專利名稱：一種放射性錸標(biāo)記人纖溶酶原kringle5蛋白及其制備方法
一種放射性錸標(biāo)記人纖溶酶原kr ingle 5蛋白及其制備方
法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種放射性標(biāo)記蛋白及其制備方法以及該放射性標(biāo)記蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前國(guó)際上以腫瘤血管為靶點(diǎn)的藥物已有多種，許多已進(jìn)入臨床試驗(yàn)或者被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用。如Endostatin(內(nèi)皮抑素)已于2005年被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床；Angiostatin(血管抑素)也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)I期。Cao 等已發(fā)現(xiàn)重組人纖溶酶原 Kringle 5 (Recombinant HumanPlasminogen Kringle5, rhk5)作為腫瘤血管生成抑制劑，活性等各方面優(yōu)于上述藥物，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。核素標(biāo)記血管生成抑制劑可通過(guò)β射線達(dá)到增強(qiáng)腫瘤靶向治療的效果，降低腫瘤血管生成抑制劑的用量，降低成本。目前國(guó)外已有類似研究，如Yang等使用99mTc標(biāo)記 Endostatin的實(shí)驗(yàn)研究顯示腫瘤可以清晰顯像；Lee等使用123I標(biāo)記的Agiostatin取得了同樣的效果。目前尚未見(jiàn)采用具有優(yōu)良理化性質(zhì)的放射性核素188Re標(biāo)記具有更強(qiáng)腫瘤血管抑制作用的rhk5的研究、特別是治療的研究報(bào)道。Endostatin及Angiostatin等若要達(dá)到治療效果需持續(xù)給藥，且費(fèi)用昂貴。99mTc標(biāo)記Endostatin的實(shí)驗(yàn)研究顯示腫瘤可以清晰顯像，但不能用于治療；Lee等使用123I標(biāo)記的Agiostatin取得了同樣的效果，但標(biāo)記不穩(wěn)定。 核素直接標(biāo)記蛋白常會(huì)造成蛋白活性的損傷。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高效的抗腫瘤藥物188Re-rhk5，即核素188Re標(biāo)記的重組入纖溶酶原Kringle 5蛋白。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供188Re-rhk5的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供188Re-rhk5在抑制腫瘤生長(zhǎng)中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案一種核素標(biāo)記rhk5蛋白，其特征在于，所述核素為188Re。188Re-rhk5的制備方法，包括步驟(1)和步驟(2)步驟(l)rhk5蛋白的表達(dá)，形成羧基端連接6XHis -Tag的融合蛋白，可以優(yōu)選通過(guò)下述兩種方式獲得將Kringle 5基因片段構(gòu)建入原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET_22b (+)—氨基端加入信號(hào)肽序列一羧基端加入6 XHis序列一當(dāng)pET-22b (+) _k5在BL21-CodonPlus感受態(tài)菌被誘導(dǎo)后，在rhk5氨基端表達(dá)信號(hào)肽段，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，同時(shí)切除信號(hào)肽，形成羧基端連接6 X Hi s · Tag的融合蛋白。
或者，將Kringle 5基因片段構(gòu)建入真核表達(dá)載體質(zhì)粒pFastbacl —羧基端加入 6XHis序列一當(dāng)pFaStbacl-rhk5在27°C培養(yǎng)的昆蟲(chóng)sf9細(xì)胞內(nèi)孵育后，以可溶性方式表達(dá)rhk5蛋白，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成羧基端連接6XHis · Tag的融合蛋白。步驟(2)三羰基錸標(biāo)記rhk5的核心步驟1)取5mg BH3 · NH3放入干燥西林瓶中，加蓋密封，通CO氣體約20min。2)在lmL188Re04_的生理鹽水淋洗液中，力口入7 μ L濃Η3Ρ04。3)混勻后注射到已通好CO的西林瓶中，70°C水浴加熱15min。4)測(cè)定反應(yīng)后生成的中間體fac-[188Re[(CO)3(H2O)3]+的螯合率。5)三羰基錸標(biāo)記rhk5，優(yōu)化后的標(biāo)記條件為rhk520 μ g，加入0. lmL188Re04"淋洗液，調(diào)節(jié)溶液的PH值為5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中溫育lh。步驟⑵中測(cè)定反應(yīng)后生成的中間體faC-[188Re[(C0)3(H20)3] +的螯合率，以GF254 硅膠薄板為固定相，V(甲醇)V(濃鹽酸)=99 1為流動(dòng)相，在放射性薄層掃描儀上進(jìn)行測(cè)定。步驟(2)中使用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH值為5. 0。荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布研究表明腫瘤組織的188Re-rhk5攝取隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，在2h時(shí)最高；rhk5能在新生血管密集部位積聚，用放射性核素標(biāo)記rhk5進(jìn)行腫瘤顯像是可行的；初步治療實(shí)驗(yàn)顯示單次瘤內(nèi)注射37MBq188Re-rhk5，對(duì)腫瘤及腫瘤血管有放射治療作用，18天后抑瘤率達(dá)37.2%。本發(fā)明的積極效果(1)三羰基錸標(biāo)記法采用組氨酸作為雙功能螯合劑，間接標(biāo)記rhk5，不與二硫鍵作用，保留了 rhk5蛋白活性；(2)核素188Re標(biāo)記rhk5，通過(guò)核素的β 射線及交叉火力作用，不但增強(qiáng)抗腫瘤血管生成作用、減少了藥物用量，而且彌補(bǔ)了靶向性之不足；(3)188Re_rhk5在使用β射線治療的同時(shí)可以用其發(fā)射的Y射線來(lái)進(jìn)行顯像，監(jiān)測(cè)治療效果。

