專利名稱：遠志皂苷在制備預防或治療帕金森病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及遠志皂苷在制備預防和治療帕金森病藥物的應用，屬于中藥領域。 技術背景“人口老齡化”問題，在21世紀是世界上每一個國家都將面臨的巨大挑戰(zhàn)。世界現有老人超過6億(60歲及以上，除注明外下同)，到21世紀的頭半個世紀末，即2050年，世界老年人口將明顯增加到20%，即每5個人中就有一位是老年人?！袄匣?，的確是21世紀面臨的一項挑戰(zhàn)。當前，人口老齡化成為經濟社會發(fā)展過程中的一個重要人口現象。截止到2006年底，北京市老年人口達到236萬人，占全市總人口的14.9%。帕金森病(Parkinson，s disease, PD)是一種多發(fā)于中老年期的中樞神經系統 (central nervous system,CNS)退變性疾病，其主要病理特征為黑質致密部多巴胺能神經元進行性死亡及胞漿內路易小體的出現，導致紋狀體多巴胺(Dopamine，DA)含量下降?；颊呒y狀體區(qū)多巴胺含量下降到70-80%時，會出現典型的臨床癥狀為靜止性震顫、肌僵直、 運動遲緩和姿勢平衡障礙等錐體外系癥狀。因此保護黑質多巴胺能神經元，增加多巴胺含量，能夠改善患者癥狀。目前臨床上常用的治療藥物主要對癥治療，并不能阻止疾病進展。 其中以DA氧化代謝為核心的氧化應激和老化相關的抗氧化系統缺陷等多種因素導致PD患者黑質DA能神經元選擇性死亡，大量實驗研究發(fā)現某些抗氧化保護線粒體功能藥物可能增加TH蛋白表達增加TH陽性細胞數，而對DA能神經元具有保護作用，可能對帕金森病有治療保護作用。現有的藥物及治療方法不能滿足人們的需求，能有效改善帕金森病癥狀延緩疾病進展并具有神經保護作用的藥物問世。遠志皂苷(tenuigenin)是中藥遠志的提取的活性成份，其主要成分為留體類化合物，我們進一步探討了中藥成份遠志皂苷的對PD的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供遠志皂苷在制備預防或治療帕金森病藥物的應用。本發(fā)明提供遠志皂苷在制備改善運動協調能力藥物應用。本發(fā)明提供遠志皂苷在制備提高多巴胺能神經元的細胞活力藥物中的應用。本發(fā)明提供遠志皂苷在制備降低乳酸脫氫酶含量藥物中的應用。本發(fā)明提供遠志皂苷在制備增加多巴胺代謝的限速酶酪氨酸脫羧酶TH的蛋白水平藥物中的應用。本發(fā)明提供遠志皂苷在制備增加黑質部位的TH(酪氨酸羥化酶)陽性細胞數藥物中的應用。本發(fā)明所述遠志皂苷的應用可以理解為遠志皂苷單獨用于治療或預防帕金森病中保護神經，增加多巴胺能神經元的細胞活力，降低乳酸脫氫酶的含量，增加多巴胺代謝的限速酶酪氨酸脫羧酶TH的蛋白水平，使黑質部位的TH陽性細胞數增多，或者是在與其他藥物配伍時其發(fā)揮上述的作用。
所述遠志皂苷如下方法制備取遠志，切碎，用1-3倍重量份的水浸泡0. 5-1. 5小時后，沸水煮0. 5-1. 5小時，濾出水煮液，其藥渣再加1-3倍重量份的水，沸水煮0. 1-1. 0小時，再次濾出水煮液，將提取液合并；減壓，在50-70°C條件下濃縮至原體積的1/10-1/2，冷卻后，加濃縮液1-3倍體積份的異丙醇，沉淀蛋白質和膠狀物，濾除沉淀物的溶液，加1/5體積的蒸餾水，再蒸去異丙醇，趁熱過濾，放冷，析出粗銀杏葉甙；濾取，干燥，使之溶于5-15 倍體積份的無水乙醇中，濾除不溶物，溶液加1/10-1/2重量份的水，蒸去乙醇，加10-20重量份的硅膠攪拌，過濾，濾液冷卻后，加2-20倍體積份的乙醇進行回流提取2-5次，合并提取液，靜置，濾取上清液，減壓濃縮至無醇味，低溫保存1-4小時；濾過，濾液通過處理好的大孔樹脂柱，水洗至近中性，再用2-6 0.5-1.5比例的乙醇-1-10%氫氧化鈉洗脫至近無色，收集2-6 0.5-1.5比例的乙醇-1-10%氫氧化鈉洗脫液，減壓回收乙醇，靜置5-10小時，濾過，濾渣用注射用水洗至中性，干燥，即得。本發(fā)明所述的遠志皂苷的制備方法優(yōu)選為取遠志，切碎，用2倍重量份的水浸泡 1小時后，沸水煮1小時，濾出水煮液，其藥渣再加2倍重量份的水，沸水煮0. 