠，得到了 這些質(zhì)粒編碼的嵌合人-大鼠蛋白質(zhì)的膜表達(dá)的間接證據(jù)。來(lái)自所有接種小鼠的血清具有 抗嵌合人和大鼠P185-蛋白質(zhì)的特異性抗體。另外，用編碼7種不同的嵌合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒 接種的動(dòng)物被保護(hù)免于TUBO細(xì)胞和/或人pl85neu蛋白質(zhì)-過(guò)量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(D2F2-E2 細(xì)胞)的致死接種。實(shí)施例實(shí)施例1 :pCMV3. l_HuRT5質(zhì)粒的構(gòu)建將編碼大鼠pl85neu蛋白質(zhì)的第5個(gè)截短形式的pCMV3. l_rEC5_TM質(zhì)粒用HindIII 和EcoRI限制酶(BioLabs, Beverly, ΜΑ)消化，以刪除5，UTR區(qū)和neuL序列。將對(duì)應(yīng)于缺乏5，UTR區(qū)和neuL序列的pCMV3. l_rEC5_TM質(zhì)粒的4794bp的 DNA條帶用瓊脂糖凝膠電泳分離并且用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，意大利)洗 脫。通過(guò)PCR得到5，UTR區(qū)、前導(dǎo)序列和編碼人ErbB2基因缺失部分的序列的cDNA。 將pcDNA3. lErbB2質(zhì)粒用作模板，T7引物(寡核苷酸#1)用作有義寡核苷酸，以及在 其5’末端具有EcoRI限制性位點(diǎn)的引物(寡核苷酸#15)用作反義寡核苷酸。使用 Finnzymes (CELBIO，Milan，意大利)的試劑和校正Taq聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)后， 通過(guò)常規(guī)方法純化和沉淀擴(kuò)增的DNA，其重懸在50 μ IH2O中，并且用HindIII和EcoRI限制 酶消化。通過(guò)使用T4DNA連接酶(BioLabs，Beverly, ΜΑ)的連接反應(yīng)克隆人ErbB2相關(guān)部 分的編碼cDNA片段和線性的pCMV3. l_rEC5_TM質(zhì)粒。之后使用連接產(chǎn)物來(lái)轉(zhuǎn)化已經(jīng)用氯化鈣技術(shù)使其處于感受態(tài)的大腸桿菌 (E. coll)細(xì)茵的DH5a菌株。通過(guò)堿裂解分析這樣得到的克隆以檢測(cè)包含嵌合pCMV3. 1-HURT5質(zhì)粒的克隆。隨后通過(guò)Sanger測(cè)序方法，使用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer自動(dòng)測(cè)序儀 (Applied Biosystem)分析pCMV3. l_HuRT5，以評(píng)估編碼ErbB2基因的人序列部分插入到編 碼大鼠Pl85neu蛋白質(zhì)的第5個(gè)截短形式的質(zhì)粒中已經(jīng)正確發(fā)生并且沒有改變閱讀框。寡核苷酸列表#1T7 引物(SEQ ID No 13)#2ueu 前導(dǎo)區(qū)反義 EcoRI (SEQ ID No
14)#3rECDl 有義 EcoRI (SEQIDNo15)
#4rECD2 有義 EcoRI (SEQIDNo16)
#5rECD3 有義 EcoRI (SEQIDNo17)
#6rECD4 有義 EcoRI (SEQIDNo18)
#7rECD5 有義 EcoRI (SEQIDNo19)
#8rECD6 有義 EcoRI (SEQIDNo20)
#9rECD7 有義 EcoRI (SEQIDNo21)#10pcDNA3. 1/BGH 反向引發(fā)位點(diǎn)(SEQ ID No 22)#IlHis-Myc 有義 EcoRI 突變(SEQ ID No 23)#12Hi s-Myc 反義 EcoRI (SEQ ID No 24)#1370erbB2 反義 EcoRI (SEQ ID No 25)#14150erbB2 反義 EcoRI (SEQ ID No 26)#15230erbB2 反義 EcoRI (SEQ ID No 27)#16310erbB2 反義 EcoRI (SEQ ID No 28)#17390erbB2 反義 EcoRI (SEQ ID No 29)#18HindIII-NheI 有義(SEQ ID No 30)#19HindIII-NheI 反義(SEQ ID No 31)
#20rECD6 有義 HheI (SEQ ID No 32)#21rECD7有義HheI(SEQ ID No 33)#22470erbB2 反義 HheI (SEQ ID No 34)#23550erbB2 反義 HheI (SEQ ID No 35)實(shí)施例2:體內(nèi)測(cè)試動(dòng)物使用大約7周齡的BALB/c品系雌性小鼠用于所有實(shí)驗(yàn)。小鼠來(lái)自Charles River Laboratories (CalC0，Milan，意大利)，在那里將它們無(wú)菌飼養(yǎng)并且根據(jù)歐洲共同體 (European Community)設(shè)立的法律來(lái)培養(yǎng)。肌內(nèi)施用，隨后是體內(nèi)電穿孔為了避免疼痛和脛肌的不必要收縮，通過(guò)腹膜內(nèi)注射300 μ 1的Avertin麻醉每只 小鼠，所述的Avertin是由0. 58克2，2，2-三溴乙醇(Sigma-Aldrich)和310 μ 1叔戊醇 (Aldrich)在39. 5ml去離子H2O中組成的溶液。削開麻醉小鼠的脛肌，并且在每塊肌肉中接 種20 μ 1包含25 μ g DNA的溶液。臨用前根據(jù)F. Pericle博士的說(shuō)明(Valentis，Inc.，The Woodlands, Texas，美國(guó))制備該包含DNA的溶液。此溶液包含濃度為1. 25mg/ml的質(zhì)粒 DNA，濃度為6mg/ml的聚_L_谷氨酸鈉鹽(Sigma-Aldrich, S. r. 1.肩丨1&11，意大利)，濃度為 150mM的氯化鈉(Fluka，BioChemika，Buchs，瑞士)，并且添加無(wú)內(nèi)毒素的蒸餾水(Nucleare Free Water,Promega Corporation)至終體積為lml。