專利名稱：抑制mbd2表達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為以甲基化CpG結(jié)合域蛋白 2 (Methyl-CpG Binding Domain Protein 2，MBD2，以下簡稱為 MBD2)為靶點(diǎn)，抑制 MBD2 表 達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮細(xì)胞裱襯在整個(gè)心血管系統(tǒng)的內(nèi)表面，它不僅調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)、多種生物 活性分子和血液細(xì)胞的運(yùn)輸，而且是一個(gè)重要的自我平衡器官，正常的內(nèi)皮細(xì)胞能對多種 生理及化學(xué)訊號產(chǎn)生應(yīng)答，釋放一群自分泌和旁分泌物質(zhì)如一氧化氮(nitric oxide,NO), 環(huán)前列腺素和內(nèi)皮源性超極化因子等，調(diào)節(jié)血管的張力，抑制血小板聚集、細(xì)胞粘附、平滑 肌細(xì)胞增生，在血管功能調(diào)控中扮演著關(guān)鍵的角色，同時(shí)在血管疾病及其初始防御中發(fā)揮 重要作用。但是，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞暴露于心血管風(fēng)險(xiǎn)因子如吸煙、糖尿病、高血壓、血脂異常、肥
胖及慢性系統(tǒng)炎癥等，其將處于一種活化狀態(tài)------內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，表達(dá)大量化學(xué)因
子、細(xì)胞因子和粘附分子及eNOS合成NO減少、生物活性降低等，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生、發(fā) 展，常致病人死亡和殘疾。因此血管內(nèi)皮功能障礙是心血管疾病的主要原因。由于血管疾 病的病因包括遺傳的和后天的多種因素，所使用的藥物多針對不同的病因，及其繁多，因此 確立一個(gè)針對多種病因、最佳的、副作用最少的治療目標(biāo)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。作為一個(gè)主要的表觀遺傳學(xué)組成部分，DNA甲基化模式的改變在動物和人類血管 疾病中是非常常見的。最近的研究表明，DNA甲基化可以作為一個(gè)“足跡”反映環(huán)境暴露 對不同類型細(xì)胞的后果。這種DNA甲基化模式可以由保守的甲基化CpG結(jié)合域蛋白家族 (MBD) “閱讀”，其中包括MBD1，MBD2, MBD3, MBD4和MeCP2。他們與其蛋白伴侶在DNA甲基 化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制和/或異染色質(zhì)的形成中發(fā)揮積極的作用。每種MBD蛋白與甲基化DNA 的親和力是不同的，親和力最高的是MBD2蛋白，但哺乳動物中MBD3不能選擇性識別甲基化 DNA。目前能建立MeCP2，MBD1，MBD2和MBD4缺陷的動物模型，但MBD3缺陷導(dǎo)致胚胎死亡。 研究表明MeCP2或MBDl缺陷小鼠與特定神經(jīng)學(xué)缺陷有關(guān)；而MBD4被發(fā)現(xiàn)能抑制CpG突變 和腫瘤發(fā)生。相比之下，MBD2缺陷小鼠顯示一個(gè)幾乎正常的表型，僅觀察到微小的異常母 性行為(Hendrich B,Guy J,Ramsahoye B,Wilson VA,Bird A. Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development. Genes Dev 2001 March 15 ； 15 (6) :710_23)，目前的研究顯示應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制MBD2的表達(dá)能 夠抑制腫瘤的生長，MBD2已成為人們研究治療多種腫瘤的新靶點(diǎn)(W0/2004/001027)。這表 明MBD2可能成為一個(gè)合適的表觀遺傳治療目標(biāo)，通過抑制MBD2的表達(dá)，達(dá)到預(yù)防和治療血 管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病的目的。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的 基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo) 入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默(Fire A, Xu S, Montgomery Μ, Kostas S, Driver S, Mello C. Potent and specific genetic
3interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature,1998 391(6669) :806-11)。RNAi機(jī)制普遍存在于動植物，尤其是低等生物中。因此被認(rèn)為是進(jìn) 化上相對保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究表明，RNAi機(jī)制可能是作為在RNA水平上抵御病 毒入侵的防御機(jī)制而存在的。RNAi在基因沉默方面具有高效性和簡單性，19個(gè)核苷酸的雙鏈RNA幾乎可以完全 抑制基因的表達(dá)，而且還具有很高的特異性，與靶mRNA之間一個(gè)堿基的錯(cuò)配都會顯著削弱 基因沉默的效果，所以是基因功能研究的重要工具。大多數(shù)藥物屬于標(biāo)靶基因(或疾病基 因)的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標(biāo)確認(rèn)的一個(gè) 重要工具。同時(shí)，那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進(jìn)一步開發(fā)成 為RNAi藥物?；蚯贸?knock-out)小鼠是一種遺傳工程技術(shù)下利用基因剔除技術(shù)所做出的 一或多個(gè)特定基因被剔除的小鼠。此技術(shù)為用來觀察并研究活體內(nèi)基因表現(xiàn)的工具之一。 此外，更可借由基因剔除后對小鼠所產(chǎn)生的變化，精確地了解人類先天基因缺損所造成疾 病的致病機(jī)轉(zhuǎn)，也是此技術(shù)的重大優(yōu)點(diǎn)之一。我們利用RNA干擾技術(shù)及基因敲除小鼠，了解MBD2基因沉默或敲除對動物和人類 血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙所起的作用，從而確定MBD2是否可以成為一種全新的預(yù)防和治療 血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病靶點(diǎn)。對發(fā)明一個(gè)針對多種病因、最佳的、副作用最少的治 療藥物或制劑有著極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病的新靶點(diǎn) MBD2。涉及抑制MBD2的表達(dá)抑制劑，實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下它是一種核酸分子、遺 傳結(jié)構(gòu)、siRNA分子以及包含以上一個(gè)或多個(gè)的復(fù)合物，能在體內(nèi)或/和體外抑制MBD2的 表達(dá)，并在制備預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病藥物和制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的一種siRNA，與MBD2的mRNA序列同源互補(bǔ)，特征是，其核苷酸序列為 正義鏈5' -GCAAGAGCGAUGUCUACUA-3‘；反義鏈5' -UAGUAGACAUCGCUCU UGC-3‘。它能 夠?qū)氩溉閯游锛?xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。上述雙鏈RNA分子的3'末端可以加上兩個(gè)懸掛堿基tt，以增加siRNA活性， 其核苷酸序列為正義鏈5 ‘ -GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3 ‘；反義鏈5 ‘ -UAGUAGACAUCG ⑶CUUGCtt-3'。它能夠?qū)氩溉閯游锛?xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。本發(fā)明所涉及的一種抑制MBD2表達(dá)的SiRNA，與MBD2的mRNA序列同源互補(bǔ)，但其 序列不同于以上序列1、2、3、4，能夠?qū)氩溉閯游锛?xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。上述雙鏈RNA分子的3'末端可以加上兩個(gè)懸掛堿基tt，以增加siRNA活性，能夠 導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。本發(fā)明所涉及的siRNA分子，是上述siRNA分子經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈RNA分子。所述化學(xué)修飾為磷酸骨架修飾，包括對連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分修飾或用 其他化學(xué)鍵取代，如硫代修飾。硫代修飾最初廣泛用于反義技術(shù)中提高寡聚核苷酸對核酸 酶的抗性。硫代磷酸是用一個(gè)硫原子取代磷酸二酯鍵的非橋氧原子，即P-S鍵替代P-O鍵， 提高了 SiRNA抗核酸酶的能力，增加它的穩(wěn)定性。
