專利名稱：人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人源化抗人血管性血友病因子(von ffillebrand Factor, vffF)Al 區(qū)的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓栓塞所引起或并發(fā)的病變，是最常見的死亡病因之一。隨著社會的發(fā)展和人 口老齡化的進(jìn)程，以及飲食及生活方式改變等因素的影響，血栓栓塞性疾病的發(fā)病率逐年 增加，給社會，家庭及個人帶來了巨大的損失和痛苦。在心腦血管疾病中，血栓性疾病位居 發(fā)病率、致殘率和死亡率之首，抗血栓藥物也因此而成為目前心腦血管藥物市場增長最快 的一類藥物。治療血栓性疾病的抗血栓藥物主要分為抗血小板、抗凝血酶和溶血栓藥物三大 類。如以華法林(Warfarin)為代表的肝素類產(chǎn)品干擾凝血因子，阻止血液凝固。組織型纖 溶酶原激活物(t-PA)、鏈激酶(SK)和尿激酶(UK)等溶栓藥可激活纖溶酶，分解纖維蛋白而 使血栓溶解?？寡“逅幘哂幸种蒲“宓恼掣?、活化和聚集的功能，從而阻礙血栓形成。 盡管在抗血栓藥物市場上，目前已有足夠的治療藥物，但它們都各自存在著較大的缺點(diǎn)。例 如，氯吡格雷治療效力較低，服用華法林需要掌握嚴(yán)格的劑量以保證安全，溶栓藥物常引起 出血以及使用后栓塞的再形成。現(xiàn)有抗血栓藥物的這些缺陷，使得新一代抗血栓藥物的研 究和開發(fā)顯得很有必要。正常情況下，體內(nèi)止血、凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)處于生理性平衡，保持正常血流狀 態(tài)。但在一些病理情況下，如血管內(nèi)膜損傷或靜脈血流阻滯時，血液便可在心血管腔內(nèi)凝 固，形成血栓。研究表明，血小板粘附到血管壁是血栓形成的第一步。膠原蛋白I型、III 型、血管性血友病因子(von ffillebrand factor，簡稱vWF)，血小板受體糖蛋白GPIb是血 小板和血管壁粘附的主要分子，其中vWF通過結(jié)合血小板表面的GPIb和血管表面的膠原蛋 白來介導(dǎo)血小板對血管壁的粘附。動物實驗結(jié)果顯示，vWF或者GPIb的拮抗劑，無論是抗 體，多肽，還是蛇毒蛋白，即能有效的阻止血小板對血管壁的粘附，進(jìn)而抑制血栓的形成，又 能有效克服現(xiàn)有抗血栓藥物存在的出血、血小板減少等副作用。因此，啟動血小板-血管壁 粘附的功能蛋白vWF和GPIb被認(rèn)為是研發(fā)新一代抗血栓藥物的理想靶標(biāo)。vWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，其單體分子量為250KD左右，但一般以超過1000KD 的聚合體形式存在，主要分布于血漿、基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板a顆粒內(nèi)。vWF有六個重 要的結(jié)構(gòu)域，分別與VIII因子、血小板膜糖蛋白lb (GP Ib)、GP Ilb/IIIa、肝素、膠原及其 它基質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮重要的生理作用。血管受損后，血漿中的vWF通過其A3區(qū)結(jié)合內(nèi) 皮下暴露的膠原，通過A1區(qū)與GP lb結(jié)合，介導(dǎo)血小板粘附于血管受損部位，最終導(dǎo)致血小 板活化、聚集，及血栓的形成。用vWF作為分子靶標(biāo)的抗血栓藥物，由于抑制血栓形成的第 一步，從理論上推測，其抗血栓效果要比現(xiàn)有藥物更強(qiáng)。早在1991年，日本奈良醫(yī)科大學(xué)的 Fuj imura等制備的鼠單克隆抗體NMC-4，識別vWF的A1區(qū)，在10ug/mL的濃度下可以完全抑 制瑞斯托霉素(ristocetin)或博托霉素(botrocetin)誘導(dǎo)的vWF和血小板的結(jié)合。1997年日本橫濱中央研究室和Ajinomoto公司獲得針對vWF因子A1段的鼠單克隆抗體AJvW-2， 以100mg/kg和300mg/kg的劑量注射豚鼠，可以有效抑制血栓形成且不導(dǎo)致出血時間的延 長。在高剪切力情況下，NMC-4和AJvW-2可以有效抑制血栓的生成以及原始血栓的繼續(xù)生 長，表明vWF的抗體藥物尤其適用于治療動脈血栓而不引起過量出血。傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體直接用于疾病治療的效果并不理想，其主要 原因在于鼠源抗體的免疫原性引起人體產(chǎn)生使其失效的中和抗體。解決這一問題的關(guān)鍵技 術(shù)之一抗體人源化技術(shù)即是在不改變鼠抗體的抗原特異性條件下，改變其分子組成使得含 有更多的人類抗體氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有免疫原性低、抗血栓能力強(qiáng)而又不引起過量出血 的單克隆抗體，以用作預(yù)防和治療血栓性疾病特別是動脈血栓疾病的人源化抗人血管性血 友病因子單克隆抗體。為達(dá)到此目的，本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案是利用基因工程技術(shù)對沒有專利保護(hù) 的鼠源抗體NMC-4進(jìn)行改造，在維持其抗原特異性的基礎(chǔ)上，使其主要氨基酸組成來自人 類抗體，從而降低其免疫原性，成為理想的臨床藥物。