專利名稱：一種基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種具有復雜生物活性的細胞因子，主要由巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生。該物質(zhì)除了能夠在體內(nèi)或體外殺傷腫瘤細胞外，還具有抗病毒感染、激活巨噬細胞及多形核粒細胞、促進組織相容性抗原表達、調(diào)節(jié)機體免疫機能等多種功能。但是，當TNF-α過量表達時，它與其它炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷，如自身免疫性疾病，感染性疾病，惡液質(zhì)等。因此，中和體內(nèi)過量的TNF-α，可為上述疾病的治療提供一條有效途徑。目前的TNF-α拮抗藥物有hfliximab (Humiral)、Etanerc印t (Enbel)、 Adalimumab (Remicade)、CDP571 禾口 CDP870, Inf liximab>Etanercept 禾口 Adalimumab 已通過 FDA批準。hfliximab是Johnson&Johnson公司研制的一種對人TNF- α具有中和活性的人鼠嵌和抗體，被FDA批準用來治療類風濕關(guān)節(jié)炎和克羅恩病(Crohn病)，臨床試驗表明對銀屑病關(guān)節(jié)炎、非感染性色素層炎和鞏膜炎、盤狀紅斑狼瘡和強直性脊柱炎也有一定的治療效果。Etanerc印t是美國Immunex禾口 Wyeth—Ayerst Laboratories公司研制的基因重組 STNFR75與人IgGFc段的融合蛋白，是第一個用于臨床上的基因工程可溶性受體和抗TNF藥物，可同時抑制TNF-α和TNF-β，主要用來治療類風濕關(guān)節(jié)炎、幼年性類風濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎。Adalimumab是Abbott公司研制的一種具有TNF- α特異中和活性的重組的完全的人IgGl單克隆抗體，被FDA批準用來治療類風濕關(guān)節(jié)炎和Crohn病，已在臨床上取得了較好的療效。銀屑病又稱牛皮癬，是一種常見易復發(fā)的慢性皮膚病。據(jù)調(diào)查，該病在人群中的發(fā)病率白種人明顯高于黃種人，黑種人次之。美國近年來的調(diào)查，其發(fā)病率為2.6%，患者多達600-700萬人。雖然我國無關(guān)于銀屑病發(fā)病率的詳細研究，但有資料顯示在中國就大約有300萬患者，且發(fā)病率有逐漸升高的趨勢。銀屑病的傳統(tǒng)治療藥物副作用大，停藥后易復發(fā)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病的皮膚損傷部位，TNF-α的含量極高，說明TNF-α在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；臨床研究結(jié)果表明，阻斷TNF-α的作用，對銀屑病具有良好的治療作用；抗TNF-α抗體是目前關(guān)注的熱點，國外靜注劑型已進入臨床試驗。雖然用抗TNF-α方法治療多種TNF-α過量表達的相關(guān)疾病比傳統(tǒng)的治療方法更具有效性和安全性，但TNF-α單抗靜注后可能會影響人體內(nèi)的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，引起不良反應。如發(fā)生結(jié)核桿菌肉芽腫感染、Hodgkin淋巴瘤、藥物性狼瘡、凡科尼綜合癥、脫髓鞘病、 不眠癥、腎病綜合癥等不良反應的發(fā)生，同時在反復用藥的過程中檢測到抗TNF-α拮抗藥物的抗體的產(chǎn)生，另外還可發(fā)生注射反應、遲發(fā)性超敏反應、新引發(fā)的自身免疫反應等不良反應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，克服了全身應用TNF-α的諸多毒副反應，降低了用藥成本，簡化了用藥程序。為實現(xiàn)上述發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案來解決的一種基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，其包括以下重量份組分抗TNF- α單克隆抗體0. 33 0. 5份丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC) 1. 