化學(xué)修飾為核糖修飾，包括對這些SiRNA分子核酸戊糖2位上的OH作的化學(xué)修 飾和改變，如在核糖的2'位置引入某些取代基如甲基、氟，使siRNA具有更強(qiáng)的抵抗核 酸酶水解的性能。第一種核糖修飾是在siRNA戊糖的2'位置引入一個(gè)或多個(gè)烷基，如 2' -0-甲基；第二種修飾2'-氟嘧啶是將siRNA上嘧啶核苷酸的2' -OH用2' -F替代， 2' -F使RNA酶不易識別siRNA，從而增加了 siRNA的穩(wěn)定性。化學(xué)修飾包括對siRNA分子堿基的修飾，siRNA與mRNA通過堿基互補(bǔ)形成氫鍵， 發(fā)揮RNAi的作用，因此可以對堿基進(jìn)行修飾。在尿嘧啶的5位點(diǎn)引入溴或碘是常使用的堿 基修飾方法，如5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶可加強(qiáng)腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)之間的連接，提 高堿基的相互作用。其他修飾如引入親脂性基團(tuán)，加強(qiáng)siRNA的親脂性，增加其透過細(xì)胞膜的能力；用 2'脫氧胸腺嘧啶核苷酸代替3'突出的尿嘧啶核苷酸，其RNA干擾的效果相同，更能抵抗 核酸酶的消化。這些修飾能夠增加siRNA的穩(wěn)定性，同時(shí)增強(qiáng)其生物學(xué)活性，能夠?qū)氩溉?動物細(xì)胞，抑制目的基因的表達(dá)。本發(fā)明涉及的一種核酸分子，包含7個(gè)或以上與哺乳動物MBD2mRNA同源互補(bǔ)的連 續(xù)核苷，能進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。本發(fā)明涉及的一種遺傳結(jié)構(gòu)，包含以上核酸分子，如RNA分子、DNA分子、質(zhì)粒、載 體、病毒等，能進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。本發(fā)明涉及的、包含以上一個(gè)或多個(gè)抑制劑的復(fù)合物，能進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞，抑制 MBD2的表達(dá)。本發(fā)明涉及的上述MBD2抑制劑在制備預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾 病藥物和制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的是MBD2被作為靶點(diǎn)，在預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾 病中的應(yīng)用。如用于糖尿病心血管并發(fā)癥、動脈粥樣硬化等的預(yù)防和治療。本發(fā)明的優(yōu)越性在于運(yùn)用RNA干擾技術(shù)及相關(guān)技術(shù)探明了 MBD2基因沉默或敲 除能夠治療和預(yù)防動物和人類血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙所引起的疾病，從而確定MBD2可以 成為一種全新的預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病靶點(diǎn)，對發(fā)明一個(gè)針對多種病 因、最佳的、副作用最少的治療藥物或制劑有著極其重要的意義，為制備相關(guān)藥物或制劑提 供了新的選擇，有著廣闊的應(yīng)用前景。


圖1:MBD2 siRNA抑制人類臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞MBD2蛋白的表達(dá)。MBD2 siRNA 劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞MBD2蛋白的表達(dá)。當(dāng)MBD2 siRNA濃度為IOOnM時(shí)，MBD2蛋白的 表達(dá)減少了 70% (η = 4)。圖2 :MBD2表達(dá)的抑制促進(jìn)了血管生成，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮 細(xì)胞凋亡。圖2A，MBD2基因knockdown促進(jìn)成管。左側(cè)為成管的代表性圖像，右圖示管的平均 長度(η = 4例)。圖2B，MBD2的抑制促進(jìn)了 HUVEC的增生。結(jié)果以mean 士 SEM表示(η = 3)。圖2C，MBD2 knockdown保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于H2O2誘導(dǎo)的凋亡。左一個(gè)代表性的流式細(xì) 胞儀數(shù)據(jù)。右圖示結(jié)果來自4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。Ctl，Control ；#，ρ < 0. 001 ;*，ρ < 0. 01.