實現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下一種人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，包括有鼠抗體NMC-4的重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)含有的⑶Rl(互補(bǔ)決定簇或高可變 區(qū)-complementarity determinative region, CDR)、CDR2 禾口 CDR3 的氛基酸序列依次如序 列號1、2和3所示；重鏈可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸序列與人抗體胚系基因位點(diǎn)VH 4-59編碼 的框架區(qū)相同；鼠抗體NMC-4的輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)含有⑶R1、⑶R2和⑶R3、或含有⑶R2 和⑶R3、或含有⑶R3，且⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列依次如序列號4、5和6所示；輕 鏈可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸序列與人抗體胚系基因位點(diǎn)VL 08編碼的框架區(qū)相同，或輕鏈可 變區(qū)的框架區(qū)氨基酸序列與人抗體胚系基因位點(diǎn)VL 08編碼的框架區(qū)相同，且其中第4節(jié) 框架區(qū)的氨基酸由Phe Gly Gli Gly突變?yōu)镻he Gly Gin Gly(FGGG突變?yōu)镕GQG)。進(jìn)一步地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列號7所示。編碼所述重鏈可變區(qū) 的氨基酸序列的DNA如序列號9所示。優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列號8所示，即其包含有如序列號4、5 和6所示的⑶R1、⑶R2和⑶R3。編碼所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的DNA如序列號10所示o本發(fā)明的另一目的是提供上述人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體的應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下上述的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體在制備預(yù)防和治療人類血栓性 疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述人類血栓性疾病為動脈血栓類疾病。本發(fā)明對沒有專利保護(hù)的鼠源抗體NMC-4進(jìn)行人源化改造，制造出具有vWF結(jié)合 能力，抑制血栓形成，免疫原性低的一種新型人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，編 碼該抗體或抗體片段的基因可以在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)，包括但不限于哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段能夠阻斷vWF和GP Iba的相互作用，從而抑制血 小板的粘附和聚集，因此可用于制備預(yù)防和治療多種血栓類疾病的藥物，為預(yù)防和治療人 類血栓性疾病特別是動脈血栓提供了一種可能。


圖1顯示人源化vWF抗體重鏈和含有一個或多個鼠源抗體輕鏈⑶R的人源化輕鏈 組成的全抗在不同濃度下抑制血小板聚集的情況；圖2顯示嵌合抗體及人源化抗體對人血小板聚集的抑制作用；圖3顯示人源化抗體對猴血小板聚集的抑制作用。
具體實施例方式本發(fā)明建立了一種新的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，具體構(gòu)建步驟 如下(1)根據(jù)鼠源抗體 NMC-4(Fujumura 等，Blood. 77 =113-20,1991)重鏈和輕鏈可變 區(qū)的氨基酸序列確定其對應(yīng)的框架區(qū)(FW)和高可變區(qū)(CDRs)；(2)利用鼠源抗體框架序列作為模板尋找同源的人胚系抗體可變區(qū)。根據(jù)高可變 區(qū)的長短，框架上特定位置的氨基酸性質(zhì)，選擇人胚系抗體框架；(3)移植鼠源抗體高可變區(qū)到所選人胚系抗體框架形成雜合抗體可變區(qū)，并與鼠 源抗體可變區(qū)比較，決定人胚系抗體框架區(qū)可能需要返回突變的氨基酸；(4)根據(jù)鼠源抗體與vWF Al區(qū)結(jié)合的表位及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(Celikel等，Nat StructBiol. 5 189-94，1998)，確定其可變區(qū)氨基酸對結(jié)合抗原的貢獻(xiàn)，在不影響抗原結(jié)合 能力及特異性的前提下，盡量用人胚系抗體可變區(qū)氨基酸取代鼠抗體可變區(qū)氨基酸；(5)應(yīng)用化學(xué)合成、PCR、點(diǎn)突變等方法制備編碼人源化抗體可變區(qū)及其變異體的 基因序列，連接人抗體IgGl或IgG4恒定區(qū)，并通過合適的載體在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)；(6)應(yīng)用vWF結(jié)合實驗、血小板聚集實驗等來確定人源化抗體的生物學(xué)功能。通過鼠源抗體和人胚系抗體氨基酸序列的同源分析，并考慮高可變區(qū)長度的一致 性，選擇重鏈4-59基因位點(diǎn)作為人源化的框架，其同源性程度達(dá)70 %。采用同樣的分析， 選擇輕鏈08基因位點(diǎn)作為人源化的框架，其同源性程度達(dá)83%。