專(zhuān)利名稱(chēng)：3,15-二羰基赤霉酸甲酯在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到新合成的赤霉酸甲酯的用途，具體是3，15-二羰基赤霉酸甲酯在逆 轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)生命和健康，已成為當(dāng)今疾病死亡的主要原因之一。隨著 對(duì)惡性腫瘤本質(zhì)認(rèn)識(shí)的加深，惡性腫瘤是全身而非局部性疾病的認(rèn)識(shí)已被普遍認(rèn)同。因此， 較手術(shù)和放射療法相比，腫瘤的藥物治療即化療在治療腫瘤、延長(zhǎng)生存時(shí)間和提高患者的 生活質(zhì)量方面具有肯定的和不可替代的作用[1]。但是，在腫瘤的化療過(guò)程中產(chǎn)生的多藥耐 藥(Multi-drug resistance, MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因之一 M。MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同 的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。MDR多針對(duì)天然藥物，如阿霉素、柔紅霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春 堿、紫杉醇、鬼臼毒素等產(chǎn)生[11]。MDR是腫瘤化學(xué)治療的主要障礙，也是腫瘤化療亟待解決 的難題。MDR形成的機(jī)制復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)不同途徑導(dǎo)致MDR產(chǎn)生。MDR的產(chǎn)生與P-糖 蛋白(P-gp)的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，還與多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺耐藥蛋白(LRP)、耐藥細(xì)胞 的抗凋亡機(jī)制、拓?fù)洚悩?gòu)酶II(TC)PO II)、蛋白激酶C(PKC)、金屬硫蛋白、谷胱甘肽(GSH)、 谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)等有關(guān)[2]。但多數(shù)腫瘤細(xì)胞MDR的產(chǎn)生主要與P-gp的過(guò)表達(dá)或 與MDR介導(dǎo)的抗凋亡機(jī)制有關(guān)。P-gp表達(dá)在細(xì)胞膜上，為一能量依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，類(lèi)似于藥 泵，能將多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的天然藥物排出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，導(dǎo)致腫 瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物不敏感，產(chǎn)生MDR_。而抗凋亡基因過(guò)表達(dá)和促凋亡基因的低表達(dá) 均能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，并影響化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而亦能產(chǎn)生MDR[3]。其中以 抑制凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的表達(dá)失衡為多見(jiàn)。人類(lèi)P-gp分為兩類(lèi)，分別由mdr-1和mdr_3基因編碼。mdr_l編碼的P-gp與MDR 有關(guān)，分子量為170kD，是一能量依賴(lài)性的藥物外排跨膜蛋白，有12個(gè)跨膜區(qū)，膜內(nèi)有兩個(gè) ATP結(jié)合區(qū)。多數(shù)MDR逆轉(zhuǎn)劑能抑制P-gp活性，恢復(fù)或部分恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏 感性[4]。近年來(lái)研究的MDR逆轉(zhuǎn)劑大致可分為①鈣離子通道阻滯劑其代表是維拉帕米 (verapami 1，VER)，是最早發(fā)現(xiàn)的MDR逆轉(zhuǎn)藥物，其逆轉(zhuǎn)MDR作用與鈣拮抗作用無(wú)關(guān)，而是通 過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與P-gp結(jié)合，成為MDR細(xì)胞外排泵的競(jìng)爭(zhēng)性底物，從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物的聚積 量來(lái)實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)作用。但本類(lèi)藥物由于嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)毒性，妨礙了其臨床應(yīng)用。②環(huán)孢 菌素類(lèi)藥物是一種高度親脂性物質(zhì)，可與抗腫瘤藥物競(jìng)爭(zhēng)P-gp上的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制 跨膜泵作用，使細(xì)胞內(nèi)藥物累積增加，逆轉(zhuǎn)MDR。