專利名稱：一種低溫木聚糖酶xyngr40及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種低溫木聚糖酶XYNGR40及其 基因和應用。
背景技術：
半纖維素作為植物細胞壁的主要組分，是陸生植物中繼纖維素之后含量最豐富的 碳水化合物，約占植物干重的35%。其中木聚糖是半纖維素中的代表性組分，是自然界中含 量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews. 2005，29 :3_23·)。瘤胃是反芻動物復胃的組成部分之一，而瘤胃微生物則是指棲息在瘤胃中的微 生物，主要包括細菌，真菌和原生動物，經(jīng)過長期進化，瘤胃細菌能分泌多種糖苷水解酶， 對各種多聚糖有較強的降解能力，以提高食物中營養(yǎng)成分的利用效率(Flintand Bayer. Annals ofthe New York Academy of Sciences. 2008，1125 :280_288.)。故瘤胃微生物 纖維素酶在降解纖維素、半纖維素、開發(fā)新飼料，食品加工等方面有廣闊的應用前景。對植 物細胞壁的降解是微生物獲取營養(yǎng)的第一步，需要多種纖維素酶和半纖維素酶的共同作 用。飼料中含有多種多聚糖，在飼料中添加木聚糖酶，可顯著降低消化道中的食糜粘度，提 高動物內(nèi)源性消化酶活性地發(fā)揮，其酶解產(chǎn)物還具有調節(jié)動物腸道微生態(tài)環(huán)境、降低動物 結腸炎的發(fā)生率和減少抗生素等獸藥用量的功效(Beg et al. Applied Microbiology and Biotechnology. 2001,56 :326_338)。低溫木聚糖酶由于其在低溫環(huán)境中具有較高的酶活，相對于中溫或高溫木聚糖酶 有其特有的應用優(yōu)勢(Gerday et al. Trends Biotechnology. 2000，18 103-107)。比如水 產(chǎn)動物由于水體環(huán)境影響其腸道溫度偏低，因此低溫木聚糖酶更適合作為水產(chǎn)飼料添加劑 使用以提高養(yǎng)殖魚類對飼料中營養(yǎng)成分的吸收。同時，在食品工業(yè)中，低溫木聚糖酶與果膠 酶及纖維素酶同時在低溫作用可有效降低果汁黏度，有效提高果汁口味。因此開發(fā)新型的 低溫木聚糖酶將對推動木聚糖酶在各種工業(yè)中應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應用的低溫木聚糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述低溫木聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述低溫木聚糖酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述低溫木聚糖酶的應用。本發(fā)明提供了一種低溫木聚糖酶XYNGR40，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。Mkkrilsvltvplsmcaamsaqglkdaykdyfkigvavnnrnvadpdqikvvlrefnsitaeriamkpqp tepkkgefnwedadkiadfcrangikmrghtlmwhsqigswmyqdekgnlIskeefyanmkhhiqaivnrykdvvyc
3wdvvneavadspvypgrpelrnspmyqiageefiykafeyaheadpdalIfyndyndaepaksqriynlvkrmkdag vpidgigmqahynvygptmkevddaiklystvvdhihlteldirinedmggglrfnqgqatvsdwertlqqdqyvql fkvlrkhkdvidcvtfwnvsdkdswlgvrnypllfdenykpkqaynavknfdpkmdnaviledfkpselnqpgqeyp mvnsqgyarfkvnapkatsvivslglggsggtvlhkaedgswmgttdgpmdegfhyyhltidggvfndpgtnnyygs trwesgieipahdadfyamknvphgnv該酶包括481個氨基酸，N端21個氨基酸預測為信號肽序列。因此，成熟的木聚糖酶XYNGR40的序列如SEQ ID NO. 2所示。qglkdaykdyfkigvavnnrnvadpdqikvvlrefnsitaenamkpqptepkkgefnwedadkiadfc rangikmrghtlmwhsqigswmyqdekgnlIskeefyanmkhhiqaivnrykdvvycwdvvneavadspvypgrpe Irnspmyqiageefiykafeyaheadpdallfyndyndaepaksqriynlvkrmkdagvpidgigmqahynvygp tmkevddaiklystvvdhihlteldirinedmggglrfnqgqatvsdwertIqqdqyvqlfvlrkhkdvidcvtf wnvsdkdswlgvrnypllfdenykpkqaynavknfdpkmdnaviledfkpselnqpgqeypmvnsqgyarfkvna pkatsvivslglggsggtvlhkaedgswmgttdgpmdegfhyyhltidggvfndpgtnnyygstrwesgieipah dadfyamknvphgnv信號肽序列為Mkkrilsvltvplsmcaamsa (SEQ ID NO. 3).