為了獲得人源化vWF抗 體，所有鼠源抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)的CDR分別取代人胚系抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)相對 應(yīng)的⑶R。編碼人源化抗體重鏈的DNA序列是由4-59框架區(qū)和鼠源抗體重鏈可變區(qū)⑶R的 DNA序列組合而成。與之相同，編碼人源化抗體輕鏈的DNA序列是由08框架區(qū)和鼠源抗體 輕鏈可變區(qū)CDR的DNA序列組合而成。人源化抗體重、輕鏈可變區(qū)基因通過化學(xué)合成法獲 得，其⑶R的取代及某些氨基酸的改變則通過PCR來實現(xiàn)。人源化抗體重、輕鏈可變區(qū)基因分別克隆到重鏈恒定區(qū)及輕鏈恒定區(qū)表達(dá)載體 上，通過人源化抗體重、輕鏈共轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞進(jìn)行分泌表達(dá)。用蛋白A親和層析柱純化后 的全抗體通過比濁法測定其抗人血小板聚集能力的強(qiáng)弱。與嵌合抗體比較，人源化抗體活 性弱的則需要進(jìn)行返回突變，即所選擇的4-59或08框架區(qū)中影響CDR和vWF Al結(jié)合的氨 基酸要再突變?yōu)樵笤纯贵w框架區(qū)相對應(yīng)的氨基酸。人血小板聚集實驗的篩選結(jié)果表明(圖1)，CDR移植后的人源化抗體具有與鼠源抗體相近的抑制血小板聚集的活性，無需進(jìn)行返回突變。除此之外，含鼠源抗體輕鏈CDR3， CDR2和CDR3的人源化抗體也具有很好的抗血小板聚集活性，不含有輕鏈CDR3的抗體其抑 制血小板聚集的能力則大大減弱，這和輕鏈CDR3直接參與vWF Al結(jié)合的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相 吻合。用富含人或恒河猴血小板的血漿所做的聚集實驗結(jié)果顯示(圖2和3)，人源化抗 體(VH-VL7)具有與鼠源抗體相近的抑制血小板聚集的活性。本發(fā)明基于vWF和血小板受體GP Ib的結(jié)合是血栓形成的起始步驟，抑制其結(jié)合 將有效阻斷血栓的形成，由此產(chǎn)生的藥物能夠起到預(yù)防和治療的雙重作用，優(yōu)越于目前市 場上主要針對血栓形成后抗栓或溶栓的治療藥物。本發(fā)明利用晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果輔助抗體人源化設(shè)計，得到人源化程度高的抗體， 為快速和準(zhǔn)確的實施抗體人源化提供了 一個成功的例證。實施例1 鼠抗體可變區(qū)與vWF Al區(qū)結(jié)合的結(jié)構(gòu)分析PDB數(shù)據(jù)庫中的vWF Al和NMC_4Fab復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)表明Al區(qū)的第四個α螺旋 是結(jié)合抗體的主要部位，其中632和636位的精氨酸起到重要的作用。抗體重鏈可變區(qū)的 ⑶R2和⑶R3以及輕鏈可變區(qū)的⑶R3主要參與和Al的結(jié)合，因此在人源化的過程中保留重 鏈的三個CDR不變，而輕鏈的CDR則有很大程度的取舍，以求更高程度的人源化。實施例2 鼠源vWF抗體的人源化改造(1)通過比較NMC-4與人胚系抗體家族可變區(qū)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其重鏈可變區(qū) 的框架區(qū)與人胚系抗體基因4-59編碼的氨基酸序列有很高的同源性，且CDR的長度也相 同，推測它們的可變區(qū)具有相似的空間結(jié)構(gòu)，故選擇人胚系抗體基因4-59的框架區(qū)作為人 源化抗體重鏈的框架區(qū)。用同樣的方法，發(fā)現(xiàn)其輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)與人胚系抗體基因08 編碼的氨基酸序列接近，故選擇人胚系抗體基因08的框架區(qū)作為人源化抗體輕鏈的框架 區(qū)。(2)將鼠源抗體重鏈可變區(qū)的所有⑶R移植到4-59框架上，產(chǎn)生人源化的重鏈可 變區(qū)。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:7所示，重鏈可變區(qū)含有的⑶R1、⑶R2和 CDR3的氨基酸序列分別如:SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。重鏈可變區(qū)(SEQID NO 7)Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu ThrCys Thr ValSer Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asp (CDRl)Trp lie Arg Gln ProPro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn SerAla Leu Lys Ser(CDR2)Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Ala AspTyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr(CDR3)Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer Ser0該氨基酸序列可由SEQ ID NO :9所示DNA編碼。將輕鏈可變區(qū)的⑶R3或⑶R2和⑶R3或⑶R1，⑶R2和⑶R3移植到08框架上， 產(chǎn)生人源化程度不同的輕鏈可變區(qū)，分別為VL2，VL4及VL7。