其代表藥物為環(huán)孢菌素A(CsA)及其衍生 物Valspodar (SDZ-PSC833)和bircodar (Vx710)。臨床觀察發(fā)現(xiàn)CsA比傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)劑維拉 帕米有更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用。但由于Valspodar和Bircodar是細(xì)胞色素氧化酶P4503A4的底 物，因此也抑制該酶的活性，導(dǎo)致經(jīng)該酶代謝相關(guān)藥物的體內(nèi)代謝和消除受抑制，用藥者體 內(nèi)相關(guān)藥物濃度升高而產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。由于這些藥物間的相互作用極其復(fù)雜，在臨 床上難以確定安全有效的給藥劑量，限制了此類(lèi)藥物的應(yīng)用[12]。③新近通過(guò)構(gòu)效關(guān)系和組合化學(xué)原理研制的對(duì)P-gp更具有特異性和更強(qiáng)作用的P-gp抑制劑Tariquidar (XR9576)， 能高親和性地結(jié)合P-gp，強(qiáng)效抑制其活性。不同于前兩類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)制，Tariquidar與 P-gp的結(jié)合是特異性、非競(jìng)爭(zhēng)性的，其親和力遠(yuǎn)大于其它底物。Tariquidar在臨床研究中 觀察到其抑制P-gp的能力和時(shí)間明顯超過(guò)前兩類(lèi)MDR逆轉(zhuǎn)劑，并在I期和II期臨床實(shí)驗(yàn)中 均收到良好的效果。但在III期臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其與一線(xiàn)化療藥物聯(lián)用時(shí)毒性增強(qiáng)，甚至出 現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，以致最終臨床療效依然不理想[5]。在研究的MDR逆轉(zhuǎn)劑中，絕大多數(shù)均為非抗癌藥，而對(duì)于已知的抗癌藥，腫瘤細(xì)胞 又幾乎都可產(chǎn)生耐藥性，即使是應(yīng)用時(shí)間不長(zhǎng)、療效又很好的抗癌藥紫杉醇也是如此。迄今 幾乎沒(méi)有對(duì)耐藥腫瘤有效的抗癌藥，更無(wú)法得知其逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的機(jī)制[6]。有報(bào)道，治療慢 性粒細(xì)胞性白血病的有效成分-靛玉紅顯示出逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，臨床試驗(yàn)中，其在劑量小 于其它抗癌藥時(shí)卻有高于它們的療效，表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)耐藥和抗腫瘤的雙重效應(yīng)，此類(lèi)藥物值 得期待，是尋找抗耐藥腫瘤新藥的重要方向[7]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是眾多化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的共同通路，從這個(gè)意義上說(shuō)，凋亡 受抑或凋亡逃逸可能是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一 [8]。目前，細(xì)胞凋亡調(diào)控基因與腫瘤 多藥耐藥的關(guān)系已被許多學(xué)者所證實(shí)。Bcl-2基因家族是目前研究較深入的細(xì)胞凋亡相關(guān) 基因，與腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)[3]。而B(niǎo)ax作為凋亡促進(jìn)基因的代表，其過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)多 種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，反之則產(chǎn)生耐藥。化合物3，15_ 二羰基赤霉酸甲酯(GA13315)是從合成的一系列赤霉素衍生物中篩 選出的新四環(huán)二萜類(lèi)化合物，已獲中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利保護(hù)，專(zhuān)利名稱(chēng)3，15-二羰基赤霉酸類(lèi)化 合物及其酯和鹽，專(zhuān)利號(hào)ZL 200410021939.2。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供3，15- 二羰基赤霉酸甲酯在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。前期發(fā)明人在對(duì)GA逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的探索中發(fā)現(xiàn)，耐多柔比星(ADM)的人慢性粒細(xì) 胞性白血病細(xì)胞株-K562/A02，在對(duì)多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的經(jīng)典化療藥產(chǎn)生耐藥的情 況下，對(duì)化合物GA仍然敏感，其半數(shù)抑制濃度IC5tl明顯低于其它化療藥，并呈現(xiàn)較好的劑量 依賴(lài)性。