專利名稱：鴉膽子油乳注射液在抗癌方面的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鴉膽子油乳注射液在抗癌方面的新用途，具體地說是涉及其在抗血液 系統(tǒng)腫瘤，泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤尤其是抗人白血病方面的用途。
背景技術(shù)：
鴉膽子油來源于苦木科常綠灌木或小喬木鴉膽子Brucea javanicaOjMerr的 成熟果實鴉膽子Fructus Bruceae，其抗癌有效成分為鴉膽子油的脂肪酸，其中油酸占 92. 1%。早在50年代，就有報道表明鴉膽子油對外耳道乳頭狀瘤及喉乳頭狀瘤有一定療 效，70年代又發(fā)現(xiàn)鴉膽子水針劑及鴉膽子油靜脈乳對宮頸癌，消化道癌有良好療效。目前臨 床上主要使用的為鴉膽子油乳注射液，主要用于治療肺癌，肺癌腦轉(zhuǎn)移以及消化道癌癥。惡性腫瘤是一種常見病，嚴(yán)重威脅著人類的生存質(zhì)量，被稱為人類健康的第一殺 手。白血病是一類常見的造血系統(tǒng)惡性疾病。其特點為白細(xì)胞及其前身幼稚細(xì)胞在骨髓或 其他造血組織中彌漫性的異常增生，進(jìn)而浸潤人體組織器官，產(chǎn)生各種癥狀。前列腺癌是男 性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病隨年齡而增長。前列腺癌具有易轉(zhuǎn)移的特點，極易轉(zhuǎn)移 至骨，腦以及直腸等器官，惡性程度較高，極大的影響了患者的生存質(zhì)量。細(xì)胞凋亡是在某些生理或病理條件下，細(xì)胞接受到某種信號所觸發(fā)的并按一定程 序緩慢死亡的過程。借此機(jī)體讓不需要的細(xì)胞消亡，維持組織器官細(xì)胞數(shù)目恒定以維持生 長的平衡。同時，對控制細(xì)胞增殖、防止腫瘤的發(fā)生與生長有重要意義。惡性腫瘤發(fā)生的重 要原因之一是細(xì)胞凋亡異常。目前，以選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目標(biāo)的凋亡干預(yù)技術(shù) 可能成為治療惡性腫瘤的基本策略。許多細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)分子被用來作為抗腫瘤藥物篩選及 腫瘤基因治療的靶點。目前未見報道將鴉膽子油乳注射液用于抗血液系統(tǒng)腫瘤、泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤和人 白血病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鴉膽子油乳注射液在抗腫瘤方面的新用途。本發(fā)明提供了鴉膽子油乳注射液在抗血液系統(tǒng)腫瘤方面的新用途。1)鴉膽子油乳注射液能劑量依賴性的抑制人白血病U937的成活率。2)鴉膽子油乳注射液劑量依賴性的誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生凋亡，說明鴉膽子油乳注 射液具有抗白血病的潛力。3)鴉膽子油乳注射液劑量依賴性的抑制人白血病NB4的成活率。4)鴉膽子油乳注射液能劑量依賴性的抑制人白血病HL-60的成活率。5)鴉膽子油乳注射液能劑量依賴性的誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，說明鴉膽子油乳 注射液具有抗白血病的潛力。6)鴉膽子油乳注射液能劑量依賴性的誘導(dǎo)從白血病患者血液中分離的白血病細(xì) 胞發(fā)生凋亡，說明鴉膽子油乳劑具有臨床應(yīng)用于治療白血病的潛力。
7)鴉膽子油乳注射液對從健康志愿者血液中分離的正常外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞 毒作用較低，說明鴉膽子油乳劑可能對白血病患者的毒副作用較低，具有臨床應(yīng)用于治療 白血病的潛力。8)鴉膽子油乳注射液對人癌異種移植瘤(U937腫瘤模型)具有明顯的抑制作用， 進(jìn)一步說明了鴉膽子油乳注射液具有抗白血病的潛力。本發(fā)明還提供了鴉膽子油乳注射液在抗泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤方面的新用途。