5小時，再次濾出水煮液，將兩次提取液合并；減壓，在60°C條件下濃縮至原體積的1/5，冷卻后，加濃縮液2倍體積份的異丙醇，沉淀蛋白質和膠狀物，濾除沉淀物的溶液，加1/5體積的蒸餾水，再蒸去異丙醇，趁熱過濾，放冷，析出粗銀杏葉甙；濾取，干燥，使之溶于10倍體積份的無水乙醇中，濾除不溶物，溶液加1/5重量份的水，蒸去乙醇，加15重量份的硅膠攪拌，過濾，濾液冷卻后，加10倍體積份量的乙醇進行回流提取4次，合并提取液，靜置，濾取上清液，減壓濃縮至無醇味，低溫保存3小時；濾過，濾液通過處理好的大孔樹脂柱，水洗至近中性，再用 4 1比例的乙醇-5%氫氧化鈉洗脫至近無色，收集4 1比例的乙醇-5%氫氧化鈉洗脫液，減壓回收乙醇，靜置7小時，濾過，濾渣用注射用水洗至中性，干燥，即得。上述遠志皂苷可以制備成膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液、緩釋、速釋制劑或注射劑等臨床可接受的劑型，為使上述劑型能夠實現，需在制備這些劑型時加入藥學可接受的輔料，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。 填充劑包括淀粉、預膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括 淀粉、預膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、 交聯羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括， 淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等。在體的動物實驗上發(fā)現50mg/kg，75mg/kg的遠志皂苷預保護能改善MPTP急性損傷的C57BL/6小鼠模型的運動協調能力，增加黑質部位的TH蛋白表達，增加紋狀體區(qū)的DA 含量。離體的細胞試驗上發(fā)現10_6-10_%遠志皂苷能增高50uM MPP+損傷的MN9D細胞的活力，減少其LDH釋放量。從實驗結果中可以得出遠志皂苷對PD的細胞和動物模型具有一定的保護作用，遠志皂苷通過明顯增加多巴胺能神經元的細胞活力，降低乳酸脫氫酶的含量， 并能增加多巴胺代謝的限速酶酪氨酸脫羧酶TH的蛋白水平，使黑質部位的TH陽性細胞數明顯增多。對PD的細胞動物模型具有明顯的保護治療作用。下述實驗用于進一步說明本發(fā)明，但是對本發(fā)明范圍的限制。實驗例1離體的細胞試驗1、材料
1.1主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基為美國GIBCO BRL公司產品；新生牛血清(NCS)為奧地利PAA 公司產品；胰蛋白酶(trypsin)、乙二胺四乙酸(EDTA)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、多聚-L-賴氨酸、1-甲基-4-苯基吡啶離子(l-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+idione)為美國 SIGMA 公司產
P
BFI ο1.2實驗所用試劑盒MTS細胞活力測定試劑盒、LDH細胞毒性測定試劑盒為PR0MAGE公司產品1. 3 細胞MN9D細胞由Novartis公司Bastian Hengerer博士贈送，本室凍存。1. 4 遠志皂苷(TEN)遠志皂苷購買自中國藥品檢驗所提供，系采用遠志科植物遠志Polygala tenuifolia Willd干燥根提出物其化學分析結果表明留族化合物，其中環(huán)戊烷并[α ]氫化菲骨架以僅有1個環(huán)增加1個或兩個原子予以改變C30H45C106。高效液相色譜測定多糖的平均相對分子質量為537. 127。1. 