本申請(qǐng)?jiān)诖嘶A(chǔ)上，以化療藥ADM耐藥的細(xì)胞株K562/A02和相應(yīng)的敏感株K562 為模型，以維拉帕米(VER)為陽(yáng)性對(duì)照，在驗(yàn)證K562/A02模型的MDR特性及程度的基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步檢測(cè)GA作用于K562/A02細(xì)胞的藥物敏感性以及逆轉(zhuǎn)其ADM耐藥的效應(yīng)及機(jī)制。采 用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、直接免疫熒光法、AnnexinV/PI雙染法、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)(RQ-PCR)多種細(xì)胞分子生物學(xué)方法，檢測(cè)GA對(duì)K562/A02細(xì)胞P-gp表達(dá)、功能、MDR細(xì) 胞凋亡抗性的緩解及mdr-Ι基因mRNA轉(zhuǎn)錄各方面的影響。本發(fā)明對(duì)于尋找同時(shí)兼有抗腫瘤和克服腫瘤多藥耐藥的候選化合物，研發(fā)新的具 有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，提高腫瘤治療的療效奠定基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué) 意義。此外，由于化合物GA的合成原料價(jià)廉易得、反應(yīng)步驟少、產(chǎn)物得率高，因此本發(fā)明亦 具有可期待的應(yīng)用前景。本發(fā)明所述的GA在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用的有益效果如下化療藥ADM、表阿霉 素(EPI)和依托泊苷(VP-16)對(duì)K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)均> 100 μ g/ml，而對(duì)K562細(xì)胞的IC5tl分別為0. 33,2. 08和2. 21 μ g/ml，K562/A02對(duì)各化療藥的耐藥指 數(shù)(RI)分別為303. 03，48. 08，45. 25，表明K562/A02為MDR細(xì)胞模型，K562即為相應(yīng)的敏 感細(xì)胞模型?；衔颎A對(duì)K562/A02細(xì)胞的IC5tl僅為4. 43 μ g/ml，提示在對(duì)多種化療藥耐 藥的同時(shí)，K562/A02對(duì)GA仍然具有較高的敏感性。ADM與10 μ g/mlVER聯(lián)合或與3. 125、 6. 25,12. 5 μ g/ml 濃度的 GA 聯(lián)合作用于 K562/A02 細(xì)胞的 IC50 分別為 1.68,24. 13,2. 38， 0. 84，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(FR)分別為32. 4,2. 26, 39. 45，64. 81倍，提示化合物GA能顯著逆轉(zhuǎn)K562/ A02對(duì)ADM的耐藥(P < 0. 01)；在蓄積實(shí)驗(yàn)中，ADM與VER或GA聯(lián)用均能顯著提高ADM在 K562/A02細(xì)胞內(nèi)的蓄積量，且GA顯示出較為明顯的劑量依賴(lài)性(ρ < 0. 01)，而相同濃度的 GA和VER在同等條件下與ADM聯(lián)用對(duì)Κ562敏感株無(wú)此效應(yīng)(P > 0. 05) ；RH-123外排實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，Κ562細(xì)胞內(nèi)的RH-123含量顯著高于Κ562/Α02細(xì)胞(P < 0. 01)，而6. 25 μ g/ml 的GA即可明顯提高P-gp高親和力底物RH-123在K562/A02細(xì)胞內(nèi)的含量(P < 0. 05)，并呈 現(xiàn)良好的劑量依賴(lài)性；P-gp表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，K562/A02較K562高表達(dá)P_gp (P < 0. 01)， 而12. 5 μ g/ml的GA對(duì)K562/A02細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P > 0. 05)；凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，ADM自身并不能緩解K562/A02細(xì)胞由于耐藥所引發(fā)的凋亡受阻 (P > 0. 05)。但ADM在與GA聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞后，即可劑量依賴(lài)性地緩解由MDR 所導(dǎo)致的K562/A02細(xì)胞的抗凋亡作用，12. 5 μ g/ml的GA聯(lián)合ADM作用于K562/A02細(xì)胞 48h后，耐藥株由10 μ g/ml ADM引發(fā)的凋亡從20. 15%增加到74. 41 %，P < 0. 05 ；RQ-PCR 結(jié)果顯示，ADM單獨(dú)或與GA聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞后，其mdr-ImRNA的表達(dá)出現(xiàn)輕微下 調(diào)，但與對(duì)照組相比，此下調(diào)作用不明顯(P >0.05)。因此，新四環(huán)二萜類(lèi)化合物GA具有逆 轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的效應(yīng)，此作用與增加耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥的含量、阻止其外排及 促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡有關(guān)，但與下調(diào)耐藥基因mdr-Ι的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)，提示其作用機(jī)制與 抑制耐藥細(xì)胞P-gp的外排泵功能及誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡有關(guān)。


