專利名稱：Plac1抗腫瘤ctl表位肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PLACl來(lái)源的抗腫瘤 CTL表位肽及其在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
PLACl (Placenta-specific 1)屬于腫瘤-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen, CTA)家族，在成人的正常組織中僅在睪丸和胎盤(pán)有明顯表達(dá)，在乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌以及 肺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)。PLACl在原發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)率高達(dá)82%，而在正常 乳腺組織不表達(dá)PLACl與腫瘤尤其是乳腺癌密切相關(guān)，是一個(gè)非常理想的乳腺癌免疫治療 靶抗原。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在 腫瘤中發(fā)揮的重要作用越來(lái)越受到重視。如何有效地激發(fā)CTL介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng) 答，發(fā)揮抗腫瘤效能，已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤治療性多肽疫苗研制領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。既往研 究發(fā)現(xiàn)，引起CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)的，并非完整的腫瘤抗原分子，而是抗原來(lái)源的特異性CTL 表位(Epitope)?？乖f呈細(xì)胞攝取腫瘤抗原后，通過(guò)蛋白水解作用將其加工成為8-10個(gè) 氨基酸長(zhǎng)度的多肽片段，即CTL表位，進(jìn)而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的主要組織相容性復(fù)合體I(MHCI) 類分子結(jié)合形成多肽-MHC復(fù)合物(p^tide-MHC complex，pMHC)，并最終將pMHC遞呈到細(xì) 胞表面供CD8+T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)識(shí)別，從而活化CTL細(xì)胞， 引發(fā)CTL免疫應(yīng)答。但是，免疫原性弱和免疫耐受的存在是CTL表位作為腫瘤治療性多肽 疫苗應(yīng)用的兩大障礙。因此，如何提高CTL表位的免疫原性以及打破機(jī)體對(duì)CTL表位的免 疫耐受成為腫瘤治療性多肽疫苗發(fā)展的關(guān)鍵。目前，在眾多腫瘤治療性多肽疫苗的增強(qiáng)策略中，對(duì)CTL表位進(jìn)行分子改造被認(rèn) 為是最有前景的方法之一。CTL表位的改造，可以通過(guò)改造表位MHC結(jié)合位點(diǎn)，從而改善 表位與MHC的親和力和pMHC的穩(wěn)定性，以達(dá)到增強(qiáng)免疫原性的目的；也可以通過(guò)改造表位 TCR結(jié)合位點(diǎn)，從而改善pMHC與TCR結(jié)合的穩(wěn)定性，以達(dá)到提高CTL活性并克服CTL耐受的 目的。近期研究表明，基于表位MHC結(jié)合位點(diǎn)改造的多肽疫苗雖然可以一定程度上提高疫 苗的免疫原性，但在腫瘤免疫治療中達(dá)不到理想的抑瘤效果；而基于表位TCR結(jié)合位點(diǎn)改 造的多肽疫苗，有望通過(guò)增強(qiáng)對(duì)低親和力T細(xì)胞的刺激能力或者招募一群新的具有交叉反 應(yīng)性的T細(xì)胞打破腫瘤免疫耐受而達(dá)到理想的抑瘤效果。HLA-A2. 1分子主要與九肽結(jié)合，其二位和九位為MHC主要錨定位點(diǎn)。Jorg Ruppert(Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2. 1 molecules. Cell. 1993,74(5) =929-37.)在研究主要錨定位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)氨基酸中 發(fā)現(xiàn)二位為L(zhǎng)或M，九位為L(zhǎng)、V或I，能將表位與MHC結(jié)合的能力提高10 100倍；而 對(duì)與次要錨定位點(diǎn)的改造，最常用且最有效的一種方法就是將一位的氨基酸使用酪氨酸 (Tyr)替換。Tourdot (A general strategy toenhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2. !-associated peptides amplication in theidentification of cryptic tumorepitopes. EurJ Immunol. 2000,30(12) :3411_21.)指出一位 Tyr 的引入主要依靠其側(cè)鏈苯 環(huán)的疏水作用以及酚羥基的氫鍵作用增強(qiáng)表位肽與HLA分子的相互作用。本申請(qǐng)主要是采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，修飾并初步鑒定出與MHC分子結(jié)合 能力高的PLAC1來(lái)源的候選CTL表位肽及其類似物。