本發(fā)明提供了編碼上述低溫木聚糖酶的基因XynGR40，具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID NO. 4所示。ATGAAAAAAAGAATTCTTAGTGTATTGACAGTACCGCTGTCAATGTGTGCAGCAATGTCCGCGCAGGGT CTGAAGGATGCCTACAAGGACTACTTCAAGATCGGTGTCGCCGTCAACAACCGCAACGTCGCGGATCCTGACCAGAT CAAGGTCGTCCTCCGCGAGTTCAACAGCATCACCGCCGAGAACGCGATGAAGCCCCAGCCGACCGAGCCCAAGAAGG GCGAGTTCAACTGGGAGGACGCCGACAAGATCGCGGACTTCTGCCGCGCCAACGGCATCAAGATGCGTGGCCACACC CTGATGTGGCACAGCCAGATCGGCTCCTGGATGTACCAGGACGAGAAGGGCAACCTCCTCTCCAAGGAGGAGTTCTA CGCCAACATGAAGCACCACATCCAGGCCATCGTGAACCGCTACAAGGATGTCGTGTACTGCTGGGACGTGGTCAATG AGGCCGTCGCCGACAGCCCCGTGTACCCGGGC CGTCCGGAGCTCCGCAACTCCCCGATGTACCAAATCGCCGGTGA GGAGTTCATCTACAAGGCTTTCGAGTACGCCCACGAGGCCGACCCGGACGCCCTCCTCTTCTACAACGACTACAATG ACGCCGAGCCCGCCAAGAGCCAGCGCATCTACAACCTCGTCAAGCGCATGAAGGACGCCGGCGTGCCTATCGACGGT ATCGGCATGCAGGCCCACTACAACGTGTACGGCCCGACGATGAAGGAAGTGGACGACGCCATCAAGCTCTACTCCAC GGTCGTGGACCACATCCACCTCACCGAGCTGGATATCCGCATCAACGAGGACATGGGCGGCGGTCTCCGCTTCAACC AGGGCCAGGCCACGGTCTCCGACTGGGAGCGCACCCTGCAGCAGGACCAGTATGTCCAGCTCTTCAAGGTGCTCCGC AAGCACAAGGACGTGATCGACTGCGTCACCTTCTGGAATGTCTCCGACAAGGATTCCTGGCTGGGCGTGCGCAACTA CCCGCTCCTCTTCGACGAGAACTACAAGCCCAAGCAGGCCTACAACGCCGTCAAGAATTTCGATCCCAAGATGGACA ACGCCGTGATCCTCGAGGACTTCAAGCCGTCTGAGCTCAACCAGCCCGGCCAGGAGTACCCGATGGTCAACTCCCAG GGCTACGCCCGCTTCAAGGTCAACGCCCCCAAGGCTACGTCCGTGATCGTCAGCCTCGGTCTCGGCGGTTCCGGCGG CACCGTCCTCCACAAAGCCGAAGACGGCTCCTGGATGGGCACCACCGACGGACCGATGGACGAGGGCTTCCACTACT ATCACCTCACCATCGACGGCGGCGTGTTCAACGACCCCGGCACCAACAACTACTACGGCTCCACCCGTTGGGAGAGC GGTATCGAGATCCCGGCCCACGACGCCGACTTCTATGCTATGAAGAACGTTCCTCACGGCAATGTGTGA其中，信號肽的基因序列如SEQ IDN0. 5所示。atgaaaaaaa gaattcttag tgtattgaca gtaccgctgt caatgtgtgc agcaatgtccgcg本發(fā)明還提供了包含上述低溫木聚糖酶xynGR40的重組載體，優(yōu)選為pET22b-xynGR40o本發(fā)明還提供了包含上述低溫木聚糖酶xynGR40的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大 腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。本發(fā)明還提供了一種制備低溫木聚糖酶XYNGR40的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；以及3)回收并純化所表達的木聚糖酶XYNGR40。本發(fā)明還提供了上述低溫木聚糖酶XYNGR40的應用。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良 的、適合于在水產(chǎn)飼料、食品工業(yè)中應用新的木聚糖酶。本發(fā)明獲得一種低溫木聚糖酶 XYNGR40，最適pH6.5。這些性質符合水產(chǎn)動物消化生理特點，能提高飼料消化能和代謝能， 降低配方成本，減少環(huán)境污染。此低溫木聚糖酶的理論分子量為52. 4kDa。該木聚糖酶XYNGR40的最適pH為 6. 5，在pH5. 0 7. 5的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶在pH 4. 0-8. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在50%以上，這說明此酶 具有較好的PH穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了編碼上述低溫木聚糖酶XYNGR40的基因xynGR40。 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一木聚糖酶基因xynGR40，DNA全序列分析結 果表明，木聚糖酶XYNGR40結構基因xynGR40全長1446bp編碼481aa和一個終止密碼子， N端21個氨基酸預測為信號肽序列。蛋白理論分子量為52. 4kDa，等電點為5. 24，中間為 一個第十家族的催化結構域，末端為E set超家族結構域。在GenBank中的比對結果表明 它與做過功能驗證的來自于Prevotella ruminicola 23的低溫木聚糖酶的最高一致性為 57%，表明XYNGR40是一個新的木聚糖酶。通過進化樹的構建，利用臨位相接法構建的進化 樹(MEGA 4.0)，選取得序列包括XynGR40的蛋白序列以及它的相似性比較高的木聚糖酶蛋 白序列和六個低溫木聚糖酶序列。來自于Thermotoga lettingae TMO的極端嗜熱酶序列 作為進化樹的根。發(fā)現(xiàn)直接從瘤胃微生物宏基因組DNA克隆得到的與瘤胃和人腸道來源的 細菌處在一個分枝上，表明該基因為一個細菌來源的木聚糖酶基因。本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組載體，優(yōu)選為pET22b-xynGR40。將 本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可 操作的與表達調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將木聚糖酶 基因插入到質粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位點之間，得到重組表達質粒 pET22b-xynGR40o本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株BL21/ xynGR40，其保藏編號為 CGMCC No. 4023。本發(fā)明還提供了一種制備低溫木聚糖酶的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶的表達；3)回收并純化所表達的木聚糖酶。其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21/xynGR40。本發(fā)明還提供了上述低溫木聚糖酶的應用。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品工業(yè)中應用新的木聚糖酶。低溫木聚糖酶在室溫有非常高的活性，因其 不需要外加能量供酶促反應，所以在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上的應用可以節(jié)省大量的能源。本發(fā)明的 木聚糖酶最適pH為6. 5，在pH4 10都有較高的酶活性；在低溫下有很高的催化活性，催 化效率要比其它的低溫木聚糖酶高；比活高比已知的細菌來源的其它低溫木聚糖高2-7 倍；同時在中溫條件下的熱穩(wěn)定性要好30°C放置一個月酶活幾乎不變，而其它的低溫酶 在30°C的熱穩(wěn)定性很差，限制了其應用。因此本發(fā)明的低溫木聚糖酶可作為水產(chǎn)飼料添加 劑使用，降低飼料的黏度，增加營養(yǎng)物質的吸收。同時此酶可與果膠酶、纖維素酶在低溫下 共同用于果汁的澄清。在面包的發(fā)酵過程中添加低溫木聚糖酶(面包發(fā)酵一般在20°C度左 右)可以改善面包的品質，增加面包的口感。此酶的對各種來源的木聚糖的降解產(chǎn)物主要 是木糖和木二糖，木糖和木寡聚糖在食品行業(yè)中廣泛地作為增稠劑、脂肪代替物和抗凍食 品添加劑，同時在制藥工業(yè)中與其它物質結合使用，可以延緩藥物成分的釋放。


圖1 在大腸桿菌中表達的重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白 質Marker ；1 誘導的含有空載體的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；2 未誘導的含有木聚糖酶基因載 體的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；3 誘導的含有木聚糖酶基因的大腸桿菌培養(yǎng)上清液濃縮液；3 通過鎳柱純化的達到電泳純的XynGR40蛋白。圖2 重組木聚糖酶的最適pH。圖3 重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖4 重組木聚糖酶的最適溫度。圖5 重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。重組大腸桿菌菌株大腸埃希氏菌XynGR40 (Escherichia coli)(保藏編號 CGMCCNo. 4023，保藏日期2010年7月20日，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所，100101)。