圖1為化合物GA對(duì)K562和K562/A02細(xì)胞增殖的IC50 ( μ g/ml)；圖2為化合物GA對(duì)K562/A02細(xì)胞中ADM蓄積量的影響；圖中從左往右各峰依次 為陰性對(duì)照組，GA-3. 125，6. 25，VER (陽(yáng)性對(duì)照)-10，GA-12. 5 ( μ g/ml)；圖3為化合物GA對(duì)K562細(xì)胞中ADM蓄積量的影響；圖4為化合物GA對(duì)K562/A02細(xì)胞中ADM蓄積量的影響(三次實(shí)驗(yàn)平均值)；圖5 圖8為GA對(duì)K562/A02細(xì)胞P糖蛋白(P_gp)表達(dá)的影響；圖9為GA對(duì)K562/A02和K562細(xì)胞內(nèi)RH123含量的影響；圖10為GA對(duì)P-gp蛋白泵外排功能的影響；圖11 圖15為GA對(duì)ADM誘導(dǎo)的K562/A02細(xì)胞凋亡的影響；圖16為RQ-PCR中各實(shí)驗(yàn)組溶解曲線(xiàn)圖；圖17為RQ-PCR中各實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增曲線(xiàn)圖；圖18為RQ-PCR檢測(cè)GA對(duì)K562/A02細(xì)胞mdr_lmRNA表達(dá)的抑制作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
一、實(shí)驗(yàn)材料(一 )細(xì)胞株K562 (The Drug Sensitive Human Myelogenous Leukemia Cell line) :ΑΙ# 4 系白血病細(xì)胞株；Κ562/Α02(The Drug Resistant Human Myelogenous Leukemia Cell line) -M^ 柔比星的人慢性髓系白血病細(xì)胞株。兩株細(xì)胞均引自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所。K562細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎 牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，37°C，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。K562/A02細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 1 μ g/ml的多柔比星(ADM)維持培養(yǎng)，并于實(shí)驗(yàn)前2周去除ADM、用常規(guī)RPMI1640完全培養(yǎng) 液進(jìn)行培養(yǎng)。(二)樣品與試劑1、樣品化合物GA13315，化學(xué)名3，15- 二羰基赤霉酸甲酯，為新四環(huán)二萜類(lèi)化合物，分子 量為370. 4，由云南大學(xué)提供。2、主要藥品及試劑(1)注射用鹽酸多柔比星(ADM)浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)080202B ；(2)依托泊苷注射液(VP-16)江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)08020691 ；(3)注射用硫酸長(zhǎng)春新堿(VCR)浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)070501 ；(4)鹽酸維拉帕米注射液(VER)哈藥集團(tuán)三精制藥，批號(hào)080107A8 ；(5)連接有熒光素PE的P-gp單克隆抗體(Anti-Pgp-PE) =BD公司；(6)羅丹明 123 試劑(RH-123) =Sigma 公司，127k5752 ；(7)改良型RPMI 1640培養(yǎng)基賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號(hào) NTE0099 ；(8) 二甲基亞砜(DMSO) =Amresco 產(chǎn)品，批號(hào):0718A01 ；(9)碘化丙啶(PI) Sigma公司生產(chǎn)；(10)核糖核酸酶A(RNase A) :Sigma公司生產(chǎn)；(11)無(wú)水乙醇天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào)20090515 ；(12)胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)，批號(hào)080619 ；(13) 二甲基四氮唑藍(lán)(MTT) =Amresco公司生產(chǎn)，批號(hào)1708B015 ；(14)十二烷基硫酸鈉(SDS)汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品公司生產(chǎn)，批號(hào)20080210 ；(15)異丁醇上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)0804253 ；(16)濃鹽酸(HCl)成都市欣海興化工試劑廠(chǎng)生產(chǎn)；(17)0. 