我們通過(guò)對(duì)CT datebase的篩選，發(fā) 現(xiàn)了一種新認(rèn)定的在乳腺癌中高表達(dá)的癌睪抗原CT96(即PLAC1)，它在乳腺癌中的陽(yáng)性表 達(dá)率超過(guò)了 80 %，是CT抗原中非常理想的一個(gè)乳腺癌免疫治療靶抗原，而目前關(guān)于它們的 表位鑒定還沒(méi)有文章報(bào)道。根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITHI、 BIMAS和Net CTL 1. 2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)抗原PLAC1的HLA-A2. 1限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于用人工合成的方法提供一種具有抗腫瘤作用的PLAC1抗腫瘤CTL 表位肽本發(fā)明另一目的在于提供該P(yáng)LAC1抗腫瘤CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗 中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案PLAC1 抗腫瘤 CTL 表位肽，為九肽，其序列為a-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-b 或 c-d-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val ；其中，a 為 Val 或 Tyr，b 為 Met 或 Val ；c 為 Ser 或 Tyr, d 為 lie 或 Leu。當(dāng) a 為 Val，b 為 Met 時(shí)，序列為 Val-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met (即 VLCSIDWFM，記為 P28)，分子量為 1113. 4。當(dāng) a 為 Tyr，b 為 Val 時(shí)，序列為 Tyr-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Val (即 YLCSIDWFV，記為 P28-1Y9V)，分子量為 1145. 4。當(dāng) c 為 Ser, d 為 lie 時(shí)，序列為 Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val (即 SIDWFMVTV,記為 P31)，分子量為 1097. 3。當(dāng) c 為 Tyr, d 為 Leu 時(shí)，序歹lj 為 Tyr_Leu_Asp_Trp_Phe_Met_Val_Thr_Val (艮口 YLDWFMVTV，記為 P31-1Y2L)，分子量為 1173. 2。所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽的制備方法，可以采用固相合成法合成CTL表位肽。 基本流程如下首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹(shù) 脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接到固相載體上了 ；其次將氨基被Fmoc 基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第 一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重 復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，最后切割 得到目的肽。經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。(參 見(jiàn)①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.賈庫(kù)布克著， 劉克良等譯，肽化學(xué)與生物學(xué)，科學(xué)出版社，2005年。)所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)利用在乳腺癌中高表達(dá)而在人體正常組織中不表達(dá)的抗原PLAC1， 篩選出具有抗腫瘤活性的表位肽，鑒定的九肽均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于抗原PLAC1的 腫瘤治療性多肽疫苗提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。



圖1是本發(fā)明表位肽P28的質(zhì)譜分析圖譜；圖2是本發(fā)明表位肽P28-1Y9V的質(zhì)譜分析圖譜；圖3是本發(fā)明表位肽P31的質(zhì)譜分析圖譜；圖4是本發(fā)明表位肽P31-1Y2L的質(zhì)譜分析圖譜；圖5是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7殺傷效應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果；圖6是本發(fā)明表位肽在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7殺傷 效應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)儀器名稱與型號(hào)電噴霧-離子阱多級(jí)質(zhì)譜儀BRU KER Esquire-3000德國(guó)布魯克道爾頓儀器公司流式細(xì)胞儀Calibur美國(guó)BD公司