具體實施例方式試驗材料和試劑1、菌株及載體大腸桿菌表達載體pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3)購自于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公 司。燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚，PNPC(鄰硝基苯基-beta-D-纖維二糖)， pNP-xyloside (鄰硝基苯基-beta-D-木糖)，大麥β -葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維 素購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)分析純試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(I)LB 培養(yǎng)基(g/Ι)酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 10. 0，ρΗ7· 0。(2)平板篩選培養(yǎng)基(g/1)酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10. 0，瓊脂15. 0， ρΗ7· 0。
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4、瘤胃液瘤胃液取自三歲雄性的內(nèi)蒙古波爾山羊。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。實施例1瘤胃微生物宏基因組DNA的提取瘤胃液取自三歲雄性的內(nèi)蒙古波爾山羊，首先將采取的瘤胃液在4 °C下 17，OOOXg高速離心30分鐘以收集瘤胃微生物菌體。然后將離心得到的沉淀(含有微生 物)在研缽中液氮研磨成粉末，按照Brady (2007)提供的方法進行宏基因組DNA的提取。將 提取得粗D N A進行瓊脂糖凝膠電泳，把含有D N A的膠塊切下用試劑盒純化備用。實施例2山羊瘤胃來源的木聚糖酶編碼基因xynGR40的克隆根據(jù)第十家族木聚糖酶基因的保守(YDWDVVNE和DGIGMQSH)序列設計合成了簡并 引物 XlO-F 禾口 XlO-R XlO-F 5' -CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA-3‘；XlO-R 5' -GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT-3‘ (Wang et al. ,2010)以上述的瘤胃微生物宏基因組總DNA為模板進行PCR擴增。降落PCR反應參數(shù)為 94°C變性5min ；94°C變性30sec，56-50°C退火30sec, 72°C延伸lmin，10個循環(huán)(每個循環(huán) 降落0. 5°C )，然后94 V變性30sec，50 V退火30sec，72 V延伸lmin，30個循環(huán)，72 V保溫 IOmin0得到一約260bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術有限 公司測序。根據(jù)測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各四條mTAIL-PCR特異性引物設 計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設計在spl的內(nèi)側，sp3位于sp2的內(nèi)側， sp4位于sp3的內(nèi)側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退 火溫度在 63°C。并將它們分別命名為 GR40-uSPl，GR40_uSP2，GR40_uSP3，GR40_uSP4，(上 游特異性引物)；GR40-dSPl，GR40-dSP2，GR40-dSP3，GR40-dSP4(下游特異性引物)見表1。 按照改進的TAIL-PCR(Huang et al. ,2010)中的程序對兩端側翼序列進行擴增。表1.木聚糖酶XynGR40mTAIL_PCR特異性引物 通過改進的TAIL-PCR (Huang et al.，2010)得到已知基因序列的側翼序列，擴增 得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術有限公司測序。通過序列拼接獲得該片段的上下游側翼序 列，全序列共長1. 8kb，找到一個完整的開放閱讀框(ORF)。木聚糖酶基因xynGR40 (GenBank accession no. HM156498)由1446個堿基組成，編碼481個氨基酸和一個終止密碼子，在 GenBank中的比對結果表明它與來源于Bacteroides eggerthiiDSM 20697的假想木聚糖 酶基因全序列相似性為72%，其次是來源于Bacteroidesintestinalis DSM 17393的木聚 糖酶基因，相似性為69%，與做過功能驗證的來自于Prevotella ruminicola 23的低溫木 聚糖酶的最高一致性為57%。xynGR40編碼蛋白預計分子量為52. 4kDa，等電點為5. 24。 