9%氯化鈉注射液(N · S)昆明南疆制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0806270 ；(18)NaCl 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司生產(chǎn)，批號(hào)=20080901 ；(19)TRIzol 試劑，invitrogen 公司生產(chǎn)，Lot. No 50300413 ；(20)焦碳酸二乙酯(DEPC)，Promega公司產(chǎn)品；(21)M-MLV Reverse Transcriptase (200U/ul)試劑盒，invitrogen 公司生產(chǎn)， Cat. No 28025-021 ；(22)5XFirst-Strand Buffer[250Mm Tris-HCl,375Mm KCl，15mm MgC12],invitrogen 公司產(chǎn)品，Cat. No :28025_021 ；(23)DTT(0. ImM)，invitrogen 公司產(chǎn)品，Cat. No :28025_021 ；(24)Random primer，中國(guó)上海生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Lot. No 0701 ；(25) dNTPs (IOmM)，中國(guó)上海生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Lot. No =3080901 ；(26) β -actine及mdr_l上、下游引物，中國(guó)上海生物工程技術(shù)有限公司合成；(27) SYBR Green I (20X)，Generay 公司產(chǎn)品，Lot. No :RS0975 ；(28)MgC12(25mM)，F(xiàn)ermentas 公司產(chǎn)品，Lot. No :00031664。(29) TaqDNA 聚合酶、PCR 反應(yīng)緩沖液(IOx)，北京 BioDev(29) Platinum Taq DNA Polymerase (5U/ul), invitrogen ^ W] Λ ηππ, Lot. No 266632。(三)主要儀器和設(shè)備1. C02培養(yǎng)箱德國(guó)Hereaus公司生產(chǎn)；2.電子天平常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)生產(chǎn)，JJ200型；3.醫(yī)用凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn)，YJ-1450型；4.低溫高速離心機(jī)德國(guó)Hereaus公司生產(chǎn)，Biofuge 15R型；5.倒置相差顯微鏡日本Olympus公司生產(chǎn)，BH-2型；6.酶標(biāo)板自動(dòng)讀數(shù)儀美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)，Bio-Rad 680型；7.熱空氣干燥消毒箱德國(guó)Hereaus公司生產(chǎn)，D-6450型；8. 一次性6孔、96孔培養(yǎng)板美國(guó)Corning公司生產(chǎn)；9.超低溫冰箱美國(guó) Thermo Electron 公司生產(chǎn)，F(xiàn)orma_86C991 型；10.光學(xué)顯微鏡德國(guó)萊卡(Leica)公司生產(chǎn)，DM400B型；11.流式細(xì)胞儀=Beckman coulter 公司生產(chǎn)，Coulter EpicsXL 型；12.臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品，型號(hào)Biofuge Stratos ；13.常溫高速離心機(jī)，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品，型號(hào)IEC Multi ；14.實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，型號(hào)7300 ；15.海爾冰箱(4°C )，中國(guó)青島海爾集團(tuán)產(chǎn)品；16. UV2000紫外分析儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；17.電泳儀、電泳槽，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；18.紫外分光光度儀，BIO-RAD有限公司產(chǎn)品；19.漩渦混合器，其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品，QL-901。(四)試劑配制1. RPMI 1640完全培養(yǎng)液的配制[11]RPMI 1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、青霉素(100 μ g/ml)和鏈霉素(100 μ g/ ml)，pH 為 7.4。2. 0. Imol PBS平衡鹽溶液配制。NaCl 8. 00g、KCl 0. 20g、Na2HP04 · H20 2. 89g、KH2P040. 20g,用 IL 三蒸水溶解后 調(diào)pH值7. 2左右。3.三聯(lián)液配制0. 012mol/l 鹽酸、10% SDS、5%異丁醇，即加 1. 2ml 36%-37%濃鹽酸、100g SDS、
