專利名稱：一種新型螺旋藻源降血壓肽及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型螺旋藻源降血壓肽的制備、純化方法，可應用于營養(yǎng)產(chǎn)品、保 健性功能食品及藥品，屬食品生物技術領域。
背景技術：
生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物。人類 攝取的蛋白質經(jīng)過消化道的多種酶水解后，不是僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽 的形式被直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比同一組成的氨基酸要快。因此，生物活性 肽的生物學意義主要體現(xiàn)在其吸收機制優(yōu)于氨基酸和具有氨基酸不可比擬的生理功能兩 個方面。近些年來，大量的科學證據(jù)表明天然食物資源是分離、獲取生物活性肽的寶貴來 源，采用酶法將天然蛋白質水解后，大分子的蛋白質酶切成小分子的肽段，不但利于消化吸 收，而且可以獲得多種生物活性肽。國內(nèi)外對食源低聚肽的研究結果表明，經(jīng)酶解后得到食 用肽類制品具有易吸收、抗氧化、抗疲勞、降血脂、降血壓、增強免疫力等一系列生理功能， 同時研究發(fā)現(xiàn)，食源性肽的生物活性和其原料來源、分子量大小、氨基酸序列與組成有密切 關系。迄今為止，國內(nèi)外研究者相繼從牛乳、奶酪、海洋魚類、小麥、玉米、大豆、大米等天然 食物來源中獲取具有不同生理活性的低聚肽。食源性肽類具有原料來源廣泛、可規(guī)模化生 產(chǎn)、產(chǎn)品功能廣泛、價格便宜等優(yōu)點，已成為國際上極具發(fā)展?jié)摿Φ墓δ苄栽稀Ｄ壳叭澜缬袑⒔畠|人口患高血壓，高血壓正成為嚴重威脅人類健康的疾病之 一。雖然卡托普利(Captopril)等人工合成血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑具有顯著的降 血壓效果，然而這類降血壓藥物屬酶的競爭性抑制劑，它們對酶活性部位的抑制是可逆的， 藥物作用時間不長，停藥后會使血壓反彈；而且，這類藥物被吸收和排泄的速度較快，經(jīng)腎 臟排出易損害腎功能，同時也會引起諸多的副作用，例如咳嗽、過敏、皮疹、水腫、心律失常 和腎臟損害等，所以研發(fā)更為安全的天然來源ACE抑制劑十分必要。ACE抑制肽的研究在國 外從上世紀六、七十年代開始，而在國內(nèi)則從九十年代后期開始才逐有報道。國內(nèi)外研究者 已從不同的天然食物來源中分離出ACE抑制肽，如蝮蛇、牛奶、金槍魚、酪蛋白等，不同來源 的ACE抑制肽在氨基酸數(shù)目、序列和活性上均存在較大差異。螺旋藻(Spirulina platensis)為藍藻屬的一個種，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、 維生素、礦物質和酶類等多種營養(yǎng)成分，具有護肝、抗氧化、防病毒、抗癌和增強免疫等生理 功能。螺旋藻蛋白質占螺旋藻干重的55% 70%，相對于一般概念上營養(yǎng)豐富的雞蛋(蛋 白質含量16% 18%)、大豆(33% 35%)、魚(17% 25% )等，螺旋藻是迄今發(fā)現(xiàn)的蛋 白質含量最高的物種之一。螺旋藻蛋白質包含18種氨基酸，具有人體必需的全部8種氨基 酸，并且在組成配比上最接近于世界糧農(nóng)組織(FAO)規(guī)定的標準，是獲得天然活性肽的潛 在寶貴資源。目前，螺旋藻主要以干粉形式直接應用食品行業(yè)，由于其溶解性質的局限性， 不利于人體吸收，使其應用受到一定的限制。本研究采用蛋白酶解和色譜分離技術，獲取一 種高活性的ACE抑制肽，成果可廣泛應用于保健性功能食品及藥品領域，具有巨大的實用價值和經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服大分子蛋白質吸收性差以及目前活性肽品種混雜不清、活性 和純度不高方面的不足，獲得具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻源降血壓肽。