專利名稱：一種植入式生物人工肝臟的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學、生物醫(yī)學與再生醫(yī)學領域，涉及組織工程與人工器官技術， 具體涉及一種植入式生物人工肝臟。
背景技術：
肝臟作為人體最重要的器官之一，承擔著合成、分泌、代謝、解毒等多種復雜的功 能，由于各種原因一旦造成大量肝細胞的壞死，將出現(xiàn)肝衰竭，導致機體代謝紊亂和毒性物 質的堆積，影響身體健康。原位肝移植是迄今公認的治療各種原因所致的終末期肝功能衰竭唯一有效的方 法，但由于嚴重的供肝短缺，大量患者在等待肝移植的過程中死去。肝細胞移植因廉價、移 植細胞易獲取及凍存方便、操作簡便等優(yōu)點，正日益被人們所關注。最近的研究表明，利用 組織工程和干細胞技術，可極大的提高移植細胞的再生和功能發(fā)揮，拓展肝細胞治療的再 生醫(yī)學空間。目前國內外多采用高分子合成的三維多孔可降解生物支架或天然基質材料結合 不同來源的細胞(包括動物或人胚胎干細胞、骨髓或臍血等來源的成體干細胞、胎兒或成 人的原代肝細胞等)直接進行體內移植實驗，以期重建人工肝臟(或肝組織)來替代受損 的宿主肝臟功能。如在丁義濤等，生物性人工肝治療肝衰竭的研究進展，內科急危重癥雜 志，2009年第15卷第3期，一文中公開，目前的生物人工肝臟支架幾乎均為人工合成材料， 但人工合成材料支架有其難以克服的兩個缺點一方面，由于其為人工合成材料，生物相容 性比較低；另一方面，人工合成的肝臟支架沒有血管結構，因此人工肝臟植入受體以后，其 血供為另一個難題。因此，用去細胞化的天然肝臟支架代替人工合成材料支架構成人工肝臟，成為了 一個新的研究方向。許多研究表明去細胞化的天然肝臟支架與人工合成支架相比具有更好 的生物相容性，使得細胞的貼附生長變得更加的容易。除此以外，去細胞化的天然肝臟支架 上也保留了其原有的血管結構?，F(xiàn)有報道獲取去細胞化天然人工肝臟支架方法的文獻較多。如申請?zhí)枮?US2005/0249816,申請日2005年10月10日的美國發(fā)明專利中公開了一種天然肝臟的去 細胞化的方法在胞膜剝離液中機械攪拌對未經(jīng)處理過的離體肝臟使去掉肝臟進行去細胞 化，而保留其基質結構；用有效濃度的細胞裂解液灌注肝臟使細胞分裂脫落，而保留其基質 結構；用灌注液沖洗肝臟中脫離的細胞直到完全去細胞化；其中細胞裂解液可以是含有去 垢劑的堿性溶液，如含0. 5% Triton X-100的氨溶液，所述的灌洗液可以是蒸餾水、生理鹽 水或者培養(yǎng)基?？涤裾嫉仍诠_號為CN101564554A，申請日2009年10月28日的中國發(fā) 明專利以及稍后發(fā)表的文獻去細胞化技術在全肝支架建立中的應用，中華醫(yī)學雜志，2009， 86(16) :1135 1138中，均公開了一種肝臟的去細胞方法，該方法通過門靜脈插管，以灌注 液I即含有離子型去垢劑的Tris-Hcl溶液(十二烷基磺酸鈉(SDS))灌注離體肝臟，使得 肝臟由土黃色變成乳白色；以蒸餾水灌注，以充分洗脫灌注液I ；以灌注液II即含有非離子
3去垢劑的Tris-Hcl溶液(曲拉通X-100(Triton-100))灌注，使得肝臟變?yōu)橥该?；以蒸餾水 灌注，以充分的洗脫灌注液II中的離子型去污劑。上述方法中均采用濃度恒定的一種或多種去垢劑組合對離體肝臟去細胞化，因去 垢劑會破壞部分細胞外基質成分，上述去細胞化灌注液使得去細胞化肝臟支架的細胞外基 質受到不同程度的損壞，影響了天然肝臟支架的結構，不利于肝細胞貼附生長。如前所述，去細胞化的天然肝臟支架保留了其原有的血管結構，為人工肝臟的植 入提供了條件。然而經(jīng)過處理后的天然肝臟支架由于膠原暴露，植入體內后，會發(fā)生嚴重的 凝血現(xiàn)象，最終導致移植失敗。由于上述缺陷，目前尚未有由去細胞化的天然人工肝臟支架制備的可以植入體內 的生物人工肝臟的報道。目前人工肝臟所采取的移植位點多是皮下、脾、胰腺、腎包膜和腹腔內，但都受限 于植入肝細胞量太少和血供無法保證，致使植入細胞無法最終替代器官功能，導致移植的 失敗。