5主要儀器超凈工作臺北京賽伯樂實驗儀器有限公司；(X)2恒溫培養(yǎng)箱美國Thermo Forma 公司；液氮儲存罐美國^Thermo Forma公司；高壓消毒鍋英國Astell公司；電熱恒溫箱 德國MEMMERT公司；倒置光學顯微鏡日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡日本Nikon公司；_80°C超低溫冰箱法國JOUAN公司；-40°C冰箱中科美菱公司；_20°C和4°C冰箱中國 Haier和韓國LG公司；電動移液器Matrix Technologies, CELLMATE II公司；低速離心機對20 日本KUBOTA公司；高速離心機Minispin 德國EPPEND0RF公司；超純水純化系統 美國Millipore公司；電熱恒溫水浴箱德國MEMMERT和北京長風儀器儀表公司；GL-802 型微型臺式真空泵江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平和分析天平德國 Sartorius 公司。2 方法2. 1主要試劑及溶液的配制1) 20mM MPP+儲存液準確稱取MPP+lOOmg，加入16. 8ml 0. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS)，0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，分裝保存于_20°C。用前稀釋至相應濃度。3) 40mg/ml遠志皂苷儲存液稱取40mg遠志皂苷溶于0. 5mlDMS0+0. 5ml 0. 09%的生理鹽水(賂)，0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，分裝保存于_20°C。用前稀釋至相應濃度。4)Poly-L-Iysine將Poly-L-Iysine溶于無菌三蒸水中，配成100 μ g/ml的儲備液，0. 22 μ m微孔濾膜過濾，分裝保存于_20°C，用前稀釋至終濃度為12. 5 μ g/ml。5)0. 125%胰蛋白酶-0.01% EDTA(pH 7. 4，1L)細胞消化液胰蛋白酶12. 5g，EDTA 0. Ig, 0. OlM PBS 定容 1L，過濾分裝，_20°C保存。6)MN9D細胞培養(yǎng)液
DMEM/F12，10% NCS。7)MN9D細胞凍存液DMEM/F12 培養(yǎng)液，加入 10% NCS，10% DMSO。2. 2MN9D 細胞培養(yǎng)1)細胞的復蘇從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37°C水浴中，令其盡快融化，IOOOrpm離心5min 后棄上清，沉淀物用含血清培養(yǎng)液混懸，吸出細胞懸液，用適量培養(yǎng)液稀釋后，轉入無菌培養(yǎng)瓶37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。2)細胞的換液與傳代用相應的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，每2 3天換液一次。待細胞長至80%滿時，用0. 125% 胰酶/0.01% EDTA消化至細胞即將漂浮，加至少10倍體積的完全培養(yǎng)基終止反應，并用滴管仔細吹打使其成為單細胞懸液，1 3分瓶傳代。3)細胞的凍存選對數生長期細胞，在收集細胞前24h換液一次，用胰酶消化制成細胞懸液，離心，棄上清，用完全培養(yǎng)液+10 % DMSO配成凍存液，以1 X 106/ml密度混懸細胞。將細胞選液轉至凍存管，置于細胞凍存盒，4°C放置30min，放入_80°C超低溫冰箱中 12^24h,再轉入液氮中長期保存2. 3藥物處理方法步驟1) TEN對MN9D細胞活力的影響 將MN9D細胞接種于Poly-L-Iysine包被的96孔板，接種密度為3 X 104/ml，每孔接種體積為100 μ 1。細胞穩(wěn)定24h后更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的遠志皂苷孵育MtT48h，對照組加入相同體積的生理鹽水(賂)，MTS法檢測細胞存活率。2) TEN對MPP+誘導MN9D細胞損傷形態(tài)學改變的影響將MN9D細胞接種于Poly-L-lysine包被的M孔板，接種密度為5X 104/ml，每孔接種體積為1ml。