接種后大約5分鐘，使用在腿側(cè)面四 邊形排列的分開3mm的兩個(gè)鋼電極，將由Electro Square Porator電穿孔儀(T820，BTX， San Diego, CA，美國(guó))產(chǎn)生的兩次電脈沖(強(qiáng)度為375V/cm2，每次持續(xù)25毫秒)應(yīng)用到小 鼠的兩塊脛肌。在接種腫瘤細(xì)胞前21天和7天，在每只動(dòng)物中進(jìn)行兩次通過(guò)電穿孔的基因 免疫。腫瘤細(xì)胞的接種用0. 2ml包含2 X IO5TUBO細(xì)胞的懸液接種到小鼠左側(cè)。體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)評(píng)估通過(guò)每周觸診評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)，并且用標(biāo)準(zhǔn)尺沿著兩垂直直徑測(cè)量腫瘤大小。將尺 寸大于1毫米的腫瘤塊認(rèn)為是腫瘤。將腫瘤生長(zhǎng)監(jiān)控100天(從腫瘤接種開始)，或者直到 腫瘤尺寸在直徑上超過(guò)10毫米(此時(shí)處死動(dòng)物)。得到的結(jié)果證明了嵌合pCMV3. 1-HURT5 質(zhì)粒能夠100%保護(hù)接種的BALB/c小鼠免于TUBO細(xì)胞的致死接種(表2)。表 2
質(zhì)粒 N。小鼠保護(hù)存活(天)pCMV3.1-neuL 50%+ 35pCMV3.1neuL-rEC-TM 5100%+ 100pCMV3.1-HuRT5 5100%+ 100存在于接種動(dòng)物血清中的抗-pl85-抗體的評(píng)估在接種腫瘤細(xì)胞前一天，從用嵌合的pCMV3. 1-HURT5質(zhì)粒接種的動(dòng)物中采血。分 析血清以評(píng)定大鼠抗-P185-抗體的存在。將血清與過(guò)量表達(dá)大鼠ρ185-的細(xì)胞在4°C下孵育45分鐘。在用被稱作洗滌緩沖液的溶液洗滌后，將樣品與抗-小鼠免疫球蛋白 FITC-綴合的抗體在4°C下孵育20分鐘，用洗滌緩沖液洗滌，并且用FACScan細(xì)胞熒光 測(cè)定儀(BectonDickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California,美 國(guó))分析，所述洗滌緩沖液由包含0.2%的牛血清白蛋白(BSA，Sigma, Milan，意大利)和 0. 疊氮化鈉(NaN3, Sigma, Milan，意大利)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)組成。同時(shí)，將相 同的細(xì)胞與濃度遞減的單克隆抗-c-ErbB2/c-neU抗體(Ab4，癌基因)孵育，從而可以得 到通過(guò)cytofluorimeter分析得到的熒光強(qiáng)度和動(dòng)物血清中抗_pl85neu抗體濃度之間的 關(guān)系。得到的數(shù)據(jù)顯示所有接種的動(dòng)物表現(xiàn)出高水平的抗-大鼠P185-抗體，因此嵌合 PCMV3. 1-HURT5質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)對(duì)移植的pl85neu-陽(yáng)性腫瘤的排斥以及引發(fā)特異性抗體應(yīng) 答。
權(quán)利要求
用于DNA轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒包含編碼嵌合p185neu蛋白質(zhì)的選自SEQ ID NO.6、7、8、9、10、11、12的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的質(zhì)粒載體，其進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的質(zhì)粒載體，其中所述啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的質(zhì)粒載體，其適用于哺乳動(dòng)物，特別是人。
5.包含根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的質(zhì)粒載體以及可藥用載體和賦形劑的藥物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其適合于腸胃外施用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其為可注射溶液的形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其為DNA疫苗的形式。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的質(zhì)粒載體用于制備治療劑的用途，所述治療劑用于預(yù) 防或治療有發(fā)展Pl85neu-陽(yáng)性腫瘤危險(xiǎn)的個(gè)體，或患有原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤或pl85neu-陽(yáng)性腫 瘤復(fù)發(fā)的患者。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其用于制備DNA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明描述了包含185neu癌蛋白質(zhì)不同片段的編碼序列的DNA質(zhì)粒及其藥物組合物，所述DNA質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)抗過(guò)量表達(dá)p185neu的腫瘤的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101886090SQ20101019238
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者克里斯蒂納·馬爾其尼, 圭多·福爾尼, 埃琳娜·夸利諾, 奧古斯托·阿米其, 費(fèi)代里卡·卡瓦洛 申請(qǐng)人:奧古斯托·阿米其;克里斯蒂納·馬爾其尼;埃琳娜·夸利諾;費(fèi)代里卡·卡瓦洛;圭多·福爾尼