5 2. 5份聚乙二醇4000 (PEG 4000) 4 6 份丙三醇4 6份防腐劑0. 02 0. 04份水85. 127 89. 98 份。本發(fā)明各組分的最佳數(shù)值范圍為抗TNF- α單克隆抗體0. 35 0. 45份丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC) 1. 8 2. 2份聚乙二醇4000 4. 8 5. 2 份丙三醇4. 8 5. 2份防腐劑0.0 0.031份水87 88 份。作為本發(fā)明的一種實施方式所述的抗TNF- α單克隆抗體(抗TNF- α mAb)的重鏈可變區(qū)基因序列SEQ ID NO. 1，其輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 2所示。 本發(fā)明中所述的防腐劑采用凱松。本發(fā)明通過構(gòu)建分泌抗TNF- α單克隆抗體(抗TNF- α mAb)的雜交瘤細胞株和細胞株種子庫，應用發(fā)酵法或SPF級小鼠制備抗TNF-α單克隆抗體；并對抗TNF-α單克隆抗體進行純化，其中包括TNF-α單克隆抗體的檢測和鑒定。然后通過建立銀屑病動物模型，進行藥效學研究和局部毒性研究，并進行安全性評價、動物局部刺激試驗、動物血清中抗TNF-α單克隆抗體濃度檢測；實驗結(jié)果說明了基于抗TNF-α單克隆抗體的軟膏符合對小鼠銀屑病模型具有良好的治療作用，應用靈敏度為IOpg的ElISA試劑盒進行檢測，未在小鼠血清中檢測到抗TNF- α mAb,說明抗TNF- α mAb軟膏透皮給藥但不進入血液，避免了鼠源性免疫原性問題，簡化了抗TNF- α mAb人源化的復雜操作環(huán)節(jié)，安全可靠。與現(xiàn)有技術(shù)相比，銀屑病的傳統(tǒng)治療藥物副作用大，停藥后易復發(fā)，隨著銀屑病免疫機制的闡明，生物治療已成為新的發(fā)展趨勢；國外靜注劑型TNF-α已進入臨床試驗，但抗TNF-α單克隆抗體靜注后可能會影響人體內(nèi)的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，引起不良反應，局部應用具有更大的優(yōu)勢。本發(fā)明提供的基于抗TNF-α單克隆抗體的軟膏為水溶性基質(zhì)，用于治療銀屑病， 在皮膚損傷部位應用TNF-α拮抗劑，既可起到治療作用又不引起全身應用抗TNF-α抗體所導致的不良反應；實驗證實，抗TNF-α單克隆抗體軟膏可完全阻斷TNF-α的作用，對動物銀屑病模型具有良好的治療作用；而且抗TNF-α單克隆抗體軟膏通過透皮給藥但不進入血液，這樣就簡化單克隆抗體人源化的復雜操作環(huán)節(jié)，降低藥品生產(chǎn)成本；抗TNF-α單克隆抗體軟膏是一種安全、有效、經(jīng)濟的生物技術(shù)新藥。


圖1是本發(fā)明抗TNF-α單克隆抗體鑒別試驗結(jié)果其中，1.分子量marker ；
2.陰性對照無關(guān)抗原；
3. TNF- α。
具體實施例方式以下結(jié)合通過附圖和實驗例以及實施例對本發(fā)明進行闡述，然而本發(fā)明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。以下實驗涉及的試劑45%聚乙二醇(PEG，MW. 4000，Merck)不完全培養(yǎng)液(RPMI 1640)完全培養(yǎng)液含20%小牛血清RPMI 1640HAT 選擇培養(yǎng)液(Sigma)HT 培養(yǎng)液(Sigma)細胞凍存液50% RPMI 1640、40%小牛血清、10%二甲基亞砜1、分泌抗TNF- α單克隆抗體細胞株的構(gòu)建①以重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-α)為免疫原，經(jīng)皮下、腹腔等途徑多點、多次免疫8周齡雌性Balb/c小鼠。第一次免疫使用完全福氏佐劑，第二、三次使用不完全福氏佐劑，兩次免疫間隔約2 3周。進行雜交瘤細胞融合前3天腹腔及尾靜脈追加免疫。②無菌條件下獲取最后一次加強免疫3天以后的小鼠脾臟，研磨并制成免疫脾細胞懸液；取小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0細胞為親本另一細胞系，經(jīng)8氮雜鳥嘌呤(8-AG)篩選以確保該細胞系對HAT的敏感性；以45%聚乙二醇(PEG，WL 4000, Merck)為促融劑。③在融合前一天無菌取6 10周齡Balb/c小鼠腹腔巨噬細胞作為融合用飼養(yǎng)細胞。