圖1中間體fac- [188Re (CO) 3 (H2O) 3] +的合成并用放射薄板層析法(RTLC)鑒定；圖2純化前標(biāo)記產(chǎn)物在9g/L生理鹽水展開(kāi)體系中RTLC分析結(jié)果；圖3純化后標(biāo)記產(chǎn)物在9g/L生理鹽水展開(kāi)體系中RTLC分析結(jié)果；圖4純化后標(biāo)記產(chǎn)物在乙醇氨水(2 1 5V/V/V)展開(kāi)體系中RTLC分析結(jié)果；圖5188Re_rhk5在肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)的組織分布(η = 3)；圖6188Re-rhk5在肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)阻斷前后的組織學(xué)分布(2h) (η = 3)；圖7 :188Re_rhk5在肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)的顯像圖A，B分別為各時(shí)間點(diǎn)的顯像圖； A，0. 5h ；B，2h ；箭頭所指部位為腫瘤；圖8188Re-rhk5 治療后腫瘤生長(zhǎng)抑制曲線188Re_rhk5 (37MBq)、188Re (37MBq)、 rhk5(15mg/kg)和0.9%生理鹽水治療后18天內(nèi)腫瘤大小的改變，每組6只，*代表P < 0. 05，**代表P < 0. 01 (188Re-rhk5治療組與其余各組比較)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。制備實(shí)施例1(l)rhk5蛋白的表達(dá)將Kringle 5基因片段構(gòu)建入原核表達(dá)載體質(zhì)粒 pET-22b(+)—氨基端加入信號(hào)肽序列一羧基端加入6XHi s序列一當(dāng)pET-22b(+)-k5在 BL21-CodonPlus感受態(tài)菌被誘導(dǎo)后，可以在rhk5氨基端表達(dá)信號(hào)肽段，通過(guò)信號(hào)肽可以將蛋白產(chǎn)物分泌到大腸桿菌內(nèi)、外膜間的外周質(zhì)，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成具有功能的可溶性融合蛋白，同時(shí)切除信號(hào)肽，使其接近天然蛋白。羧基端連接6XHis -Tag的融合蛋白，利用His -Tag不但可用來(lái)進(jìn)行鎳柱純化，而且為蛋白質(zhì)的western blot鑒定及后續(xù)的核素三羰基錸間接法標(biāo)記rhk5奠定了基礎(chǔ)。(2)三羰基錸標(biāo)記rhk5 取5mg BH3 -NH3放入干燥西林瓶中，加蓋密封，通CO氣體約20min —在lmL188Re04_的生理鹽水淋洗液中，加入7 μ L濃H3PO4 —混勻后注射到已通好CO 的西林瓶中，70°C水浴加熱15min—采用放射薄板層析法(RTLC)測(cè)定反應(yīng)后生成的中間體 faC-[188Re[(C0)3(H20)3]+的螯合率，以GF254硅膠薄板為固定相，V(甲醇)V(濃鹽酸)= 99 1為流動(dòng)相，在放射性薄層掃描儀上進(jìn)行測(cè)定。如圖1所示，放射薄板層析法鑒定顯示， 中間體fac-[188Re (CO) 3 (H2O) 3]+合成后純度很高(前面的峰)，幾乎無(wú)雜質(zhì)，可直接用來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。一采用正交實(shí)驗(yàn)得出優(yōu)化后的標(biāo)記條件rhk520y g，加入0. lmL188Re04_淋洗液(37_370MBq)，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH值為5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中溫育 lh。標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)RTLC分析結(jié)果如圖1所示，標(biāo)記率可達(dá)65%以上，放射化學(xué)純度可達(dá)95% 以上，如圖3、圖4所示。制備實(shí)施例2(l)rhk5蛋白的表達(dá)將Kringle 5基因片段構(gòu)建入真核表達(dá)載體質(zhì)粒 pFastbacl —羧基端加入6XHis序列一當(dāng)pFastbacl_rhk5在27°C培養(yǎng)的昆蟲(chóng)sf9細(xì)胞內(nèi)孵育后，可以以可溶性方式表達(dá)rhk5蛋白，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成具有功能的可溶性融合蛋白，羧基端連接6XHis · Tag的融合蛋白，利用His · Tag不但可用來(lái)進(jìn)行鎳柱純化，而且為蛋白質(zhì)的western blot鑒定及后續(xù)的核素三羰基錸間接法標(biāo)記rhk5奠定了基礎(chǔ)。真核表達(dá)的rhk5蛋白活性較高，但是產(chǎn)量較低。大規(guī)模制備時(shí)還是選用原核表達(dá)的方法更適合。(2)三羰基錸標(biāo)記rhk5的方法同實(shí)施例1。