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用超低溫凍融與超聲波破碎相結合的方法，將螺旋藻 粉懸浮水中(料液比1 5 1 10)，懸浮液用液氮-水浴25 30°C法凍融2 5次。 采用超聲波破碎3 5min，以4000g 8000g的速率離心20 40min，得到螺旋藻蛋白質溶 液。然后采用Alcalase 2. 4L酶水解所述螺旋藻蛋白質溶液，酶解pH值7 9，酶與底物的 比例為0. 02 0. 05 (ν/ν)，混合均勻后，酶解溫度40°C 60°C，酶解時間6 10小時。酶 解結束后混合液在沸水浴中加熱8 15min滅酶，然后調節(jié)pH值至7. 0。所獲產(chǎn)物經(jīng)不同 分子量大小的MWCO 10000D、5000D、3000D超濾膜過濾，獲得具有不同分子量多肽的濾液。隨后，以體外ACE抑制活性為指標，通過凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜對所提 取多肽進行純化，純化后的多肽使用全自動蛋白多肽序列分析儀和質譜分析儀進行鑒定， 并檢測對主要胃腸蛋白酶的體外消化穩(wěn)定性。純化后多肽的鑒定序列為異亮氨酸_谷氨酰 胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro, IQP)，IC50值為5. 77士0. 09 μ mol/L，在主要胃腸蛋白酶的消化 下能保持良好的抑制活性?；钚噪牡捏w內(nèi)降血壓效果以原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為模型進 行驗證，證實具有良好的體內(nèi)降血壓效果，可應用于保健性功能食品及藥品領域。在鑒定出序列后，此種具有高體內(nèi)降血壓作用的螺旋藻源降血壓肽也可利用肽自 動合成儀通過多肽合成方法人工合成，也可從其他蛋白來源中酶解制備，具有顯著的體外 ACE抑制活性和體內(nèi)降血壓作用。


下面對附圖進行簡要說明。圖1為螺旋藻堿性蛋白酶酶解液(0 3000D)經(jīng)Superdex Peptide HR 10/30柱 凝膠過濾色譜圖(下圖)和各色譜峰的ACE抑制活性(上圖)。圖2是經(jīng)Cosmosil MS-II C18柱第一次反相高效液相色譜圖(下圖)和各色譜 峰的ACE抑制活性(上圖)。圖3是經(jīng)Cosmosil MS-II C18柱第二次反相高效液相色譜圖。圖4是純化后螺旋藻源ACE抑制肽的質譜分析圖。圖5是螺旋藻源ACE抑制肽IQP對SHR大鼠的24h降血壓效果。㈧SHR大鼠口 服IQP后24h內(nèi)的加權收縮壓變化；⑶SHR大鼠口服IQP后24h內(nèi)的加權舒張壓變化。結 果數(shù)據(jù)以“平均值士標準偏差”表示。在單因素方差分析后，采用Esumi Co. Ltd.(日本東 京)的Excel Toukei 6. 0版軟件進行Scheffe多重比較分析。η = 5，相同時間點的數(shù)值 未包含相同字母表示差異顯著，P < 0. 05。圖6是螺旋藻源ACE抑制肽IQP對SHR大鼠的一周降血壓效果。(A) SHR大鼠口 服IQP —周期間的加權收縮壓變化；(B) SHR大鼠口服IQP —周期間的加權舒張壓變化。結 果數(shù)據(jù)以“平均值士標準偏差”表示。在單因素方差分析后，采用Esumi Co. Ltd.(日本東 京)的ExcelToukei 6. 0版軟件進行Scheffe多重比較分析。η = 5，同一天的數(shù)值未包含相同字母表示差異顯著，P < 0. 05。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并不限制本發(fā)明的 范圍。其具體工藝路線由以下步驟構成1.螺旋藻蛋白酶解液的制備取20g螺旋藻粉懸浮在160mL MiIli-Q水中，懸浮液用液氮-水浴25_30°C法凍融 五次。采用超聲波破碎(200W，振幅60% )3min，在4°C下以6000g的速率離心30min，離心 后去除沉淀，得到蛋白上清液，除一部分以Bio-Rad Protein Assay法測定蛋白質含量外， 其余上清液迅速真空冷凍干燥并在_20°C下貯藏以備用。底物濃度為2% (相當于20mg/mL)的螺旋藻蛋白質溶液，調節(jié)pH值至8. 