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1 抗腫瘤 CTL 表位肽 P28 (Val-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met)的制 備采用Fmoc固相合成法，從C端一N端逐個(gè)延長(zhǎng)。用芴甲氧羰?；?Fmoc)保護(hù) 氨基酸的α -氨基，各種Fmoc保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基分別為Trp (Boc), Asp (OtBu)、 Ser (tBu)、Cys (trt) (Boc代表叔丁氧羰基、OtBu代表叔丁脂、tBu代表叔丁基、trt代表三 苯甲基)。先將α-氨基保護(hù)的C端第一個(gè)氨基酸，即Fmoc-Met-OH用N、N' -二異丙基 碳二亞胺(DIC)作縮合劑，并加入N-羥基苯胼三氮唑(HOBt)，將Fmoc-Met-OH連接到wang 樹(shù)脂上。依次用DMF、無(wú)水甲醇、二氯甲烷、DMF洗滌。用哌啶-DMF混合液(Ve Vdmf = 1 4)除去Fmoc保護(hù)基，依次用DMF、無(wú)水甲醇、二氯甲烷、DMF洗滌。再與C端第二個(gè)氨基 酸即Fmoc-Phe-OH用DIC作縮合劑，并加HOBtJf Fmoc-Phe-OH連接到Met的氨基上，用哌 啶-DMF混合液(V Vdmf = 1 4)脫去Fmoc保護(hù)基，依次用DMF、無(wú)水甲醇、二氯甲烷、 DMF洗滌。得Phe-Met-Wang樹(shù)脂。再與Fmoc-Trp (Boc) -OH連接，重復(fù)上述步驟，依次連接 上Asp、lie、Ser, Cys, Leu、Val，使肽鏈按序列從C端一N端逐步延長(zhǎng)，用哌啶-DMF混合液 (ymM Vdmf= 1 4)脫去Fmoc保護(hù)基，用切割試劑(V 三氟i酸乂苯甲硫醚乂水V苯酚νι, 2-i-st = 82. 5 5 5 5 2. 5)將 P28 從 Wang 樹(shù)脂上切下，并脫去 Boc、OtBu、tBu、 trt保護(hù)基，得到抗腫瘤CTL表位肽P28粗品。HPLC 分離純化用 C18 制備性 HPLC 柱(Partisil 10 0DS-39. 4X 250mm, Whatman 公司)分離純化。取上述P28粗品30mg溶于3ml含三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)的水溶液 a(TFA體積含量為0. 1%，CAN體積含量為30% )中，用a進(jìn)行等梯度洗脫，流速5ml/min， 收集主峰，冷凍干燥得精肽。將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析見(jiàn)圖1，結(jié)果證實(shí)分子量為1113. 4，與理 論值相符合。實(shí)施例2 抗腫瘤 CTL表位肽 P28-1Y9V (Tyr-Leu-Cys-Ser-IIe-Asp-Trp-Phe-Val) 的制備采用與實(shí)施例1同樣的合成方法，不同之處僅在于用Val替代Met，Tyr替代Val。
將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析見(jiàn)圖2，結(jié)果證實(shí)分子量為1145. 4，與理論值相符合。實(shí)施例3 抗腫瘤 CTL 表位肽 P31 (Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val)的制 備采用Fmoc固相合成法，從C端一N端逐個(gè)延長(zhǎng)。用芴甲氧羰?；?Fmoc)保護(hù)氨基 酸的a -氨基，各種Fmoc保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基分別為Ser(tBu)、Asp(0tBu)、Trp(Boc)、 Thr (tBu) (tBu代表叔丁基、OtBu代表叔丁脂、Boc代表叔丁氧羰基)。先將a -氨基保護(hù) 的C端第一個(gè)氨基酸，即Fmoc-Val-OH用N、N' - 二異丙基碳二亞胺(DIC)作縮合劑，并加 入N-羥基苯胼三氮唑(HOBt)，將Fmoc-Val-OH連接到wang樹(shù)脂上。依次用DMF、無(wú)水甲 醇、二氯甲烷、DMF洗滌。用哌啶-DMF混合液(V_ VDMF = 1 4)除去Fmoc保護(hù)基，依 次用DMF、無(wú)水甲醇、二氯甲烷、DMF洗滌。再與C端第二個(gè)氨基酸即FmoC-Thr(tBu)-0H用 DIC作縮合劑，并加HOBt，將Fmoc-Thr (tBu) -0H連接到Val的氨基上，用哌啶-DMF混合液 (ym& VDMF = 1 4)脫去Fmoc保護(hù)基，依次用DMF、無(wú)水甲醇、二氯甲烷、DMF洗滌。得 Thr (tBu) -Val-ffang樹(shù)脂。再與Fmoc-Val-OH連接，重復(fù)上述步驟，依次連接上Met、Phe、 Trp、Asp、lie、Ser,使肽鏈按序列從C端一N端逐步延長(zhǎng)，用哌啶_DMF混合液(V_ VDMF =1:4)脫去Fmoc保護(hù)基，用切割試劑(V三氟⑶V苯甲硫醚V水力,2_己二硫醇= 82. 5 5 5 5 2. 5)將P31從Wang樹(shù)脂上切下，并脫去tBu、0tBu、Boc保護(hù)基，得到 抗腫瘤CTL表位肽P31粗品。HPLC分離純化用 C18制備性HPLC柱(Whatman Partisil 100DS-39. 