應(yīng)用實(shí)施例1荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布研究表明腫瘤組織的188Re-rhk5攝取隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，在2h時(shí)最高；rhk5能在新生血管密集部位積聚，用放射性核素標(biāo)記rhk5進(jìn)行腫瘤顯像是可行的；初步治療實(shí)驗(yàn)顯示單次瘤內(nèi)注射37MBq188Re-rhk5，對(duì)腫瘤及腫瘤血管有放射治療作用，18天后抑瘤率達(dá)37.2%。188Re_rhk5經(jīng)單劑量靜脈注射后，如圖2所示，188Re-rhk5在血中清除較快。腎臟與其他器官組織相比，在不同時(shí)間段有明顯的高放射性攝取，是由于標(biāo)記物主要通過(guò)泌尿系統(tǒng)排泄所致。其余臟器放射性攝取相對(duì)較低，隨時(shí)間延長(zhǎng)而攝取逐漸減低。腫瘤組織有相對(duì)高的攝取，且與其它臟器相反，在0-2h內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而攝取逐漸增高，在腫瘤內(nèi)滯留時(shí)間較長(zhǎng)。隨后的特異性阻斷實(shí)驗(yàn)中于188Re_rhk5顯像前30min靜脈注射IOOyg rhk5，在注射后2h處死裸鼠，各臟器的分布測(cè)定結(jié)果如圖3所示腫瘤部位的188Re-rhk5攝取下降。證實(shí)了 188Re_rhk5與腫瘤結(jié)合的特異性。其余臟器分布在阻斷前后未見(jiàn)明顯變化。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種核素標(biāo)記rhk5蛋白，其特征在于，所述核素為188Re。
2.如權(quán)利要求1所述的188Re_rhk5的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)rhk5蛋白的表達(dá)，形成羧基端連接6XHis· Tag的融合蛋白；(2)三羰基錸標(biāo)記rhk51)取5mgBH3 · NH3放入干燥西林瓶中，加蓋密封，通CO氣體約20min ；2)在ImL188ReO4-的生理鹽水淋洗液中，力Π入7μ L濃H3PO4 ；3)混勻后注射到已通好CO的西林瓶中，70°C水浴加熱15min；4)測(cè)定反應(yīng)后生成的中間體fac_[188Re [ (CO) 3 (H2O) 3] +的螯合率；5)三羰基錸標(biāo)記rhk5，優(yōu)化后的標(biāo)記條件為rhk520yg，加入0. lmL188Re04_淋洗液，調(diào)節(jié)溶液的PH值為5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中溫育lh。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(l)rhk5蛋白的表達(dá)包括如下步驟將Kringle 5基因片段構(gòu)建入原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET_22b (+)—氨基端加入信號(hào)肽序列一羧基端加入6XHis序列一當(dāng)pET-22b (+)_k5在BL21-CodonPlus感受態(tài)菌被誘導(dǎo)后， 在rhk5氨基端表達(dá)信號(hào)肽段，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，同時(shí)切除信號(hào)肽，形成羧基端連接6XHis · Tag的融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(l)rhk5蛋白的表達(dá)包括如下步驟將Kringle 5基因片段構(gòu)建入真核表達(dá)載體質(zhì)粒pFastbacl —羧基端加入6XHis序列一當(dāng)pFaStbacl-rhk5在27°C培養(yǎng)的昆蟲(chóng)sf9細(xì)胞內(nèi)孵育后，以可溶性方式表達(dá)rhk5蛋白，并在氧化環(huán)境下形成二硫鍵，形成羧基端連接6 X His · Tag的融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(2)中測(cè)定反應(yīng)后生成的中間體fac-[188Re[(C0)3(H20)3]+的螯合率，以GF254硅膠薄板為固定相，V甲醇V濃 asg= 99 1為流動(dòng)相，在放射性薄層掃描儀上進(jìn)行測(cè)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的188Re-rhk5的制備方法，其特征在于，步驟(2)中使用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液的PH值為5.0。
7.如權(quán)利要求1所述的188Re_rhk5在抑制腫瘤生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種188Re-rhk5蛋白及其制備方法，三羰基錸標(biāo)記法采用組氨酸作為雙功能螯合劑，間接標(biāo)記rhk5，不與二硫鍵作用，保留了rhk5蛋白活性。核素188Re標(biāo)記rhk5，通過(guò)核素的β射線及交叉火力作用，不但增強(qiáng)抗腫瘤血管生成作用、減少了藥物用量，而且彌補(bǔ)了靶向性的不足。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102268423SQ20101019305
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者張嵐, 曹本紅, 李彪 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院, 上海原子科興藥業(yè)有限公司, 中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所