表達(dá)及小鼠缺血后肢灌流恢復(fù)。圖3A，在MBD2缺陷小鼠血管中沒有MBD2的表達(dá)。圖3B，后肢缺血損傷后MBD2表 達(dá)的時(shí)空變化。用Western blotting對后肢MBD2蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢查(左)，以MBD2 蛋白與β-肌動蛋白的比值表示MBD2的相對含量(右，η = 5)。圖3C，缺血性和非缺血后 肢切片MBD2和內(nèi)皮細(xì)胞共免疫組化染色。細(xì)胞核以DAPI染色(a&e)，內(nèi)皮細(xì)胞以抗-CD31 抗體染色(b&f)，MBD2染色為綠色(c&g)。合并后的圖像(d&h)由DAPI、抗-CD31和MBD2 染色重疊產(chǎn)生。圖d和h中插入的高分辨率影像顯示MBD2和內(nèi)皮細(xì)胞的共定位。圖3D，后 肢缺血損傷后后肢血流的恢復(fù)。激光多普勒成像系統(tǒng)用來測量血流量(left panel)，平均 后肢血流以缺血側(cè)與非缺血側(cè)訊號的比值表示(right panel, η = 6)。圖3Ε，缺血性損傷 7天后MBD2缺陷小鼠毛細(xì)血管形成與野生型相比明顯增加。左為后肢切片(Χ200)，以內(nèi)皮 細(xì)胞(CD31陽性細(xì)胞)的數(shù)量作為毛細(xì)血管的形成指標(biāo)。右側(cè)的條形圖代表各組的平均微 血管密度(η = 5)。圖3F，缺血性損傷7天后小動脈形成。后肢切片(Χ200)中平滑肌細(xì)胞 (anti-α smooth muscle actin陽性細(xì)胞)的數(shù)量作為小動脈的形成指標(biāo)。右側(cè)的條形圖 代表各組的平均小動脈密度(η = 5)。*，ρ < 0. 01.圖4，MBD2缺陷小鼠抵抗糖尿病引起的血管內(nèi)皮功能障礙。圖4Α，氯化鉀(KC1，120mM)誘導(dǎo)的血管收縮。圖4B，苯腎上腺素(PE)引起的血 管收縮。圖4C，乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張。圖4D，L-NAME(10-4M)阻斷內(nèi)源性 eNOS后，SNP誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張。MBD2缺陷和對照小鼠在生理和糖尿病狀態(tài)下(A 和B)血管收縮活動沒有差異，但是，野生型糖尿病小鼠血管舒張功能明顯受損，而MBD2缺 陷糖尿病小鼠與非糖尿病對照組(C)相似，且表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性(D)。數(shù)據(jù)以mean士SEM表 示，η = 4。氺，ρ < 0. 01。圖5，:MBD2的丟失活化內(nèi)皮細(xì)胞生存及促血管生成信號。圖5A，MBD2的抑制增強(qiáng)了 ERK1/2的活性。左代表性的總ERK1/2和ρ ERK1/2免 疫印跡結(jié)果；右P ERK1/2在被轉(zhuǎn)染MBD2siRNA的HUVEC中表達(dá)的定量分析(η = 3)。圖 5Β, MBD2siRNA的轉(zhuǎn)染增加了 HUVEC中BCL-2的水平，約為對照組的2. 2倍。圖5C, HUVEC 中MBD2的抑制增加了 eNOS和VEGF-R2的表達(dá)，eNOS表達(dá)的增加和磷酸化的eNOS的增加 有關(guān)(左)，右圖示總eNOS和VEGF-R2的定量分析結(jié)果(η = 3)。圖5D，MBD2缺陷小鼠血 管也顯示出與HUVEC相似的結(jié)果(η = 3)。圖5Ε，抑制HUVEC細(xì)胞MBD2的表達(dá)促進(jìn)了 ρ38 的活化，活化的Ρ38高于對照組1. 3倍。圖6，MBD2結(jié)合于eNOS非翻譯區(qū)和VEGF-R2啟動子高GC含量區(qū)。圖6A，高GC含量區(qū)位于eNOS非翻譯區(qū)。圖6B，eNOS的ChIP分析結(jié)果，PCR擴(kuò)增 純化的總輸入DNA、MBD2抗體及對照抗體所得免疫沉淀物、HUVEC基因組DNA (陽性對照)。 圖6C, VEGF-R2啟動子上2個(gè)CpG島。圖6D, VEGF-R2的ChIP分析結(jié)果。圖7，MBD2抑制eNOS的表達(dá)被限定于內(nèi)皮細(xì)胞。圖7A，TSA消除了 MBD2siRNA對eNOS表達(dá)的影響。圖7B，MBD2的抑制不能誘導(dǎo) Hela細(xì)胞eNOS的表達(dá)，MBD2siRNA的轉(zhuǎn)染及對照組沒有探測到eNOS的表達(dá)，然而TSA卻能 誘導(dǎo)這兩組細(xì)胞eNOS的表達(dá)。圖7C，從MBD2缺陷小鼠分離的脾細(xì)胞不能表達(dá)eNOS JSTSA 能誘導(dǎo)MBD2缺陷小鼠和野生型小鼠分離的脾細(xì)胞表達(dá)eNOS。