如能找到一種既能保證同時植入大量肝細胞(重量達到原有肝臟重量10%及以上)， 又能保證植入肝細胞的血液供應，支持肝細胞存活并發(fā)揮功能，對于各種原因所致的急慢 性肝功能衰竭治療具有極其重要的意義。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供一種新的制備人工肝臟支架的聯(lián)合用試劑，包 括灌注液1 弱堿性低滲溶液或純水；灌注液2 —組濃度呈梯度變化的離子型去垢劑水 溶液；灌注液3 電解質水溶液；灌注液4 抗凝血因子水溶液；洗脫液1 蒸餾水；洗脫液2 非離子型去垢劑水溶液。所述聯(lián)合用試劑還可以包括滅菌用的灌注液5。優(yōu)選的，所述弱堿性低滲溶液為質量分數(shù)為0. 的氨水溶液；所述一組濃度呈 梯度變化的離子型去垢劑水溶液分別為質量分數(shù)為1%、0. 5%和0. 25%的SDS溶液；非離 子型去垢劑水溶液為1 %的Triton X-100溶液；電解質水溶液為lg/L的PDADMAC溶液；抗 凝血因子的水溶液為2g/L的肝素溶液；所述滅菌用灌注液5為含抗生素的蒸餾水；所述灌 注液5所含抗生素為青霉素(100U/ml)、鏈霉素(1001!8/1111)、兩性霉素8(2118/1111)、氟康唑 (0. 2mg/ml)和 / 或甲硝唑(50 u g/ml)；本發(fā)明還提供一種制備可植入體內的生物人工肝臟的方法，包括如下步驟a、對離體肝臟去細胞化用灌注液1灌注至肝臟中心區(qū)成乳白色，用洗脫液1蒸餾 水洗脫，然后用灌注液2灌注；用洗脫液2洗脫后得到人工肝臟支架；b、對步驟a得到的人工肝臟支架進行抗凝修飾用灌注液3灌注人工肝臟支架，用 洗脫液1洗脫后再用灌注液4灌注，再用洗脫1洗脫，該過程至少重復7次，得到可植入體 內的生物人工肝臟支架；c、將肝細胞貼附到步驟b得到的生物人工肝臟支架上，即得到可植入體內的生物 人工肝臟。所述步驟a和b中還包括用灌注液5灌注滅菌。優(yōu)選的，步驟a中，灌注液1灌注時間為12 24小時；灌注液2中各濃度的灌注 液分別灌注1 2小時；滅菌時用灌注液5灌注6 12小時，洗脫液1洗脫時間30 60 分鐘；洗脫液2洗脫30 120分鐘；步驟b中用灌注液3灌注10分鐘，然后靜置20分鐘，用洗脫液1灌注10分鐘；接著用灌注液4灌注10分鐘，然后靜置20分鐘；用洗脫液1灌注10分鐘，該過程重復至少7 次；步驟c中貼附時，將濃度為3. 3X 107個/ml細胞培養(yǎng)基的肝細胞注入步驟b得到 的生物人工肝臟支架，靜置4 6小時，用細胞培養(yǎng)基灌注培養(yǎng)2小時，再用生理鹽水灌注 30分鐘；步驟a和步驟b滅菌時用灌注液5灌注2小時。更優(yōu)選的，步驟a中灌注液1、2、5和洗脫液1的灌注速度均為lml/min ；步驟b中 灌注液3、4以及洗脫液1的灌注速度均為5ml/min，灌注液5的灌注速度為2ml/min ；步驟 c中細胞培養(yǎng)液和生理鹽水的灌注速度為2ml/min。本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述方法制備的可植入體內的生物人工肝臟。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明采用的去細胞化全部或部分肝臟并帶有血管結構的天然支 架，可以最大限度的模擬肝細胞所在的肝臟內細胞外基質環(huán)境，利于肝細胞的貼附和肝細 胞特異性功能的保持，同時可以容納大量的肝細胞。經(jīng)過內部表面抗凝處理后，該生物人工 肝臟可以植入門靜脈系統(tǒng)，因為保留有原天然肝臟血管系統(tǒng)，所以可以為內部的肝細胞提 供豐富的血供，保證內部肝細胞的存活和功能發(fā)揮。利用該發(fā)明進行移植治療急性肝功能 衰竭(AHF)，生物人工肝在受者體內存活并有效替代受者受損肝臟功能，可顯著延長受者生 存時間，為組織工程肝臟移植治療各種原因所致的急性肝功能衰竭提供新的途徑。