5，加入 Alcalase2. 4L酶(酶與底物的比例為0. 04 (ν/ν))，混合均勻后，于50°C的溫度條件下水解 10小時。酶解反應結束的反應液在沸水浴中加熱IOmin進行酶滅活，以終止水解反應。然 后迅速置于冰上，調節(jié)pH值至7. 0。在6000g、4°C條件下經(jīng)截留分子量為10000D的Vivascience超濾膜過濾去除酶。 濾液再經(jīng)過MWCO 5000和MWCO 3000D的超濾膜在4°C、6000g下超濾，得到分子量大小范圍 為0 3000、3000 5000、5000 10000D的水解液。不同分子量范圍的水解液迅速真空 冷凍干燥得到干燥粉末并在-20°C下貯藏備用。ACE抑制劑活性測定采用熒光共振能量轉 移法測定(表1)，分子量范圍在0 3000D的酶解液的IC5tl值最低，即ACE抑制活性最高。表1不同分子量范圍酶解液的ACE抑制活性
_分子量范圍(D)_IC50 (mg.mL-1)_Alcalase0-30000.2302 ± 0.0211
3000-5000 1.1517 ±0.1004 _5000-10000_3.0268 ±0.1117_2.螺旋藻源ACE抑制肽的純化分子量0 3000的堿性蛋白酶水解液的凍干粉溶解在IOmM Tris-HCl (pH 7. 0) 中，經(jīng) Superdex Peptide HR 10/30 柱過濾分離，采用 IOmM Tris-HCl(pH 7.0，包含 150mM NaCl)洗脫，在215nm波長處進行檢測并收集，然后檢測ACE抑制活性，活性最高的收集液迅 速進行冷凍干燥(附圖1)。具有最高活性的收集液凍干粉溶解于流動相A中，經(jīng)C0SM0SIL MS-II C18柱進 行反相高效液相色譜純化，色譜柱用100%的流動相A平衡2CV，逐漸升高流動相B的濃度 進行梯度分離純化(0-50%，12CV ；50-100%,3CV)，分離及ACE抑制活性檢測結果見附圖 2。抑制率最高的收集液再次反相高效液相色譜純化(梯度條件0-15%，lCV;15-20%， 15CV ；20-100 %,2CV)，出現(xiàn)單峰，分離譜圖見附圖3，其ACE抑制活性IC50值經(jīng)檢測為 0. 0021 + 0. OOOlmg/mLo流動相A 0. 1 %三氟乙酸(TFA)溶解于1 %乙腈(ACN) /水(ν/ν)；流動相B 0. 1% TFA 溶解于 90% ACN/ffater (ν/ν)。
3.螺旋藻源ACE抑制肽的生物物理化學分析純化后的多肽經(jīng)基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(KRAT0S ANALYTICALSHIMADZU, Japan)分析(附圖 4)及氨基酸測序(PPSQ-31A/33A, SHIMADZU, Japan)，鑒定其氨基酸序列為異亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)，IC50值按 其分子量換算為5. 77士0.09 μ mol/L。經(jīng)酶促動力學分析，IQP為ACE酶的非競爭性抑制 劑，Ki 值為 7. 61 士0. 16 μ mol/L。通過胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶分別單獨消化IQP，以及先經(jīng)胃蛋白酶、再 經(jīng)胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶消化IQP，進行體外穩(wěn)定性試驗。反應停止后的混合液分別使用 10000MWC0超濾膜在4°C下以6000g離心去除酶，取0. 2mL進樣RP-HPLC系統(tǒng)以比較消化前 后的差異。色譜柱為Hydrosphere C18柱(YMC Co.，日本京都)，先用流動相A平衡15min， 再用流動相B對流動相A 0 100%梯度洗脫30min。經(jīng)不同酶處理的多肽液IC5tl值和液 相色譜譜圖特征值如表2所示，前后變化不大，說明此種肽經(jīng)消化酶消化是穩(wěn)定的。