經(jīng)預測，XYNGR40前21個氨基酸為信號肽序列，中間為一個第十家族的催化結構域，末端為 E set超家族結構域。通過進化樹的構建，發(fā)現(xiàn)直接從瘤胃微生物宏基因組DNA克隆得到的與瘤胃和人 腸道來源的細菌處在一個分枝上，表明該基因為一個細菌來源的木聚糖酶基因。實施例3重組木聚糖酶的制備。將表達載體pET22b(+)進行雙酶切(NcoI+NotI)，同時將編碼木聚糖酶的基因 xynGR40雙酶切(NcoI+NotI)，切好的編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體pET22b (+)連接，獲得含有木聚糖酶基因xynGR40的重組質粒pET22b-XynGR40并轉化大腸桿菌 BL21(DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21/xynGR40(保藏編號CGMCCNo. 4023，日期2010年 7月20日，保藏地址中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC)。取含有重組質粒的BL21菌株，接種于3mL LB (100 μ g/mL的氨芐青霉素)培養(yǎng)液 中，37°C培養(yǎng)過夜。接菌于20mL LB (加有100 μ g/mL的氨芐青霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)約 2 3h (OD600達到0. 6)后加入終濃度0. 8mmol/L的誘導劑IPTG，30°C 180rpm震蕩培養(yǎng)12h。 12000rpm離心5min，收集培養(yǎng)基上清。DNS法測定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達 量為45. 6U/mL。SDS-PAGE結果(圖1)表明，重組木聚糖酶在大腸桿菌中得到了表達。所 表達的木聚糖酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質的含量達到總蛋白的95%以上。實施例4重組木聚糖酶的活性分析DNS法具體方法如下在pH6. 5，60°C條件下，ImL的反應體系包括100 μ L適當?shù)?稀釋酶液，900 μ L底物，反應lOmin，加入1. 5mL DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm 測定OD值。1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。實施例5重組木聚糖酶XYNGR40的性質測定1、重組木聚糖酶XYNGR40的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定方法如下將實施例3純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。 底物木聚糖用不同PH的0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中30°C下進行木聚糖酶活力 測定。結果(圖2)表明，XYNGR40的最適pH為6. 5，在pH5. 0 7. 5的范圍內(nèi)，酶活性均維 持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中37°C處理60min，再 在PH6.5緩沖液體系中30°C下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結果(圖3)表明，木聚糖 酶在pH 4.0-8.0之間均很穩(wěn)定，在此？!1范圍內(nèi)處理601^11后剩余酶活性在50%以上，這 說明此酶具有較好的PH穩(wěn)定性。2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6. 5)緩沖液體 系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在 30°C下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖4)表明，其最適溫度為30°C。酶的 熱穩(wěn)定性性試驗表明(圖5)，重組酶在45°C時穩(wěn)定性非常好。50°C下保溫60min，剩余酶活 性為25%，551處理51^11酶活全部喪失。3、木聚糖酶的Km值測定方法如下用不同濃度的三種木聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6. 5)緩沖液 體系中，分別在4和30°C下測定酶活性，計算出km值。經(jīng)測定，XYNGR40對三種木聚糖底物 在4和30°C的動力學常數(shù)如表2.表2.木聚糖酶XYNGR40對三種底物的動力學常數(shù)