750ml異丁醇，用IL三蒸水溶解。4. MTT 配制取5mgMTT粉末，加入ImlPBS配成5mg/ml濃度溶液。5.配制多柔比星(ADM)溶液注射用多柔比星規(guī)格10mg，加入IOml滅菌生理鹽水(N. S)于安瓿瓶?jī)?nèi)，溶解后 濃度為lmg/ml，分裝至1.5ml印管內(nèi)，于0°C冰箱保存待用，每次取1印管內(nèi)的ADM使用， 融化后不可再凍存，作K562/A02細(xì)胞株的維持培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)用。6. TAE 儲(chǔ)存液(50x)24. 2gTris堿(三羥甲基銨基甲烷)，57. Iml冰醋酸，37. 2gNa2EDTA. 2H20，加水至 1000ml，4°C保存。用時(shí)加水稀釋至Ix工作液。7.溴酚藍(lán)上樣緩沖液(6X)0.25%溴酚藍(lán)，0.25% 二甲苯青，30%甘油溶于水中，4°C保存。用時(shí)和樣品以 1 5混合上樣。8.瓊脂糖凝膠配制2%瓊脂糖凝膠0. 9g瓊脂糖干粉，45ml去離子水，900ulTAE混合于燒瓶中，于微 波爐中煮沸，待凝膠溫度降至60°C左右加入EB，使終濃度達(dá)10mg/ml。搖勻后立即倒入準(zhǔn)備 好的膠膜中，待冷卻后，拔出上樣梳，取出凝膠于4°C冰箱中保存。二、實(shí)施方式實(shí)施例一 K562/A02的多藥耐藥特性及程度1.藥物及配制化療藥ADM、EPI、VP-16 均設(shè) 100、50、25、12. 5、6. 25 μ g/ml 5 個(gè)受試濃度，此濃度 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定。具體配制如下稱(chēng)取一定量藥物加入一定量的N. S溶解后，再加入 一定量的RPMI1640完全培養(yǎng)液配制成高濃度溶液，其余濃度等比稀釋配制而成。2.實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]，以改良MTT法測(cè)定各化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。取處于對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期的K562及K562/A02細(xì)胞株調(diào)整為一定濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，90 μ 1/ 孔，種板后立即加入不同受試藥物，各受試物均設(shè)100、50、25、12· 5,6. 25 μ g/ml 5個(gè)受試 濃度，每種濃度設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，10 μ 1/孔。陰性對(duì)照為等體積培養(yǎng)基。加藥后繼續(xù)置于 37°C,5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在藥物作用48h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20l·! 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h， 每孔加入三聯(lián)液[10% SDS-5%異丁醇-0.012mol/L HCl (W/V/V) ] 100 μ 1溶解還原產(chǎn)物甲 臜。用酶標(biāo)儀在570nm單波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值。3.結(jié)果處理(1)計(jì)算各受試樣品不同濃度的平均OD值及標(biāo)準(zhǔn)差，按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑 制率抑制率(％ ) = (OD值對(duì)照孔-OD值加樣孔)/OD值對(duì)照孔X 100%采用Microsoft Excel 2003計(jì)算抑制率，采用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50 ；(2)按下列公式計(jì)算以上三種化療藥物的耐藥指數(shù)(Resistance Index, RI)
結(jié)果化療藥ADM、EPI、VP-16在對(duì)K562敏感株作用時(shí)均表現(xiàn)出良好的藥物敏感 性，其IC5tl值分別為0. 33，2. 08，2. 21 μ g/ml。而同等實(shí)驗(yàn)條件作用于K562/A02耐藥細(xì)胞 的半數(shù)抑制濃度IC5tl均> 100 μ g/ml。按公式計(jì)算各化療藥物的RI均大于30 (IC5tl值大于 100 μ g/ml時(shí)按100計(jì)RI)(表1)。參照文獻(xiàn)證實(shí)耐藥細(xì)胞模型成立。表1K562/A02細(xì)胞對(duì)各化療藥物的耐藥指數(shù)(RI)
~m\IC50 (pg/ml)耐藥指數(shù)
K562K562/A02(RI)
ADM 033>100303.03
EPI 2.08>10048.08
VP-16 2.21>10045.25實(shí)施例二 K562/A02細(xì)胞對(duì)化合物GA的敏感性1.藥物及配制ADM、VCR、VP-16、GA 均設(shè) 100、50、25、12. 5、6. 25μ g/ml 5 個(gè)受試濃度(此濃度根 據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定)，具體配制方法同前。2.實(shí)驗(yàn)方法改良的MTT法同前。結(jié)果化合物GA作用于K562/A02細(xì)胞表現(xiàn)出較高的藥物敏感性，IC50值僅為 4. 43 μ g/ml (表2)，而對(duì)于其它三種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥，K562/A02細(xì)胞對(duì)其藥 物作用均不敏感。提示K562/A02細(xì)胞在對(duì)多種化療藥耐藥的同時(shí)，對(duì)化合物GA仍然具有 較高的敏感性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。