圖1為鴉膽子油乳注射液對人白血病細(xì)胞系和人前列腺癌細(xì)胞系成活率的影響結(jié)果以Mean士SEM表示。< 0. 001加藥組與空白組進(jìn)行比較)其中A為鴉膽子油乳注射液對三種人白血病細(xì)胞系成活率的影響；B為鴉膽子油乳注射液對人前列腺癌細(xì)胞Dul45成活率的影響。圖2為鴉膽子油乳注射液對人白血病細(xì)胞U937細(xì)胞周期的影響圖3為鴉膽子油乳注射液對人白血病細(xì)胞株U937凋亡相關(guān)蛋白影響圖4為鴉膽子油乳注射液對正常人外周血淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞U937成活率的 影響結(jié)果以Mean士SEM表示。< 0. 001加藥組與空白組進(jìn)行比較)圖5為鴉膽子油乳注射液對正常人外周血淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞周 期的影響圖6為鴉膽子油乳注射液對正常人外周血淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞系U937線粒體 膜電位的影響圖7為鴉膽子油乳注射液對人癌異種移植模型瘤重和瘤體積的影響< 0. 001加藥組與空白組進(jìn)行比較)
具體實施例方式試驗例1鴉膽子油乳注射液處方及制備工藝1.1執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十四冊WS3-B-2739_97藥典業(yè)發(fā)(1999)第254號1. 2 處方精制鴉膽子油10000ml精制豆磷脂1500g甘油2500ml加注射用水至100000ml_制成10000 支1.3制備工藝取處方量的精制豆磷脂與溫?zé)岬母视团c適量注射用水混合，轉(zhuǎn)入到高速組織搗碎
4機(jī)內(nèi)(8000轉(zhuǎn)/分)，分散二次，第一次5分鐘，第二次2分鐘，使其分散均勻，加入溫?zé)岬镍f 膽子油，攪拌3次，每次2分鐘，使成初乳劑，加入注射用水至10000ml，再轉(zhuǎn)入到高壓乳勻機(jī) 內(nèi)(40MPa)勻化三次，濾過，取濾液，灌封，滅菌，即得鴉膽子油乳注射液。試驗例2以人源性白血病HL-60，NB4及U937細(xì)胞株，人源性前列腺癌Dul45細(xì)胞 株為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射液對這些細(xì)胞的抑制作用實驗1 材料人源性白血病HL-60、NB4及U937細(xì)胞株，人源性前列腺癌Dul45細(xì)胞株由ATCC 提供。RMPI 1640干粉購自Invitrogen/Gibco。胎牛血清購自TBD公司。胰酶購自北 京華美生科生物技術(shù)有限公司。四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)購自購自北京華美生科生物技 術(shù)有限公司。2 方法將由ATCC提供的人源性白血病HL-60、NB4及U937細(xì)胞株、人源性前列腺癌 Du-145細(xì)胞株用胰酶消化后，懸浮于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，輕輕吹打成細(xì)胞懸液， 顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞。將腫瘤細(xì)胞接種于無菌的96孔培養(yǎng)板，每孔加腫瘤細(xì) 胞懸液100 μ 1。將細(xì)胞置于37°C、體積百分比為5%的CO2培養(yǎng)箱中貼壁過夜后，棄去上清 液，然后加入不同濃度的鴉膽子油乳注射液藥物分別作用一定時間后，轉(zhuǎn)移上清液，在每孔 中加入0. 5mg/ml四唑鹽(MTT)的無血清培養(yǎng)液100 μ 1，37°C、體積百分比為5%的CO2培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去上清液，每孔加入100 μ 1 DMS0，測定各孔吸光度，然后按下式 計算平均抑制率。結(jié)果采用Mean士SEM表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用ANOVA對組間均數(shù)比較進(jìn)行方 差齊性分析，并運用Durmett，s t_test進(jìn)行組間比較。