盡管VLl (08)框架區(qū)3的73 位是苯丙氨酸，但大多數(shù)人胚系抗體輕鏈可變區(qū)框架區(qū)3的73位卻是亮氨酸，因此，我們在 VL4和VL7中把73位改變?yōu)榱涟彼?。同理，框架區(qū)4的第三位甘氨酸在VL7中改變?yōu)楣入?酰胺。框架區(qū)4的谷氨酸-纈氨酸改為天冬氨酸_異亮氨酸是為了在該位置安插合適的克隆位點(diǎn)，以連接輕鏈恒定區(qū)。我們的實驗已經(jīng)證明，該改變對輕鏈的生物學(xué)功能沒有影響。人源化的輕鏈序列如下 其中，VL7的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 8)Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr IleThr Cys Ser Ala Ser Gln Asp lie Asn Lys Tyr Leu Asp (CDRl)Trp Tyr Gln Gln Lys ProGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser(CDR2) Gly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln ProGlu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Lys Leu Pro Trp The (CDR3)Phe GlyGln Gly Thr Lys Val Asp lie Lys。該氨基酸序列由 SEQ ID N0:10 所 示的DNA所編碼。(3)所述人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體的恒定區(qū)來自人IgGl 或者IgG4。用常規(guī)的分子克隆方法將人源化的抗體重鏈可變區(qū)連接到人IgGl的恒定區(qū)形成 全長的重鏈基因，人源化的抗體輕鏈可變區(qū)連接到人κ鏈恒定區(qū)形成全長的輕鏈基因。用 共轉(zhuǎn)染的方法將攜帶重鏈和輕鏈基因的載體導(dǎo)入293F中，分泌表達(dá)全人源化抗體。所用的 IgGl攜帶L235E、E318A、K320A和K322A突變，其抗體依賴的細(xì)胞毒作用和激活補(bǔ)體的作用 大大減弱。這些點(diǎn)突變是用含有點(diǎn)突變的引物通過重疊PCR來實現(xiàn)的。所用的表達(dá)載體由 pCI-neo (美國Promega公司產(chǎn)品)改建而成，其分泌蛋白信號肽序列來自人的kappa輕鏈。實施例3 人源化抗體的表達(dá)與抗體活性檢測(1)抗體的表達(dá)與純化將293F細(xì)胞接種到293SFMII培養(yǎng)基(GIBCO)中，在含8 % CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn) 行傳代懸浮培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)密度達(dá)到10E6/ml時，可進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。將人源化抗體質(zhì)粒用 OPTI-MEMI (GIBCO)稀釋，用同樣的培養(yǎng)基將PEI (P0LYSCIENCE)稀釋，質(zhì)粒與PEI以1 2 的質(zhì)量比混合放置5分鐘后滴加到懸浮細(xì)胞中，培養(yǎng)3-5天后收集細(xì)胞上清，濃縮處理后用 protein A親和層析柱純化。(2)血小板聚集實驗將血小板凍干粉(Biopool)溶于TBS中，以每孔60ul分裝至96孔板中。用PBS稀釋VWF(CaIbiochem)至10ug/ml，以每孔IOul分裝至96孔板中。將制備的人源化抗體 (重鏈可變區(qū)為 SEQ ID NO :7，輕鏈可變區(qū)為 VL1(08)、VL2、VL4或VL7，即SEQ ID NO 11-13 和SEQ ID NO :8)稀釋至不同濃度，以每孔20ul加入96孔板中，放置5分鐘。然后加入 IOul (15mg/ml)瑞斯托霉素(ristocetin)至每孔中，動態(tài)法測定在405nm時每孔的吸光值， 并根據(jù)吸光值的變化曲線計算抗體的活性。血小板溶于TBS中有一定的渾濁度，吸光值較 高，血小板聚集時，溶液變得澄清，吸光值變小，因此用比濁法可以初步測定抗體抗血小板 聚集活性的大小。參見圖1。從VLl (08)和VL2的比較可以看出輕鏈的CDR3在抑制血小板 聚集中起到重要作用，含有全部輕鏈CDR的抗體VL7，其抑制能力最強(qiáng)，而含有CDR2和CDR3 的VL4，與僅含有⑶R3的VL2，具有相近的抗血小板聚集活性，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)輕鏈⑶R3與vWF 結(jié)合的主導(dǎo)作用。(3)人血PRP (富含血小板血漿)的血小板聚集實驗取正常人血30ml，檸檬酸鈉抗凝管(BD，363095)分裝，850rpm離心10分鐘分離出 PRP,再3000rpm離心10分鐘分離出PPP (不含血小板血漿)。用chrono_log 560雙通道血 小板聚集儀測定，PPP調(diào)零，取460ul PRP至反應(yīng)器皿中，加入20ul抗體(該抗體的重鏈可 變區(qū)為SEQ ID NO :7，輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :8)，37°C溫浴5分鐘，加入磁力攪拌子，放入 血小板聚集儀中，調(diào)零后加入20ul ristocetin反應(yīng)至結(jié)果穩(wěn)定。參見圖2。人源化抗體具 有與嵌合抗體相當(dāng)?shù)幕钚浴?4)猴PRP (富含血小板血漿)的血小板聚集實驗取正常猴血10ml，檸檬酸鈉抗凝管(BD，363095)分裝，1200rpm離心10分鐘分離 出PRP，再3000rpm離心10分鐘分離出PPP (不含血小板血漿)。