④取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP2/0，IOOOrpm離心5min，棄上清，用不完全培養(yǎng)液(RPMI1640)混懸細胞后計數(shù)，根據(jù)小鼠脾細胞數(shù)取所需SP2/0的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次；同時取免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 10或1 5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗滌1次， 1200rpm離心8min，棄上清，用滴管吸凈殘留液體；輕輕彈擊離心管底部，使細胞沉淀略為松動。在室溫下，30s內(nèi)加入37°C預熱的含5% DMSO的Iml 45% PEG，邊加邊旋轉(zhuǎn)離心管， 作用90s 120s后加入37°C預熱的不完全培養(yǎng)液終止PEG作用，每^iin內(nèi)分別加入1ml， 2ml, 3ml, 4ml, 5ml和IOml不完全培養(yǎng)液，800rpm離心6min。棄上清，先用6ml完全培養(yǎng)液 (含20%小牛血清RPMI 1640)輕輕混懸，補加完全培養(yǎng)液至40ml，將融合后細胞懸液按 100 μ 1/孔加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，雜交瘤細胞融合M小時后加入HAT選擇培養(yǎng)液(Sigma)，兩周后改用HT培養(yǎng)液(Sigma)，再維持培養(yǎng)兩周即改用含 10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液。2、雜交瘤的篩選及克隆化采用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤，濃度為1 μ g/ml的rhTNF-α包被96孔ELISA板(Nunc.)，4°C過夜。PBS洗板后，加入雜交瘤培養(yǎng)上清，37°C，2小時孵育。辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(Sigma)作為第二抗體，ABTS(Sigma)底物系統(tǒng)顯色后， 測定410nm OD值。采用有限稀釋法進行克隆化(參考興界圖書出版公司的(細胞培養(yǎng)) 手冊，2004年3月第一版315-32 。連續(xù)兩次克隆化后所選單個克隆，培養(yǎng)上清中抗體檢測(間接ELISA法)均達100%陽性者，即為可穩(wěn)定分泌抗rhTNF-α單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞株。將所得雜交瘤細胞用10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)后IOOOrpm 離心10分鐘，棄上清，將細胞懸入細胞凍存液(50% RPMI 1640、40%小牛血清、10%二甲基亞砜)，分裝0. 8ml/支，每支含雜交瘤細胞1 X IO6,放入液氮罐凍存。3、抗rhTNF-α單克隆抗體的制備選取8-10周齡雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射液態(tài)石蠟0. 5ml。一周后再腹腔注射抗rhTNF-a雜交瘤細胞1 X IO6待小鼠腹腔產(chǎn)生腹水(大約8_12天)后，從小鼠腹腔取腹水，然后3000rpm離心20分鐘，分離腹水，-80°C凍存?zhèn)溆谩?、抗人TNF-α單克隆抗體純化工藝①原理Q-SePharose Fast Flow為強陰離子交換介質(zhì)，具有流速快、載量高的特點。小鼠 IgG的PI范圍為pH7. 0 8. 5，而白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白PI范圍為pH4. 7 5. 0，故在中性pH 環(huán)境中Q-^^harose Fast Flow更傾向于結(jié)合腹水中的非目的蛋白。在用鹽溶液梯度洗脫時，mAb會較早被洗脫或出現(xiàn)在穿過液中，從而可得到分離純化的IgG。②材料和器材(一)、材料Q-SePharose Fast Flow飽和硫酸銨(NH4)2SO4溶液起始緩沖液0.02M Tris-HCI 緩沖液，pH7. 