表2IQP在主要胃腸蛋白酶消化下的穩(wěn)定性 4. IQP的動物體內(nèi)降壓作用按10mg/kg將IQP溶解于0.9%生理鹽水中，通過胃管每日上午11 00灌服8周齡 雄性原發(fā)性高血壓大鼠(SHR，Charles River, Japan)，每只大鼠灌服量為ImL時間持續(xù)一 周。每日灌服前及第一日灌服后2、4、6、8、24小時的尾部動脈收縮壓、舒張壓、心率采用尾 部套管法(BP-98A-L，Softron, Japan)檢測。如附圖5所示，首日灌服后4、6、8小時的加權收縮壓和舒張壓顯著低于負對照組 (灌服等量的0. 9%生理鹽水)，和正對照組(灌服降血壓藥物Captoporil，10mg/kg)結果 相近，說明本發(fā)明的降血壓肽具有顯著的體內(nèi)急性降血壓效果。另外，從第三日起，灌服IQP 的處理組大鼠的加權收縮壓和舒張壓顯著地低于負對照組(附圖6)，說明本發(fā)明的降血壓 肽具有中期降血壓的效果。
權利要求
一種具有高體內(nèi)活性的降血壓肽，所述降血壓肽的序列為異亮氨酸 谷氨酰胺 脯氨酸(Ile Gln Pro，IQP)。
2.一種制備含有如權利要求1所述序列降血壓肽的螺旋藻低聚肽的方法，其特征在于 所述方法包括以下步驟1)將螺旋藻粉懸浮水中(料液比1 5 1 10)，懸浮液用液氮-水浴25 30°C法 凍融2 5次。采用超聲波破碎3 5min，以4000g 8000g的速率離心20 40min，得 到螺旋藻蛋白質溶液。2)采用Alcalase2. 4L酶水解所述螺旋藻蛋白質溶液，酶解pH值7 9，酶與底物的 比例為0. 02 0. 05 (ν/ν)，混合均勻后，酶解溫度40°C 60°C，酶解時間6 10小時。酶 解結束后混合液在沸水浴中加熱8 15min滅酶，然后調節(jié)pH值至7. 0。3)采用截留分子量為10000D、5000D和3000D的超濾膜對所述酶解后混合液進行過濾， 經(jīng)噴霧干燥或真空冷凍干燥，從而得到不同分子量范圍的螺旋藻低聚肽粉。
3.一種制備如權利要求1所述序列降血壓肽的純化方法，其特征在于所述方法包括以 下步驟1)檢測如權利要求2所述不同分子量范圍的螺旋藻低聚肽的ACE抑制活性，活性最高 的螺旋藻低聚肽經(jīng)Superdex Peptide HR 10/30柱過濾分離，采用IOmM Tris-HCl(pH 7.0， 包含150mM NaCl)洗脫，收集并檢測ACE抑制活性。2)具有最高活性的所述收集液相繼經(jīng)反相高效液相色譜進行2次不同梯度的純化，其 中流動相A :0. 三氟乙酸(TFA)溶解于乙腈(ACN)/水(ν/ν)；流動相B :0. TFA溶 解于 90% ACN/ffater (ν/ν)。
4.如權利要求1所述序列降血壓肽的制備方法，其特征在于所述降血壓肽可以從其他 蛋白來源酶解制備，或利用肽自動合成儀通過合成方法人工合成。
5.如權利要求1所述序列降血壓肽作為產(chǎn)品或添加成分在具有降血壓作用的保健功 能性食品或藥劑中的應用。
6.如權利要求2所述螺旋藻低聚肽作為產(chǎn)品或添加成分在具有降血壓作用的保健功 能性食品或藥劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種口服有效的螺旋藻源新型降血壓肽及其制備方法，所述降血壓肽為一種三肽，序列為異亮氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸(Ile-Gln-Pro，IQP)。本發(fā)明采用堿性蛋白酶對鈍頂螺旋藻進行酶解，通過超濾、凝膠過濾色譜和二次反相高效液相色譜純化，獲得一種血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽。試驗表明IQP為ACE的非競爭性抑制劑，在主要胃腸蛋白酶的消化下能保持良好的ACE抑制活性。IQP對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)具有良好的降壓作用，在高血壓防治藥物和功能食品中具有巨大的應用前景。
文檔編號A61P9/12GK101906135SQ20101023779
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權日2010年7月27日
發(fā)明者任迪峰, 王建中, 田之倉優(yōu), 魯軍 申請人:魯軍