計算公式(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值XlOO3 結(jié)果結(jié)果如表1所示，鴉膽子油乳注射液對人源性白血病HL_60，U937細(xì)胞株和人源性 前列腺癌Du-145細(xì)胞株具有抑制作用，并隨劑量的遞增而提高。鴉膽子油乳注射液作用白 血病HL-60及U937細(xì)胞6小時后，其IC50分別為312. 7，271. 5，265. 4 μ g/ml。鴉膽子油乳 注射液作用前列腺癌Dul45細(xì)胞48和72小時后，其IC50分別為455. 96和334. 00 μ g/ml。此結(jié)果表明，鴉膽子油乳注射液具有抗血液系統(tǒng)腫瘤以及泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的潛 力。試驗例3以人源性白血病U937細(xì)胞株為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射液對于U937 細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響實驗1 材料碘化吡啶(PI)染料購自Sigma公司。Rnases A 購自Sigma公司。流式細(xì)胞儀 Becton Dickinson 公司。2 方法將處于對數(shù)生長期的白血病U937細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1 1. 5 X 105cellS/ml，加 入一定濃度的藥物后，于培養(yǎng)中孵育6小時。然后從培養(yǎng)箱中取出，IOOOrpm離心沉淀細(xì)胞， 并用PBS洗滌1次。然后使用70%的酒精于-20度冰箱內(nèi)固定過夜。待檢測時，離心收集 細(xì)胞，PBS洗滌一邊后，加入20mg/ml的RnaseA 37°C孵育45min，然后加入lmg/ml的PI燃 料，4°C孵育10分鐘后，即可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
3 結(jié)果結(jié)果如圖2所示，鴉膽子油乳注射液(125μ g/ml,250y g/ml和500 μ g/ml)均可 使U937細(xì)胞株的亞凋亡峰增加，并具有劑量依賴性。細(xì)胞的亞凋亡峰為凋亡發(fā)生時的重要 特征之一，可部分證明鴉膽子油乳注射液可誘導(dǎo)U937細(xì)胞發(fā)生凋亡。試驗例4以人源白血病U937細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射液對凋亡蛋白的 影響實驗1 材料PARP,procapase-3,procaspase-8,procaspase-9 抗體均購自 CellSignaling 公 司。ECL:購自Thermo Scientific公司。山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗均購自寶信生 物科技有限公司。2 方法Western blot方法。選擇依托泊苷注射液為陽性藥。鴉膽子油乳注射液作用6小 時后，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行實驗。3 結(jié)果結(jié)果如圖3所示Caspase-3，Caspase-9以及Caspase-8均為凋亡通路上的重要 執(zhí)行蛋白，鴉膽子油乳注射液作用后，均能使他們發(fā)生活化。而PARP，作為Casapse-3的作 用底物，當(dāng)Capsase-3被活化時，能夠啟動凋亡并使PARP發(fā)生裂解。結(jié)果表明，鴉膽子油乳 注射液能夠使PARP發(fā)生裂解，從而進(jìn)一步證明了凋亡的發(fā)生。試驗例5以從白血病患者體內(nèi)分離的白血病細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射 液對分離的白血病細(xì)胞細(xì)胞周期的影響試驗1 材料淋巴分離液購自天津TBD公司2 方法取新診斷的白血病患者的外周血5ml，將其分成兩等份。與等量PBS混合后，逐滴 加入到2. 5ml的淋巴分離液中。然后2500rpm離心15分鐘后，吸取位于淋巴分離液與血清 中的淋巴細(xì)胞層。用PBS洗滌后，培養(yǎng)于RMPI 1640培養(yǎng)液中，胎牛血清10%。然后加入指 定濃度的鴉膽子油乳注射液，6小時后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期的測定。3 結(jié)果表1中為14名白血病患者的臨床指標(biāo)，以及鴉膽子油乳注射液作用后，白血病細(xì) 胞的細(xì)胞周期的變化。實驗結(jié)果表明，鴉膽子油乳注射液可顯著升高14名患者白血病細(xì)胞 的亞凋亡峰。結(jié)果表明，鴉膽子油乳注射液可誘導(dǎo)白血病患者的白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。表1白血病患者的臨床指標(biāo)以及鴉膽子油乳注射液作用后的凋亡百分比