5洗脫緩沖液0.02M Tris-HCI 緩沖液，1. OM NaCI，ρΗ7· 5再生緩沖液0. IM NaOH(二)、器材XK 16/20 層析柱Ampharmacia AKTAFPLC 層析系統(tǒng)③操作步驟(一)、樣品的準備(1)取小鼠腹水進行IOOOOrpm離心lOmin，除去腹水中的沉淀物或殘存的降植烷；(幻40%飽和硫酸銨溶液沉淀腹水中蛋白質(zhì)，lOOOOrpm，離心30min后棄上清，沉淀用40%飽和硫酸銨溶液洗滌2次后用生理鹽水重懸；(3)用 0. 02M Tris-HCI 緩沖液，ρΗ7· 5 透析除鹽。(二)、分離純化(1)按照Q-kPharose Fast Flow生產(chǎn)廠家提供的說明書裝柱；(2)以5ml/min的流速，用起始緩沖液充分平衡層析柱至流出液的pH值與起始緩沖液的相同；
(3)上樣后以2個柱體積的起始緩沖液洗掉非結(jié)合蛋白，以遞增鹽濃度的洗脫液洗脫，流速5ml/min。IgG將首先被洗脫。(4)以5ml/min的流速，2個柱體積的0. IM NaOH對層析柱進行再生。(5)用起始緩沖液重新平衡層析柱，以備下次再用。5、抗rhTNF-α單克隆抗體的鑒定 ①抗rhTNF- a mAb腹水效價測定采用間接ELISA法測定抗TNF- α小鼠腹水的效價達IX IO7。②免疫球蛋白(Ig)亞類的鑒定采用美國GIBCO公司ELISA試劑盒對雜交瘤培養(yǎng)上清中mAb的類、亞類及型進行鑒定，結(jié)果顯示mAb為IgGl型。③抗rhTNF- a mAb與大腸桿菌菌體蛋白的交叉反應以1 10的大腸桿菌菌體蛋白包被ELISA板，用間接ELISA法檢測mAb與大腸桿菌菌體蛋白的交叉反應。同時，以 rhTNF-α包被ELISA板，加1 10大腸桿菌菌體蛋白封閉后，用間接ELISA法檢測大腸桿菌菌體蛋白對不同濃度mAb與rhTNF-α反應的阻斷作用。結(jié)果表明mAb與大腸桿菌菌體蛋白無交叉反應，且大腸桿菌菌體蛋白對mAb與rhTNF-a的反應也無抑制作用。說明了 mAb是抗rhTNF- α的抗體而非抗菌體蛋白的抗體。④抗rhTNF-a mAb與各種重組人細胞因子的交叉反應rhIL_l、rhIL-3、rhIL-6、 rhIL-8、rhTNF- β、rhIFN- α 及 rhGM-CSF 均以 1 μ g/ml 濃度包被 ELISA 板，用間接 ELISA 法檢測抗rhTNF- a mAb與各種重組人細胞因子的交叉反應，結(jié)果顯示抗rhTNF- a mAb與各種重組人細胞因子均無交叉反應，說明了抗rhTNF- α抗體特異性強。⑤采用抗rhTNF- a mAb阻斷TNF誘導細胞發(fā)生凋亡實驗進行中和活性的鑒定0. 25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，用RPMI 1640洗滌細胞后，調(diào)整細胞濃度至 2X 106/ml。加入 3H-TdR, 20Ci/ml，置 37°C>5% CO2 培養(yǎng)箱中 2 3h，1 次 /30min 搖動。用RPMI 1640洗滌2次，每次洗滌后800rpmX5min離心。調(diào)整細胞濃度至2X IO5 3XlO5Ail后，按100 μ 1/孔加入96孔培養(yǎng)板中。在固定濃度rhTNF-a (40U/ml)中等體積加入不同稀釋度mAb (0，1 IO2 1 108)，37°〇孵育301^11后，將此混合物加入含有1^擬9 細胞的培養(yǎng)板中，100 μ 1/孔。(設(shè)三個重復孔)。加入放線菌素D，使最終濃度至1 μ g/ml。 同時設(shè)含有1 μ g/ml放線菌素D的完全培養(yǎng)液為陰性對照，在37°C、5% CO2，培養(yǎng)Mh。加入3%胰蛋白酶和0. 25% DNA酶各10 μ 1/孔，37°C，培養(yǎng)30min。用DYQ-II型多頭細胞收集器收集樣品于“9999”型玻璃纖維濾紙上?？靖蔀V紙后，進行計數(shù)。提供數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) (參見圖1) :mAb對rh TNF-α誘導的細胞凋亡有很強的中和作用，當mAb的稀釋度為1 2X IO6時，抑制率仍可達30%，說明mAb與rh TNF-α有特異性的高親和力。經(jīng)測序，所述的抗TNF-α單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 1所示，輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 2所示。抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體凝膠實施例一配方(100kg制備用量)丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC)聚乙二醇PEG 4000丙三醇