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人采用SiRNA設(shè)計(jì)法則，設(shè)計(jì)并篩選出一段能夠抑制MBD2基 因表達(dá)的siRNA序列，正義鏈5 ‘ -GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3 ‘；反義鏈 5 ‘ -UAGUAGACAUCGCUCUUGCtt-3 ‘，由Santa cruz生物技術(shù)公司化學(xué)合siRNA,成并成功轉(zhuǎn) 染人類臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；利用基因敲除技術(shù)得到了 MBD2缺陷小鼠用于發(fā)明。以下實(shí) 施例并不僅僅局限于本發(fā)明的范圍，還對本發(fā)明的相關(guān)機(jī)制現(xiàn)進(jìn)行了擴(kuò)展。實(shí)施例一 MBD2siRNA抑制人類臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞MBD2蛋白的表達(dá)人類臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)培養(yǎng)于EBM-2上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí) 將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，接種密度為4X 104，第二天，根據(jù)Lipofectamineanvitrogen， Carlsbad, CA)試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)50、100nmOl/LMBD2SiRNA及對照組。收集轉(zhuǎn)染后 24-48小時(shí)的細(xì)胞，提取蛋白行免疫印跡檢查。蛋白在8% SDS-PAGE膠中分離后轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。在5%脫脂牛奶TBS-T溶液中封閉，膜在4°C MBD2抗體溶液中孵育16小時(shí)，再在室 溫下與二抗孵育1小時(shí)，TBS-T洗滌后，加入ECL試劑，膠片顯影。結(jié)果顯示MBD2siRNA以 劑量依賴的方式抑制MBD2的表達(dá)(圖1)。實(shí)施例二 MBD2siRNA在體外實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)血管生成，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于H2O2誘導(dǎo)的 凋亡為檢測成管，基質(zhì)膠被置于96孔板(100yL/Well)，37°C至少30分鐘，再將已轉(zhuǎn)染 siRNAdOOnmo 1/L) 24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板中(培養(yǎng)液為含2%胎牛血清的EBM-2 培養(yǎng)液)，密度為2X IO4ceIls/孔，于5% C02、37°C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。每4小時(shí)于光 學(xué)顯微鏡下檢查成管情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種4小時(shí)后在MBD2siRNA轉(zhuǎn)染組即可觀察到典型 的成管，而對照siRNA組卻幾乎沒有發(fā)現(xiàn)成管；24小時(shí)后MBD2siRNA轉(zhuǎn)染組的平均成管長 度(10. 4士0. 8謹(jǐn))顯著高于對照組(3. 3 士0. 5謹(jǐn)，圖2A)。為檢測MBD2siRNA對HUVEC增殖的影響，轉(zhuǎn)染siRNA24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞被胰酶消 化后接種于96孔板，密度為5 X IO3細(xì)胞/孔，與標(biāo)記3H的胸苷孵育16小時(shí)，收獲細(xì)胞于 1450 MicroBeta TriLux Microplate Scintillation and Luminescence Counter上計(jì)數(shù)。 結(jié)果表明，與對照組相比，MBD2siRNA的應(yīng)用顯著促進(jìn)了 HUVEC的增生9(圖2B)。為證實(shí)MBD2在細(xì)胞凋亡中所起的作用，轉(zhuǎn)染siRNA24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞被0. 2 % mmol/L H2O2處理24小時(shí)來引導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨后用annexin-V及propidium iodide (PI)染 色，以流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，MBD2siRNA組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(圖2C)。