4X 250mm)分 離純化，取上述P31粗品30mg溶于3ml含三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)的水溶液a (TFA體積 含量為0. 1%，CAN體積含量為30%)中，用a進(jìn)行等梯度洗脫，流速5ml/min，收集主峰，冷 凍干燥得精肽，將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析見(jiàn)圖3，結(jié)果證實(shí)分子量為1097. 3，與理論值相符合。實(shí)施例4 抗腫瘤 CTL 表位肽 P31-lY2L(Tyr-Leu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr_Val) 的制備采用與實(shí)施例3同樣的合成方法，不同之處僅在于Leu替代lie，Tyr替代Ser。將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析見(jiàn)圖4，結(jié)果證實(shí)分子量為1173. 2，與理論值相符合。上述制備的CTL表位肽，可用于制備腫瘤治療性多肽疫苗，其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)如下1、表位肽與HLA-A2. 1分子結(jié)合力試驗(yàn)(1) 800rpm離心收集HLA-A2. 1表達(dá)陽(yáng)性且內(nèi)源性抗原加工處理能力缺失的T2細(xì) 胞(ATCC公司)，PH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibico 公司)重懸至細(xì)胞密度為1 X 106/mL,接種于24孔板中。(2)每孔加入50 ii g表位肽和0. 5 ii g人日2微球蛋白(Sigma公司)，37°C共孵育 18h ；(3)用4°C的PBA (將2g牛血清白蛋白，0. 2g疊氮化鈉溶解于100ml PH7. 4的PBS 中即得PBA)洗滌3次，加100 ill用PH 7. 4的PBS 100倍稀釋后的鼠抗人HLA-A2. 1分子 的單克隆抗體BB7. 2 (Sigma公司)，4°C避光孵育40min ；(4)用4°C的PBA洗滌3次，加入50 yl用PH 7. 4的PBS 50倍稀釋后的異硫氰酸 熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4°C避光孵育30min ；(5) PBA洗滌后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果用熒光系數(shù)FI表示，詳見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，4條表位肽均顯示出中等結(jié)合力，且改造肽P28-1Y9V和P31-1Y2L均高于母體肽P28和P31。2、表位肽/HLA-A 2. 1分子復(fù)合物穩(wěn)定性分析(l)800rpm離心收集T2A2細(xì)胞，PH7. 2的PBS洗滌3次，無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基 重懸至細(xì)胞密度為1 X IOVmL,接種于24孔板中；(2)每孔加入50 μ g表位肽和0. 5 μ g人β 2微球蛋白，37°C共孵育18小時(shí)；(3) 40C PH7. 2的PBS洗滌4次以除去未結(jié)合的肽；(4)每孔加入 10 μ g BrefeldinA (BFA, Sigma 公司)孵育 lh, PBS 洗滌；(5)37°C>5% CO2 分別孵育 0h、2h、4h、6h ；(6)孵育結(jié)束后，用4°C的PBA洗滌3次，加100 μ 1用PH 7. 4的PBS 100倍稀釋 后的鼠抗人HLA-A2. 1分子的單克隆抗體ΒΒ7. 2(—抗)，4°C反應(yīng)30min ；(7) 40C的PBA洗滌3次，力卩50 μ 1用PH 7. 4的PBS 50倍稀釋后的FITC標(biāo)記的羊 抗鼠 IgG，4°C反應(yīng) 30min ；(8) 4°C的PBA洗滌后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果用表位肽/HLA-A 2. 1分子復(fù)合物 的半衰期DC5tl表示，詳見(jiàn)表1。由表1可知，四條表位肽的半衰期均大于2h，其中改造肽P28-1Y9V和P31-1Y2L優(yōu) 于母體肽P28和P31。表1表位肽與HLA-A2. 1結(jié)合力及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 注FI =(表位肽平均熒光強(qiáng)度_背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度FI > 1.5 表位肽與HLA-A2. 1具有強(qiáng)結(jié)合力；0. 5 < FI < 1. 5 中等結(jié)合力；FI < 0. 5 弱結(jié)合力；DC50為50 %表位肽/HLA-A2. 1分子復(fù)合物解離所需的時(shí)間。3、人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的分離與誘導(dǎo)及LDH檢測(cè)抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細(xì)胞介素 2 (IL-2，Peprotech公司)和人β 2微球蛋白誘導(dǎo)分化CTL細(xì)胞。方法如下(1)以40ml PBS (PH 7. 