試驗例6以正常外周血淋巴細(xì)胞(PBL)為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射液對正常外 周血淋巴細(xì)胞成活率的影響試驗1 材料淋巴分離液購自天津TBD公司2 方法取健康志愿者的外周血5ml，將其分成兩等份。與等量PBS混合后，逐滴加入到 2. 5ml的淋巴分離液中。然后2500rpm離心15分鐘后，吸取位于淋巴分離液與血清中的淋 巴細(xì)胞層。用PBS洗滌后，培養(yǎng)于RMPI 1640培養(yǎng)液中，胎牛血清10%。然后加入指定濃度 的鴉膽子油乳注射液，6小時后采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞成活率的測定。3 結(jié)果結(jié)果如圖4所示，同樣濃度的鴉膽子油乳注射液作用對正常人外周血淋巴細(xì)胞成 活率的影響要明顯小于白血病細(xì)胞系U937。這表明，鴉膽子油乳注射液對正常人血液系統(tǒng) 的毒副作用較低。
試驗例7以正常外周血淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射液對正常外周血 淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期的影響試驗1 材料PI染料美國Sigma公司。淋巴分離液購自天津TBD公司2 方法取健康志愿者的外周血5ml，將其分成兩等份。與等量PBS混合后，逐滴加入到 2. 5ml的淋巴分離液中。然后2500rpm離心15分鐘后，吸取位于淋巴分離液與血清中的淋 巴細(xì)胞層。用PBS洗滌后，培養(yǎng)于RMPI 1640培養(yǎng)液中，胎牛血清10%。然后加入指定濃度 的鴉膽子油乳注射液，6小時后收集細(xì)胞，并使用70%酒精于-20度冰箱內(nèi)固定過夜。待檢 測時，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌一邊后，加入20mg/ml的RnaseA 37°C孵育45min，然后加入 lmg/ml的PI燃料，4°C孵育10分鐘后，即可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。3 結(jié)果結(jié)果如圖5所示，相同劑量鴉膽子油乳注射液作用后，白血病細(xì)胞系U937的細(xì)胞 周期出現(xiàn)了明顯的亞凋亡峰，而正常人外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期卻幾乎不受影響。這表 明，鴉膽子油乳注射液可能有選擇性作用于腫瘤細(xì)胞的特性，提示鴉膽子油乳注射液可作 為一個高效低毒的抗腫瘤藥物用于治療白血病。試驗例8以正常外周血淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行鴉膽子油乳注射液對正常外周血 淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期的影響試驗1 材料Rh 123染料美國Sigma公司。淋巴分離液購自天津TBD公司2 方法取健康志愿者的外周血5ml，將其分成兩等份。與等量PBS混合后，逐滴加入到 2. 5ml的淋巴分離液中。然后2500rpm離心15分鐘后，吸取位于淋巴分離液與血清中的淋 巴細(xì)胞層。用PBS洗滌后，培養(yǎng)于RMPI 1640培養(yǎng)液中，胎牛血清10%。然后加入指定濃度 的鴉膽子油乳注射液，6小時后收集細(xì)胞，細(xì)胞(IO6個)經(jīng)PBS洗滌后，加入Rhl23至終濃 度為0. 2 μ g/mL,于室溫避光孵育20分鐘。