從以上結(jié)果看出，MBD2負(fù)調(diào)節(jié)血管的生成，促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的凋亡。實(shí)施例三以后肢缺血實(shí)驗(yàn)檢測MBD2基因敲除對小鼠后肢灌流恢復(fù)的影響后肢缺血模型的建立小鼠麻醉后在左腹股溝處暴露、分離股動脈近端，用7-0絲 線在股動脈近端打兩個(gè)結(jié)，并用剪刀從兩個(gè)結(jié)之間剪斷股動脈，縫合切口。缺血部位MBD2的表達(dá)取不同時(shí)段左后肢股動脈，提取蛋白行免疫印跡檢測，觀 察MBD2的表達(dá)情況。同時(shí)缺血組織及對側(cè)非缺血組織包埋于OCT中、切片(10 μ m)，行免疫 組化染色，檢測MBD2在血管中的定位。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，在MBD2缺陷小鼠MBD2蛋白沒有表達(dá)(圖3A)；而野生型小鼠 在生理狀態(tài)下僅有低水平的MBD2被檢測到，然而缺血誘導(dǎo)缺血區(qū)域MBD2的表達(dá)逐漸增加，到術(shù)后第四天達(dá)到高峰，然后逐漸降低，第十四天降到一個(gè)相對低的水平(圖3B)。免疫染 色發(fā)現(xiàn)，在非缺血區(qū)MBD2主要位于內(nèi)皮細(xì)胞(⑶31陽性細(xì)胞)，但在缺血區(qū)，隨著新生血管 的形成，大量MBD2表達(dá)于增多的內(nèi)皮細(xì)胞中(圖3C)。小鼠后肢灌流恢復(fù)的評估用PIM 3scanning Laser Doppler imaging system(Perimed, Stockholm, Sweden)在術(shù)后0、2、4、7和14天檢查左后肢灌流恢復(fù)的情況。 平均后肢血流以缺血側(cè)與非缺血側(cè)訊號的比值表示。MBD2缺陷和野生型小鼠在術(shù)后當(dāng)天都 沒有血流訊號，但MBD2缺陷小鼠左后肢在術(shù)后第二天即可檢測到部分血流恢復(fù)訊號，第七 天血流恢復(fù)到50%，第14天血流完全恢復(fù)；而野生型小鼠左后肢在第四天才觀察到血流恢 復(fù)，第7和14天血流僅恢復(fù)到30%和60% (圖3D)。。缺血部位新生血管的形成缺血組織及對側(cè)非缺血組織包埋于OCT中、切片 (ΙΟμπι)，行免疫組化染色，檢測毛細(xì)管(⑶31)和小動脈(平滑肌α-actin)的形成 情況。在MBD2缺陷小鼠缺血區(qū)毛細(xì)管(⑶31)(圖3Ε)和小動脈(平滑肌α -actin) (圖3F)的形成明顯多于野生型小鼠?？筂BD2、⑶31、平滑肌α-actin抗體分別來自于 Millipore(Bedford, MA)> BD pharmingen(San Diego, CA)> Abeam(Cambridge, MA)從以上實(shí)驗(yàn)看出，MBD2的丟失促進(jìn)了缺血區(qū)血管的再生和動脈的形成，改善了左 后肢的灌流恢復(fù)。實(shí)施例四MBD2缺陷小鼠能夠完全免于糖尿病誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙糖尿病模型的建立采用小劑量多次腹腔注射STZ法(STZ，每天50mg/kg，連續(xù)5 天)，誘導(dǎo)8-10周左右大小的MBD2基因敲除小鼠和野生型小鼠，使發(fā)生糖尿病。年齡和性 別匹配的對照小鼠則每天給予腹腔注射檸檬酸鹽溶液。每隔一天小鼠尾部采血，用血糖計(jì) 檢測血糖水平。只有血糖水平超過250mg/dl的小鼠將被用于下一步的研究?；继悄虿?周的動物被處死后，迅速取出胸主動脈，并切為兩段長度為3毫米 的動脈環(huán)，以避免損害內(nèi)皮細(xì)胞層。然后主動脈片段孵育于新鮮的Krebs溶液中(NaCl 115mmol/l, KCl 4. 6mmol/l, KH2P04 1. 2mmol/l, MgS04 1. 2mmol/l, CaC12 2. 5mmol/l, NaHC03 25mmol/l, glucose 11. lmmol/1 and EDTA 0. 02mmol/l ；pH7. 4)，并通以 95% 02 和 5% C02。隨后主動脈片段被固定在四通道肌動描記系統(tǒng)(Catamount，St. Albans，Vermont) 行等距收縮測量。通過它們對血管收縮劑及舒張劑的反應(yīng)能力來評估內(nèi)皮細(xì)胞的功能。氯 化鉀(120mmOl/L)和苯腎上腺素(10_9到10_5mol/L)被用作為血管收縮劑，乙酰膽堿(ACh) (10_9到lO-W/L)和鈉硝普鹽(SNP) (10-9到10-5mol/L)被用作為苯腎上腺素(lO^mol/ L)預(yù)處理過的動脈血管舒張劑。L-nitroarginine-methylester (L-NAME, l(T4mol/L)， L-arginine的競爭者，被用于抑制內(nèi)源性eNOS的活性。