0122]表2K562/A02細(xì)胞對(duì)各受試物的藥物敏感性
0123]組別IC5tl(PgAil)
0124]ADM> 100
0125]VCR72. 74
0126]VP-16> 100
0127]GA4. 43
0128]_
0129]實(shí)施例三化合物GA逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞ADM耐藥的效應(yīng)及強(qiáng)度
0130]1.藥物及配制
0131](1)化合物G
0132]設(shè)12.5、6.25、3. 125 μ g/ml3個(gè)受試濃度(此濃度根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定)。具體配 制如下稱(chēng)取一定量GA，加入一定量的DMSO待其溶解后，再加入一定量的RPMI1640完全培 養(yǎng)液配制成高濃度溶液，各低濃度溶液則按比例稀釋配制而成；
9
(2)陽(yáng)性對(duì)照VERVER為初始濃度2. 5mg/ml的注射用液體制劑，加入一定量的RPMI1640完全培養(yǎng)液 將其稀釋為10 μ g/ml濃度的工作液；(3) ADM原液濃度lmg/ml，加入一定量的RPMI1640完全培養(yǎng)液將其稀釋為10 μ g/ml濃度 的工作液。2.實(shí)驗(yàn)方法將K562及K562/A02細(xì)胞懸液以2X 105/ml接種于96孔板，并將其分為五個(gè)實(shí)驗(yàn) 組[14] =A 組(陰性對(duì)照組):cell+10 μ g/mlADM ；B 組(陽(yáng)性對(duì)照組):cell+10 μ g/mlADM+10 μ g/ml VER ；C 組(低劑量組):cell+10 μ g/mlADM+3. 125 μ g/ml GA ；D 組(中劑量組):cell+10 μ g/mlADM+6. 25 μ g/ml GA ；E 組(高劑量組):cell+10 μ g/mlADM+12. 5 μ g/ml GA。加藥后置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48h，采用改良的MTT法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制的影響，方法同前。3.計(jì)算公式(1)計(jì)算IC5tl，軟件及公式同前；(2)通過(guò)下列公式計(jì)算化合物GA逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(Fold Resistance, FR)
權(quán)利要求
化合物3，15 二羰基赤霉酸甲酯GA在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物GA在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的用途，其特征是在制備用 于抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物GA在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的用途，其特征是化 合物GA與至少一種藥物上可接受的載體制成的藥物制劑，制劑形式為液體制劑、顆粒劑、 片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或注射劑。
全文摘要
3，15-二羰基赤霉酸甲酯GA在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的用途，本發(fā)明提供的化合物GA具有良好的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥(Multi-drug Resistance，MDR)的活性，GA作用于K562/A02具有較高的藥物敏感性并能顯著逆轉(zhuǎn)K562/A02對(duì)ADM的耐藥；GA逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的效應(yīng)機(jī)理是通過(guò)增加耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥的含量、阻止其外排及促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的，但與下調(diào)耐藥基因mdr-1的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)，提示其作用機(jī)制是與抑制耐藥細(xì)胞P-gp的外排泵功能及誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡有關(guān)，化合物GA具有較低的毒性，因此，化合物GA具有良好的臨床腫瘤化療、尤其是抗臨床腫瘤耐藥的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K31/365GK101933920SQ20101024081
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者仇笳熙, 卿晨, 張洪彬, 張雁麗, 陳亞娟, 陳靜波 申請(qǐng)人:昆明醫(yī)學(xué)院;云南大學(xué)