9SubstrateTemperature「maxKmkcat眾cat/Km(0C)(μηιο mirfi mg_1)(mg mL_1)(S-1)(mL S-1 mg"1)山毛櫸木聚糖30674.11.8584324.64141.92.212354.9樺木木聚糖30647.93.2562175.44128.33.611130.8燕麥木聚糖30884.74.6767163.74173.84.715132.14、不同金屬離子化學試劑對XYNGR40酶活的影響測定如下在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質終濃度為l，5mmol/L。在30°C、pH6. 5條件下測定酶活性。結果(表3) 表明，Zn2+、Na+、Ca2+在高濃度和低濃度時對酶活都有輕微的促進作用，濃度高時促進作用稍 有升高；Cr3+、Cu2+、Mn2+在低濃度時對酶活抑制不強，但隨著濃度的升高，其作用轉變?yōu)榇蠓?度的抑制；SDS對酶活的抑制隨濃度增加而加強；EDTA在高濃度下都會輕微的抑制酶活；而 Co2+和β -Met的促進作用在高濃度時得到更好的體現(xiàn)；重金屬離子Hg2+、Ag+和pb2+在低濃 度時即可強烈抑制酶活，高濃度時甚至會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。其它離子對該酶的作用不明顯。表3.各種化學試劑對木聚糖酶XYNGR40活力的影響離子和化學試相對剩余活力(％)° 離子和化學試劑相對剩余活力(％廣 注“_”代表無法檢測。5、重組木聚糖酶XYNGR40的底物特異性。該酶除了可作用于不同來源的木聚糖，對pNPC(鄰硝基苯基-beta-D-纖維二糖) 也具有微弱的活性，但對于大麥葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素等由葡萄糖聚合 而成的底物沒有活性(表3)。此外，該酶對pNP-xyloside (鄰硝基苯基-beta-D-木糖)也 沒有活性，說明該酶不具有木糖苷酶的活性。表3.木聚糖酶XYNGR40底物特異性分析 6、木聚糖酶XYNGR40降解燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖產(chǎn)物的分析如 下在500 μ L 0.2%的木聚糖底物(燕麥木聚糖、樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖)中加 入6. 5U(IOOyL)純化的酶液，最適溫度30°C下保溫12h。用3kD的超濾管去掉酶蛋白，上 清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培(HPAEC-PAD)檢測方法，進行產(chǎn) 物中糖種類的分析。分析結果表明木聚糖酶XYNGR40降解的三種底物的產(chǎn)物主要是木糖， 木二糖，降解燕麥木聚糖產(chǎn)物中木糖含量為31. 6%，木二糖含量為57. 2%;降解樺木木聚糖 的產(chǎn)物中木糖含量為28. 8%，木二糖含量為61. 3% ；降解山毛櫸木聚糖的產(chǎn)物中木糖含量 為28. 9，木二糖含量為62. %。
權利要求
一種低溫木聚糖酶XYNGR40，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如權利要求1所述的低溫木聚糖酶XYNGR40，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—種低溫木聚糖酶基因xynGR40，其特征在于，其編碼權利要求1或2所述的低溫木 聚糖酶XYNGR40。
4.如權利要求3所述的低溫木聚糖酶基因xynGR40，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4。
5.如權利要求3所述的低溫木聚糖酶基因XynGR40，其特征在于，所述低溫木聚糖酶基 因xynGR40的信號序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.包含權利要求3或4所述低溫木聚糖酶基因xynGR40的重組載體。
7.包含權利要求3或4所述低溫木聚糖酶基因xynGR40的重組菌株。
8.如權利要求7的重組菌株，其特征在于，其所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌 或乳酸桿菌。
9.根據(jù)權利要求8所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為重組大腸桿菌菌株 BL21/xynGR40，其保藏編號為 CGMCC No. 4023。
10.權利要求1或2所述低溫木聚糖酶XYNGR40的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種低溫木聚糖酶XYNGR40及其基因和應用。本發(fā)明提供了一種來源于瘤胃的低溫木聚糖酶XYNGR40，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的基因組編碼基因xynGR40。本發(fā)明的木聚糖酶的具有以下性質最適pH6.5，最適溫度30℃，較好的pH穩(wěn)定性和在低溫下具有較高活性。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于水產(chǎn)飼料、食品工業(yè)等。
文檔編號A61K47/42GK101921739SQ20101023856
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者史秀云, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 王國增, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所