圖1為本發(fā)明實施例3的植入式生物人工肝臟(大鼠用)。圖2A為本發(fā)明的實施例1中去細胞化天然肝臟支架，圖2B、圖2C和圖2D顯示了 去細胞化天然肝臟的病理切片(HE染色和Masson染色)，免疫熒光染色(collagen type I 和DAPI)以及掃描電鏡圖片。圖3為對比文件，康玉占等，去細胞化技術在全肝支架建立中的應用，中華醫(yī)學雜 志，2009,86(16) 1135 1138的去細胞化效果圖。3A為對比文件中去細胞化全肝大體圖 片，圖3B和圖3C為HE染色和掃描電鏡照片。圖4A為本發(fā)明的實施例1中去細胞化天然肝臟微血管的熒光染料灌注染色，圖4B 和圖4C為去細胞化天然肝臟中微血管的掃描電鏡圖片。圖5A為本發(fā)明的實施例2中內部層一層自組裝抗凝表面修飾示意圖。圖5B為經(jīng) 內部表面抗凝處理的去細胞化天然肝臟支架的甲苯胺藍染色。圖5C為經(jīng)過內部表面抗凝 處理在植入體內3小時后的HE染色。圖6為本發(fā)明實施例3中，植入受者(大鼠)門靜脈系統(tǒng)內的生物人工肝臟。圖7A和圖7B為本發(fā)明實施例3中植入門靜脈系統(tǒng)內72小時后的生物人工肝臟 病理切片(HE染色)。圖8A為本發(fā)明實施例3中生物人工肝臟植入門靜脈系統(tǒng)72小時后，逆轉錄PCR 顯示其中肝細胞特異性功能基因的表達情況。圖8B為生物人工肝臟植入門靜脈系統(tǒng)72小 時后，免疫組織化學顯示其中肝細胞白蛋白表達情況，透射電鏡和PAS染色顯示其中糖原 合成情況。圖8C為接受生物人工肝門靜脈植入治療的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型) 的血氨變化情況。圖8D為接受生物人工肝門靜脈植入治療的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型)的生存曲線。以下通過具體實施方式
對本發(fā)明做進一步說明，但并非對本發(fā)明的限制。
具體實施例方式實施例1大鼠肝臟去細胞化用蒸餾水和質量分數(shù)為28%的濃氨水配制質量分數(shù)為0. 的氨水溶液1000ml。 用蒸餾水配制濃度分別為1%，0. 5%和0. 25%的SDS(十二烷基硫酸鈉)各100ml。用蒸餾 水配制體積分數(shù)為的Triton X-100溶液50ml。手術從大鼠體內取出帶有門靜脈和肝上下腔靜脈的大鼠肝臟中葉。分別在門靜脈 和肝上下腔靜脈中插管。以lml/min的速度向肝中葉中灌注0. 的氨水溶液12小時，此 時肝臟中心變成乳白色，流出的灌注液成渾濁的棕黃色；然后用蒸餾水lml/min的速度灌 注30分鐘；接著用濃度分別為1%，0. 5%和0. 25%的SDS以lml/min的速度分別灌注1小 時；然后用的Triton X-100溶液以lml/min的速度灌注30分鐘，充分洗脫SDS殘留。 最后用含有常用抗菌劑量的抗生素如青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、氟康唑和/或甲硝唑等 的滅菌蒸餾水以lml/min的速度灌注6小時。對去細胞化支架進行無菌處理。結果如圖2和圖4:圖2A為去細胞化天然肝臟支架，圖2B、圖2C和圖2D顯示了去細胞化天然肝臟的 病理切片(HE染色和Masson染色)，免疫熒光染色(collagen type和DAPI)以及掃描電鏡 圖片，顯示出非常完全的去細胞化作用，同時保留了完整的細胞外基質，與現(xiàn)有技術(見圖 3)中去細胞化效果相比，具有明顯的優(yōu)勢。圖4A為去細胞化天然肝臟微血管的熒光染料灌注染色，圖4B和圖4C為去細胞化 天然肝臟中微血管的掃描電鏡，圖中顯示灌注后天然支架保留了血管和血管網(wǎng)絡。實施例2去細胞肝臟支架內部表面抗凝處理用無菌蒸餾水配制lg/L的PDADMAC溶液和2g/L的肝素溶液。