2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ；(2)離心管中加入 4ml Lymphoprep 分離液(Axis—Shield 公司)；(3)加8ml步驟(1)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上；(4)20°C離心(2000rmpX20min)；(5)離心后，分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs)；(6)吸出的白膜層用PBS(PH 7. 2)離心洗滌兩次；(7)用24孔板鋪板，細(xì)胞的濃度為1 X 106/ml，每孔1ml ；(8)第二天每孔加入10 ii g人0 2微球蛋白和10 ii g表位肽，同時(shí)設(shè)立PBS組(以 PBS替代表位肽)作為陰性對(duì)照組；(9)第三天每孔加入50u IL-2 ；每2 3天換液，于七天后進(jìn)行第二輪荷肽(即每孔補(bǔ)加50u IL-2、10 P g人3 2 微球蛋白和10 u g表位肽/PBS)，十四天后進(jìn)行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天，得到效應(yīng) 細(xì)胞CTL，然后進(jìn)行LDH試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒活性。LDH 檢測(cè)使用 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (細(xì)胞毒性 檢測(cè)試劑盒，Promega公司)進(jìn)行LDH試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒活性。步驟如下(詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明 書(shū))1)設(shè)立檢測(cè)板(100 Pi/孔)(1)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組以腫瘤細(xì)胞MCF_7(ATCC公司)作為靶細(xì)胞(最優(yōu)靶細(xì)胞數(shù) 5000)按不同效靶比10 1,20 1,40 1加入上述效應(yīng)細(xì)胞CTL(2)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組(3)設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組(4)設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組(5)設(shè)立體積校正對(duì)照組(6)設(shè)立背景對(duì)照組2)細(xì)胞裂解及收獲上清(1)37°C>5% C02 孵育檢測(cè)板(5h)(2)靶細(xì)胞最大釋放組和體積校正對(duì)照組中加入裂解液，每100 iU培養(yǎng)基中加入 10 u 1裂解液(10 X)，收獲上清前45min加入裂解液(3) 250g離心4min，收獲上清3) LDH 檢測(cè)(1)轉(zhuǎn)移50 ill上清至另一孔板(2) 50 u 1/孔迅速添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30min(3)添加50 ill終止溶液(4)將孔中含有的氣泡去除，一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)490nm吸收值0D。細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式如下(% ) = [(0D實(shí)驗(yàn)組H3D效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組—ODm細(xì)胞自發(fā)釋放組)/(0Dm細(xì)胞最大釋放組—ODm細(xì) 胞自發(fā)釋放組)]x 100%(注所有實(shí)驗(yàn)組、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組的吸收值均應(yīng)減去背 景平均吸收值；靶細(xì)胞最大釋放組吸收值應(yīng)減去體積校正對(duì)照組的平均吸收值)結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5可知，四條表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7均顯示 出一定的殺傷率。由此，可知PLAC1抗腫瘤CTL表位肽能夠用于制備腫瘤治療性多肽疫苗。4.轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)試驗(yàn)4.1CTL 體內(nèi)誘導(dǎo)
免疫方案隨機(jī)選取8 12周齡HLA-A2. Ι/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠(第二軍醫(yī)大曹雪濤教 授惠贈(zèng))，雌雄隨機(jī)，每組4只小鼠。將IOOyg表位肽、140 μ g Th表位肽(I-Ab乙肝病毒核 心抗原來(lái)源的Th細(xì)胞表位，TPPAYRPPNAPIL)、50 μ 1弗氏不完全佐劑(IFA，sigma公司)和 50 μ 1 ΡΗ7. 2的PBS混合乳化獲得的免疫制劑于小鼠尾根部皮下注射，劑量為100 μ 1/只， 分別于第1天、第6天、第11天進(jìn)行注射，共注射3次，第12天取小鼠脾臟細(xì)胞。設(shè)置PBS 組(即不加入表位肽和Th表位肽)和PBS+Th組(即不加入表位肽)做陰性對(duì)照。4. 2 效應(yīng) CTL 制備