細(xì)胞樣品經(jīng)PBS洗滌后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其熒 光強(qiáng)度(激發(fā)波長為495nm，吸收波長為535nm)。3 結(jié)果結(jié)果如圖6所示，相同劑量鴉膽子油乳注射液作用后，白血病細(xì)胞系U937的線粒 體膜電位發(fā)生了明顯的下降，而正常人外周血淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的下降程度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低 于U937細(xì)胞。這表明，鴉膽子油乳注射液可能有選擇性作用于腫瘤細(xì)胞的特性，提示鴉膽 子油乳注射液可作為一個高效低毒的抗腫瘤藥物用于治療白血病。試驗例9以人癌異種移植模型來進(jìn)行考察鴉膽子油乳注射液體內(nèi)抗白血病作用 的實驗1試驗材料PBS緩沖液，游標(biāo)卡尺2 方法從北京國家嚙齒類動物中心購買體重范圍為22 25mg的雄性裸小鼠，動物運 抵中國醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗室后需渡過7天的檢疫期，每隔1天對動物進(jìn)行稱重，觀察動
8物是否出現(xiàn)疫病。收集對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，使用高壓滅菌后的PBS調(diào)整細(xì)胞密度為 5X107,于小鼠右側(cè)腋下皮下接種0. 2mL細(xì)胞懸液。使用游標(biāo)卡尺測量動物皮下生長的瘤 塊，當(dāng)瘤塊體積達(dá)50 SOmm3時，將動物隨機(jī)分成空白組，陽性藥組，低劑量組，中劑量組和 高劑量組。用生理鹽水對藥物進(jìn)行稀釋，并通過尾靜脈注射給予動物劑量分別為5. 5mg/kg, 16. 5mg/kg和49. 5mg/kg的藥物。陽性藥為2. Smg/kg的依托泊苷注射乳。連續(xù)給藥10天， 每天給藥前稱量動物體重。每隔一天稱量動物的攝食和飲水，并使用游標(biāo)卡尺測量動物皮 下生長的瘤塊。于第11天脫頸處死動物，進(jìn)行剝瘤，稱量瘤重為腫瘤組織拍照。并使用以 下公式計算瘤體積瘤長度X瘤寬度72。3實驗結(jié)果結(jié)果如圖7所示，尾靜脈注射鴉膽子油乳注射液10天，可以顯著抑制腫瘤的增長。 鴉膽子油乳注射液處理組的瘤重和瘤體積均顯著小于空白組。這表明鴉膽子油乳注射液在 人癌異種移植模型中也具有較好的抗白血病作用，提示鴉膽子油乳劑可以作為一個抗腫瘤 藥物用于治療白血病。
權(quán)利要求
鴉膽子油乳注射液在制備抗血液系統(tǒng)腫瘤藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血液系統(tǒng)腫瘤為人白血病。
3.鴉膽子油乳注射液在制備抗泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了鴉膽子油乳注射液在抗癌方面的新用途，尤其是在抗白血病方面的新用途。本發(fā)明分別以人源性白血病U937，NB4及HL-60細(xì)胞株，人源性前列腺癌Du145細(xì)胞株為靶細(xì)胞，研究了鴉膽子油乳注射液對血液系統(tǒng)腫瘤以及泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的抑制作用。首次發(fā)現(xiàn)鴉膽子油乳注射液對人源性白血病HL-60，NB4及U937細(xì)胞株和人源性前列腺癌Du145細(xì)胞株具有抑制作用，并隨劑量的遞增而提高。且鴉膽子油乳注射液還能誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞的凋亡，并對原代分離的白血病細(xì)胞也有誘導(dǎo)凋亡的作用。并且，鴉膽子油乳注射液對正常人外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較低。這些結(jié)果表明，鴉膽子油乳注射液在治療白血病方面具有一定的潛力，可為白血病的治療提供一個高效低毒的藥物。
文檔編號A61K131/00GK101879202SQ201010217878
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者吳春福, 張弘, 徐勇猛, 楊靜玉, 牟艷華, 王立輝, 王芳, 韓飛 申請人:沈陽藥科大學(xué)