從實施例1中得到 的去細胞化肝臟支架的門靜脈插管中以5ml/min的速度灌注lg/L的PDADMAC溶液10分 鐘，然后靜置20分鐘；用無菌蒸餾水以5ml/min的速度灌注10分鐘，去除PDADMAC溶液； 接著以5ml/min的速度灌注2g/L的肝素溶液10分鐘，然后靜置20分鐘；用無菌蒸餾水以 5ml/min的速度灌注10分鐘，去除肝素溶液；然后重復上述過程7次(總共進行8次)，完 成層一層自組裝內部表面抗凝修飾后，最后用含有常用抗菌劑量的抗生素如青霉素、鏈霉 素、兩性霉素B、氟康唑和/或甲硝唑的滅菌蒸餾水以2ml/min的速度灌注2小時。對內表 面抗凝修飾后去細胞化支架進行無菌處理。然后將內表面抗凝修飾后去細胞化支架上門靜 脈和大鼠肝臟門靜脈分支相連，內表面抗凝修飾后去細胞化支架上肝上下腔靜脈和大鼠下 腔靜脈連接，在血液灌流中測試3個小時。結果如圖5B和圖5C:圖5B為經(jīng)內部表面抗凝處理的去細胞化天然肝臟支架的甲苯胺藍染色，顯示其 內表面有肝素沉積。圖5C顯示經(jīng)過內部表面抗凝處理的去細胞化天然肝臟支架在植入體 內3小時后的HE染色，顯示人工肝臟在植入體內3小時后不會出現(xiàn)血栓。實施例3門靜脈植入式生物人工肝治療急性肝衰竭大鼠常規(guī)分離大鼠肝細胞，經(jīng)臺盼蘭染色檢測活性大于90%。將1X108個新鮮分離的大鼠肝細胞懸浮于3ml培養(yǎng)基中，并從門靜脈插管，注入實施例2中經(jīng)內部表面抗凝處 理的去細胞化天然肝臟支架中。然后靜置4個小時令肝細胞貼附。接著用細胞培養(yǎng)基如 RPMI1640或DMEM，以2ml/min的速度從門靜脈處灌注培養(yǎng)2小時。最后用生理鹽水以2ml/ min的速度灌注30分鐘，清除生物人工肝臟中的培養(yǎng)基，準備將該人工肝臟植入因90%肝 臟切除所致的急性肝衰竭大鼠模型門靜脈中。將大鼠門靜脈切斷，將生物人工肝臟上原有 門靜脈和大鼠門靜脈下段相連，生物人工肝臟上原有肝上下腔靜脈和大鼠門靜脈上端相 連。90%肝切除所致肝衰竭模型大鼠，分為治療組和非治療組各10只，每12小時觀察 兩組大鼠生命體征和肝功能，并繪制生存曲線。確定門靜脈植入式生物人工肝臟對肝衰竭 模型大鼠的治療作用。結果如下表1，圖1、圖6、圖7和圖8:表1植入式人工肝臟和移植受者(大鼠)原有肝臟中細胞數(shù)量(總DNA)的比較 表1為植入式生物人工肝臟和移植受者(大鼠)原有肝臟中細胞數(shù)量(總DNA) 的比較，其結果顯示生物人工肝臟中的肝細胞重量達到了受者原有肝臟重量的10%。圖1為植入式生物人工肝臟(大鼠用)在植入前，圖6為成功植入受者(大鼠) 門靜脈系統(tǒng)內的生物人工肝臟。圖7A和圖7B為植入門靜脈系統(tǒng)內72小時后的生物人工肝臟病理切片(HE染色) 顯示其中狀態(tài)良好的肝細胞和肝細胞周圍豐富的血供。圖8A為生物人工肝臟植入門靜脈系統(tǒng)72小時后，逆轉錄PCR顯示其中肝細胞特 異性功能基因都獲得很好的表達。圖8B顯示生物人工肝臟植入門靜脈系統(tǒng)72小時后，免疫 組織化學顯示其中肝細胞白蛋白合成旺盛，透射電鏡和PAS染色顯示其中糖原合成旺盛。 圖8C，顯示接受生物人工肝門靜脈植入治療的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型)的血氨 水平比非治療組明顯下降。圖8C，顯示接受生物人工肝門靜脈植入治療的急性肝衰竭大鼠 (90%肝切除模型)的生存時間比非治療組大鼠明顯延長，從16小時延長到了 72小時。根據(jù)附圖中的各項指標顯示，本發(fā)明中的門靜脈植入式生物人工肝臟黏附生長的 肝細胞重量達到了受者原有肝臟重量的10 %，可容納大量肝細胞，植入后血供充足，肝細胞 生長良好，使急性肝衰竭大鼠的生存時間明顯延長，肝功能明顯改善，首次成為一種真正意 義上的可替代受損肝臟的可移植器官。上述實驗證明，本發(fā)明方法制備的生物人工肝臟支架由于具有完整的細胞外基
7質，細胞貼附生長良好，且在植入體內后不會產生血栓，在體內肝細胞生長良好，在治療急 性肝衰竭大鼠的實驗研究中具有的獨特優(yōu)勢，為制備人工肝臟，解決肝源不足提供了可能， 具有極好的臨床應用前景。
權利要求