2kg 5kg 5kg
7
防腐劑(凱松)0. 03kg抗TNF- α 單克隆抗體(2. 5mg/ml)400ml (0. 4kg)7jC87. 57kg實施例二 配方(100kg制備用量)丙烯酰二甲基牛磺酸銨/VP共聚物(AVC)1.5kgPEG 40004kg丙三醇4kg防腐劑(凱松)0.02kg抗TNF- α 單克隆抗體(2. Omg/ml)500ml (0. 5kg)水89. 98kg實施例三配方(IOOkg制備用量)丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC)2. 5kgPEG 40006kg丙三醇6kg防腐劑(凱松)O. 04kg抗TNF- α 單克隆抗體(3. Omg/ml)333. 3ml (0. 333kg)/K85. 127kg上述實施例一 三的抗人腫瘤壞死因子單克隆抗體凝膠的制備將AVC、聚乙二醇(PEG) 4000以60°C蒸餾水攪拌溶解備用。將丙三醇(甘油)、防腐劑(凱松)、抗TNF- α mAb、水加入，勻速攪拌，600-1000rpm，持續(xù)攪拌至分散均勻即可得到半成品凝膠。取出半成品凝膠，將其移入凝膠軟管灌裝機中，按20g/管或IOg/管的每管裝量或其他生產(chǎn)指令規(guī)定的標示量進行灌裝，灌裝好的凝膠作為成品置于4°C冷庫中保存。灌裝過程中應動態(tài)進行灌裝量的檢測，成品檢測合格后進行外包裝包裝。外包裝完成進行包裝檢查，合格后入庫。上述實施例中包含抗TNF-α單克隆抗體的軟膏藥效學研究1 材料1. 1 藥品恩膚霜(丙酸氯倍他索軟膏)，廣東通用藥業(yè)股份有限公司，批號040302。腫瘤壞死因子單克隆抗體(TNFa-Mab)凝膠劑(0. 3;3mg/支、Img/支、3mg/支)，每支 IOgo1.2 動物昆明種小鼠50只，早$各半，20 Mg，購自甘肅蘭州生物制品研究所，合格證號 醫(yī)第14-001號。1.3儀器和設(shè)備Leca顯微鏡，CMIAS病理圖象分析儀。2實驗方法
實驗動物分組表1實驗動物分組表
權(quán)利要求
1.一種基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，其特征在于，其包括以下重量份組分抗TNF- α單克隆抗體0. 33 0. 5份丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC) 1. 5 2. 5份聚乙二醇4000 4 6份丙三醇4 6份防腐劑0. 02 0. 04份水85. 127 89. 98 份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，其特征在于， 其包括以下重量份組分抗TNF- α單克隆抗體0. 35 0. 45份丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC) 1. 8 2. 2份聚乙二醇40004. 8 5. 2份丙三醇4. 8 5. 2份防腐劑0. 029 0. 031份水87 88份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，其特征在于，所述的抗TNF-α單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 1所示，輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，其特征在于， 所述的防腐劑采用凱松。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，其包括以下重量份組分抗TNF-α單克隆抗體0.33～0.5份、丙烯酰二甲基?；撬徜@/VP共聚物(AVC)1.5～2.5份、聚乙二醇4000 4～6份、丙三醇4～6份、防腐劑0.02～0.04份、水85.127～89.98份。該基于抗TNF-α單克隆抗體的用于治療銀屑病的軟膏，既可起到治療作用又不引起全身應用抗TNF-α抗體所導致的不良反應。
文檔編號A61K9/06GK102274165SQ20101020212
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者劉節(jié), 張英起, 趙寧 申請人:趙寧