(1)將上述注射三次的小鼠于第12天脫頸致死，酒精浸泡2 3min消毒后，于超 凈臺(tái)中無(wú)菌取出小鼠脾臟；(2)200目鋼網(wǎng)研磨，PBS (PH7. 2)沖洗，得脾細(xì)胞懸液；(3)800rpm 離心，棄上清；(4)加入5ml紅細(xì)胞裂解液(北京鼎國(guó)公司)，重懸細(xì)胞，4°C孵育5min ；(5) 800rpm 離心，收集細(xì)胞，PBS (PH7. 2)洗滌 3 次；(6)細(xì)胞重懸于IOml含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基 (Gibico公司)中得細(xì)胞懸液，然后將其于6孔板中培養(yǎng)，每孔5ml ；(7)次日每孔加入 250U Recombinant mouse IL-2 (PR0SPEC 公司)，50μ g表位肽；(8)體外培養(yǎng)6天后收獲效應(yīng)細(xì)胞CTL，進(jìn)行LDH檢測(cè)(方法同上，其中實(shí)驗(yàn)組是 以腫瘤細(xì)胞MCF-7作為靶細(xì)胞，按不同效靶比20 1,40 1,80 1加入上述效應(yīng)細(xì)胞 CTL)。結(jié)果見(jiàn)圖6，由圖6可知，四條表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7均顯示 出一定的殺傷率。由此，進(jìn)一步證明PLACl抗腫瘤CTL表位肽能夠用于制備腫瘤治療性多 肽疫苗。
權(quán)利要求
PLAC1抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于，所述抗腫瘤CTL表位肽為九肽，其序列為a-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-b或c-d-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val；其中，a為Val或Tyr，b為Met或Val；c為Ser或Tyr，d為Ile或Leu。
2.如權(quán)利要求1所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽，其中a為Val，b為Met，序列為Val_L eu—Cys—Ser—Ile—Asp-Trp-Phe—Met。
3.如權(quán)利要求1所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽，其中a為Tyr，b為Val，序列為Tyr_L eu—Cys—Ser—Ile-Asp-Trp-Phe—Val。
4.如權(quán)利要求1所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽，其中c為Ser，d為lie，序列為Ser_I le-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val。
5.如權(quán)利要求1所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽，其中c為Tyr，d為L(zhǎng)eu，序列為Tyr_L eu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val。
6.權(quán)利要求1至5任一所述PLAC1抗腫瘤CTL表位肽的制備方法，其特征在于，采用固 相合成法制備CTL表位肽。
7.權(quán)利要求1至5任一所述的PLAC1抗腫瘤CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PLAC1來(lái)源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其序列為a-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-b或c-d-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val(a為Val或Tyr，b為Met或Val；c為Ser或Tyr，d為Ile或Leu)。表位肽P28序列為Val-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met；抗腫瘤CTL表位肽P28-1Y9V序列為Tyr-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Val；抗腫瘤CTL表位肽P31序列為Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val；抗腫瘤CTL表位肽P31-1Y2L的序列為Tyr-Leu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val。本發(fā)明所述抗腫瘤CTL表位肽在體外和體內(nèi)所誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7均顯示出一定的殺傷率，可用于制備腫瘤治療性多肽疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101870724SQ20101020568
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者劉偉, 呂虹, 吳亞紅, 吳宗胤, 李璐, 祁元明, 高艷鋒 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)