在生理和糖尿病狀態(tài)下，氯化鉀或苯腎上腺素引起的血管收縮沒有顯著差別 (圖4A&B)；但是，野生型糖尿病小鼠與非糖尿病小鼠相比，其對乙酰膽堿(ACh，lX10_9至 lX10_5mol/L)誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)明顯受損；與此形成鮮明對比，MBD2缺陷糖尿病小鼠卻顯示 出最大限度的舒張(圖4C)。不過，用L-NAME阻斷內(nèi)源性一氧化氮后，對硝普鈉誘導(dǎo)的舒張 反應(yīng)，MBD2缺陷與野生型糖尿病小鼠及其相似(圖4D)，這表明野生型糖尿病小鼠松弛能力 的下降是由內(nèi)皮功能受損引起的。因此，MBD2的缺失能夠完全保護(hù)動物免于糖尿病誘導(dǎo)的 內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。實(shí)施例五MBD2表達(dá)的抑制活化內(nèi)皮細(xì)胞生存及促血管生成信號
為檢測MBD2表達(dá)的抑制是否活化內(nèi)皮細(xì)胞生存信號通路，轉(zhuǎn)染了 MBD2和對照 siRNA的HUVEC用濃度為0. 2mmol/L的H2O2處理24小時(shí)，其裂解產(chǎn)物被用于免疫印跡來檢 測兩種主要的內(nèi)皮細(xì)胞生存信號 extracellular signal-regulated kinase l/2(ERKl/2) 和 serine-threonine kinase Akt，及 ERK1/2 相關(guān)蛋白 BCL-2 的表達(dá)(ERK1/2 磷酸化BCL-2 而阻止其降解)。結(jié)果表明，Akt，及總ERKlA在轉(zhuǎn)染MBD2siRNA組和對照組的表達(dá)沒有顯 著差異，但磷酸化的ERKl/2(圖5A)及BCL-2(圖5B)的表達(dá)在轉(zhuǎn)染MBD2siRNA組明顯升高。 與野生型糖尿病小鼠相比，MBD2缺陷小鼠血管也顯示出同樣的趨勢。這表明MBD2調(diào)節(jié)內(nèi) 皮細(xì)胞凋亡可能是通過調(diào)節(jié)ERK1/2及BCL-2信號來實(shí)現(xiàn)的。為研究MBD2調(diào)節(jié)血管生成的 機(jī)制，轉(zhuǎn)染了 MBD2和對照siRNA的HUVEC裂解產(chǎn)物被用于免疫印跡來檢測兩種關(guān)鍵的促血 管生成信號eNOS和VEGF-R2及p38絲裂原活化蛋白激酶的表達(dá)。eN0S、VEGF_R2表達(dá)在轉(zhuǎn) 染MBD2siRNA組明顯升高(圖5C)，與野生型小鼠相比，MBD2缺陷小鼠血管也顯示出同樣的 趨勢(圖5D)?；罨说膒38在轉(zhuǎn)染MBD2siRNA組也明顯升高，但p38的總量在兩者之間沒 有差另U (圖5E)。由此可見，MBD2的丟失可能活化細(xì)胞生存及促血管生成信號來提高內(nèi)皮細(xì)胞生存 及血管生成能力。實(shí)施例六，MBD2結(jié)合于eNOS和VEGF-R2啟動子高GC區(qū)為弄清MBD2是否結(jié)合于eNOS和VEGF-R2啟動子高GC區(qū)，染色質(zhì)免疫沉淀 (Chromatin immunoprecipitation, ChIP)用來拖下MBD2/DNA復(fù)合物，按照染色質(zhì)免疫沉 淀分析試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)操作。結(jié)果表明MBD2結(jié)合于eNOS和VEGF-R2啟動子高GC區(qū) (圖6A、B、C、D)，進(jìn)而抑制eNOS和VEGF-R2的轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例七M(jìn)BD2對eNOS轉(zhuǎn)錄的抑制涉及染色質(zhì)重塑，被限定于內(nèi)皮細(xì)胞。為探討MBD2對eNOS轉(zhuǎn)錄的抑制是否涉及染色質(zhì)重塑，加入TSA (HDAC抑制劑)到 轉(zhuǎn)染了 MBD2和對照siRNA的HUVEC，加入DMSO為對照，48小時(shí)后，檢測eNOS的表達(dá)。MBD2 的抑制促進(jìn)了 eNOS的表達(dá)，而這種作用被TSA完全消除了(圖7A)。這表明MBD2對eNOS 轉(zhuǎn)錄的抑制涉及染色質(zhì)重塑。為研究MBD2的抑制是否能促進(jìn)非內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)，Hela細(xì)胞和脾細(xì)胞(從 野生型和MBD2缺陷小鼠分離而來)被用來進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)。在Hela細(xì)胞中，MBD2的抑制沒 有誘導(dǎo)eNOS的表達(dá)，而TSA處理后，轉(zhuǎn)染了 MBD2和對照siRNA的Hela細(xì)胞都能檢測到eNOS 的表達(dá)(圖7B)；在脾細(xì)胞上也得到了相似結(jié)果(圖7C)。這說明MBD2對eNOS轉(zhuǎn)錄的抑制 涉及染色質(zhì)重塑，且被限定于內(nèi)皮細(xì)胞。
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權(quán)利要求
抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于它是一種核酸分子、遺傳結(jié)構(gòu)、siRNA分子以及包含以上一個(gè)或多個(gè)的復(fù)合物，能導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于抑制MBD2表達(dá) 的抑制劑是siRNA，其核苷酸序列為正義鏈5 ‘ -GCAAGAGCGAUGUCUACUA-3 ‘；反義鏈 5 ‘ -UAGUAGACA UCGCUCUUGC-3 ‘；或其3 ‘末端有兩個(gè)懸掛堿基tt，核苷酸序列為正義鏈 5' -GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3‘；反義鏈5' -UAGUAGACA UCGCUCUUGCtt-3‘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于抑制MBD2表達(dá)的抑 制劑是siRNA，與MBD2的mRNA序列同源互補(bǔ)，但其序列不同于序列1、2、3、4 ；或前述siRNA 分子3'末端有兩個(gè)懸掛堿基tt。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于抑制MBD2表達(dá)的抑 制劑是siRNA，其特征為權(quán)利要求2和3所述的siRNA經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈siRNA分子，所述 化學(xué)修飾包括對連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部分修飾或用一個(gè)硫原子取代磷酸二酯鍵的 非橋氧原子；化學(xué)修飾包括對這些siRNA分子核酸戊糖2位上的OH作的化學(xué)修飾和改變， 化學(xué)修飾包括對siRNA分子堿基的修飾或其他親脂性基因修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于抑制MBD2表達(dá)的抑 制劑是一種核酸分子，包含7個(gè)或以上與哺乳動物MBD2mRNA同源互補(bǔ)的連續(xù)核苷，能抑制 MBD2的表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于抑制MBD2表達(dá)的抑 制劑是一種遺傳結(jié)構(gòu)，包含RNA分子、DNA分子、質(zhì)粒、載體、病毒以上核酸分子，能抑制MBD2 的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制MBD2表達(dá)的抑制劑，其特征在于抑制MBD2表達(dá)的抑 制劑是包含以上一個(gè)或多個(gè)抑制劑的復(fù)合物，能抑制MBD2的表達(dá)。
8.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述MBD2抑制劑，其特征是在預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能 障礙相關(guān)疾病藥物和制劑的制備上的應(yīng)用。
9.一種應(yīng)用權(quán)利要求8所述MBD2抑制劑，其特征是所制備的藥物或制劑在預(yù)防和治 療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
抑制MBD2表達(dá)的抑制劑及其應(yīng)用，本發(fā)明涉及能在體內(nèi)及體外抑制甲基化CpG結(jié)合域蛋白2表達(dá)的抑制劑，包括核酸分子、遺傳結(jié)構(gòu)、siRNA分子以及包含以上一個(gè)或多個(gè)的復(fù)合物，能導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，抑制MBD2的表達(dá)。抑制MBD2表達(dá)的抑制劑是siRNA，其核苷酸序列為正義鏈5′-GCAAGAGCGAUGUCUACUA-3′；反義鏈5′-UAGUAGACAUCGCUCUUGC-3′；或其3′末端有兩個(gè)懸掛堿基tt，核苷酸序列為正義鏈5′-GCAAGAGCGAUGUCUACUAtt-3′；反義鏈5′-UAGUAGACAUCGCUCUUGCtt-3′。本發(fā)明在預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病中的應(yīng)用，為制備以MBD2為作用靶點(diǎn)的、預(yù)防和治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的選擇。
文檔編號A61K48/00GK101914541SQ201010248718
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者余其林, 王從義 申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院