制備人工肝臟支架的聯(lián)合用試劑，包括灌注液1弱堿性低滲溶液或純水；灌注液2一組濃度呈梯度變化的離子型去垢劑水溶液；灌注液3電解質水溶液；灌注液4抗凝血因子水溶液；洗脫液1蒸餾水；洗脫液2非離子型去垢劑水溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合用試劑，其特征是還包括滅菌用的灌注液5。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的聯(lián)合用試劑，其特征是所述弱堿性低滲溶液為質量分 數(shù)為0. 的氨水溶液；所述一組濃度呈梯度變化的離子型去垢劑水溶液分別為質量分數(shù) 為1%、0. 5%和0.25%的SDS溶液；非離子型去垢劑水溶液為的Triton X-100溶液； 電解質水溶液為lg/L的PDADMAC溶液；抗凝血因子的水溶液為2g/L的肝素溶液；所述滅菌 用灌注液5為含抗生素的蒸餾水。
4.根據(jù)權利要求3所述的聯(lián)合用試劑，其特征是所述灌注液5所含抗生素為青霉素、 鏈霉素、兩性霉素B、氟康唑和/或甲硝唑。
5.一種制備可植入體內的生物人工肝臟的方法，其特征在于包括如下步驟a、對離體肝臟去細胞化用灌注液1灌注至肝臟中心區(qū)成乳白色，用洗脫液1蒸餾水洗 脫，然后用灌注液2灌注；用洗脫液2洗脫后得到人工肝臟支架；b、對步驟a得到的人工肝臟支架進行抗凝修飾用灌注液3灌注人工肝臟支架，用洗脫 液1洗脫后再用灌注液4灌注，再用洗脫1洗脫，該過程至少重復7次，得到可植入體內的 生物人工肝臟支架；c、將肝細胞貼附到步驟b得到的生物人工肝臟支架上，即得到可植入體內的生物人工 肝臟。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于步驟a和b中還包括用灌注液5灌注滅菌。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟a中，灌注液1灌注時間為12 24小時；灌注液2中各濃度的灌注液分別灌注1 2小時；滅菌時用灌注液5灌注6 12 小時，洗脫液1洗脫時間30 60分鐘；洗脫液2洗脫30 120分鐘；步驟b中用灌注液3灌注10分鐘，然后靜置20分鐘，用洗脫液1灌注10分鐘；接著用 灌注液4灌注10分鐘，然后靜置20分鐘；用洗脫液1灌注10分鐘，該過程重復至少7次；步驟c中貼附時，將濃度為3. 3X107個/ml細胞培養(yǎng)基的肝細胞注入步驟b得到的生 物人工肝臟支架，靜置4 6小時，用細胞培養(yǎng)基灌注培養(yǎng)2小時，再用生理鹽水灌注30分 鐘。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征是步驟a中灌注液1、2、5和洗脫液1的灌注 速度均為lml/min ；步驟b中灌注液3、4以及洗脫液1的灌注速度均為5ml/min，灌注液5 的灌注速度為2ml/min ；步驟c中細胞培養(yǎng)液和生理鹽水的灌注速度為2ml/min。
9.一種由權利要求5 8任一一項所述方法制備的可植入體內的生物人工肝臟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備生物人工肝臟支架的聯(lián)合用試劑，包括灌注液1弱堿性低滲溶液或純水；灌注液2一組濃度呈梯度變化的離子型去垢劑水溶液；灌注液3電解質水溶液；灌注液4抗凝血因子水溶液；洗脫液1蒸餾水；洗脫液2非離子型去垢劑水溶液。本發(fā)明還提供了一種用前述聯(lián)合用試劑制備植入式生物人工肝臟的方法；以及一種用上述方法制備的植入式生物人工肝臟。利用聯(lián)合用試劑制備的生物人工肝臟支架完全去細胞化，且細胞外基質結構保持完整。該生物人工肝臟可容納大量肝細胞并提供充足血供，使急性肝衰竭大鼠的生存時間明顯延長，肝功能明顯改善，具有極好的臨床應用前景。
文檔編號A61L27/36GK101850136SQ201010198279
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權日2010年6月11日
發(fā)明者包驥, 步宏, 石毓君 申請人:四川大學華西醫(yī)院