細胞穩(wěn)定24h后更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的遠志皂苷孵育Ih后，加入50 μ M的MPP+共孵育Mh，對照組加入相同體積的NS，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。3) MTS法檢測細胞活力MTS(Owen’ s reagent)被細胞生物還原成為一種有色的甲臜產物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉化很可能是在代謝活躍的細胞中的脫氫酶產生的NADPH或NADH的作用下完成的。檢測時只需將少量的MTS直接加入培養(yǎng)板孔的培養(yǎng)基中，孵育1-4小時，在490nm 處檢測到的甲臜產物的量與培養(yǎng)中的活細胞數成正比。用無菌滴管移去培養(yǎng)液換成無血清的培養(yǎng)基100 μ 1，加入MTS溶液，10 μ 1/孔，放入CO2孵箱，5% C02，37°C孵育l_2h。用酶標儀檢測甲瓚的生成量，檢測波長為490nm。4)同時取細胞培養(yǎng)上清夜，250g離心15min，吸取上清液用于LDH的檢測。乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測細胞損傷率LDH是存在于細胞胞漿中的一種脫氫酶，在各種細胞中穩(wěn)定表達，在細胞受損傷后迅速釋放。因此，通過測定細胞培養(yǎng)液上清中LDH的含量，可以反映細胞受損傷的程度。測定原理LDH氧化乳酸生成丙酮酸，后者進一步同四唑鹽INT 反應生成水溶性的甲瓚，生成量與細胞受損傷的程度呈正相關，通過比色測定甲瓚的含量可以敏感、快速、準確反映細胞受損傷的情況。藥物處理細胞相應時間后用無菌槍頭移取培養(yǎng)液至離心管中，250g離心15min，取上清加入96孔板，50 μ 1/孔，加等量LDH反應混合液混勻后，避光室溫反應20分鐘，用酶標儀檢測甲瓚的生成量，檢測波長為490nm。用培養(yǎng)基作空白對照。5)數據處理和統計學檢驗統計分析采用4.0版軟件進行，多組數據間差異用單因素方差分析 (ANOVAs)并繼之以Tukey post-hoc檢驗。其結果用平均值士標準誤(Mean士s. e. m)表示。以ρ <0.05作為在統計學差異的界限3.結果3. 1遠志皂苷能增高50u M MPP+損傷的MN9D細胞的活力(12h，24h)，結果見表1
表1，MTS法測得MN9D細胞的OD值，表中數值為測得OD值/對照組OD
權利要求
1.遠志皂苷在制備預防或治療帕金森病藥物的應用。
2.遠志皂苷在制備改善運動協調能力藥物應用。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于遠志皂苷在制備提高多巴胺能神經元的細胞活力藥物中的應用。
4.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于遠志皂苷在制備降低乳酸脫氫酶含量藥物中的應用。
5.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于遠志皂苷制備增加多巴胺代謝的限速酶酪氨酸脫羧酶的蛋白水平藥物中的應用。
6.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于遠志皂苷在制備增加黑質部位的酪氨酸羥化酶陽性細胞數藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了遠志皂苷在制備預防或治療帕金森病和改善運動協調能力藥物應用。遠志皂苷對PD的細胞和動物模型具有一定的保護作用，遠志皂苷通過明顯增加多巴胺能神經元的細胞活力，降低乳酸脫氫酶的含量，并能增加多巴胺代謝的限速酶酪氨酸脫羧酶TH的蛋白水平，使的黑質部位的TH陽性細胞數明顯增多。對PD的細胞動物模型具有明顯的保護治療作用。
文檔編號A61K36/69GK102274296SQ201010200579
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權日2010年6月13日
發(fā)明者梁志剛, 王曉民 申請人:首都醫(yī)科大學