用chrono-log 560雙通 道血小板聚集儀測定，PPP調(diào)零，取460ul PRP至反應(yīng)器皿中，加入20ul抗體(該抗體的重 鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :7，輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :8)37°C溫浴5分鐘，加入磁力攪拌子， 放入血小板聚集儀中，調(diào)零后加入20ul ristocetin反應(yīng)至結(jié)果穩(wěn)定。參見圖3。人vWF和 恒河猴vWF高度同源，其Al區(qū)有97%的氨基酸相同，與鼠源抗體相結(jié)合的片段含有完全相 同的氨基酸。以上是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發(fā)明的 專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范 圍中。
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權(quán)利要求
一種人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，其特征是，包括有鼠抗體NMC 4的重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)含有的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列號1、2和3所示；重鏈可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸序列與人抗體胚系基因位點(diǎn)VH4 59編碼的框架區(qū)相同；鼠抗體NMC 4的輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)含有CDR1、CDR2和CDR3、或含有CDR2和CDR3、或含有CDR3，且CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列號4、5和6所示；輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸序列與人抗體胚系基因位點(diǎn)VL O8編碼的框架區(qū)相同，或輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)氨基酸序列與人抗體胚系基因位點(diǎn)VL O8編碼的框架區(qū)相同，且其中第4節(jié)框架區(qū)的氨基酸由Phe Gly Gly Gly突變?yōu)镻he Gly Gln Gly。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，其特征是，所述 重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列號7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，其特征是，編碼 所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的DNA如序列號9所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，其特征 是，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列號8所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體，其特征是，編碼 所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的DNA如序列號10所示。
6.權(quán)利要求1-5所述的人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體在制備預(yù)防和治療 人類血栓性疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是，所述人類血栓性疾病為動脈血栓類疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人源化抗人血管性血友病因子單克隆抗體及其應(yīng)用，所述抗體其包括有鼠抗體NMC-4的重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)含有的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列號1、2和3所示；鼠抗體NMC-4的輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)含有CDR1、CDR2和CDR3、或含有CDR2和CDR3、或含有CDR3，且CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列號4、5和6所示。所述的單克隆抗體具有vWF結(jié)合能力，抑制血栓形成，免疫原性低等特點(diǎn)，可用于制備預(yù)防和治療多種血栓類疾病的藥物，為預(yù)防和治療人類血栓性疾病特別是動脈血栓提供了一種可能。
文檔編號A61P7/02GK101891820SQ20101020652
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者吳朝霞, 陳昌友 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院