專利名稱：Hiv-1病毒膜融合抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的預(yù)防與 治療領(lǐng)域，特別涉及HIV病毒膜融合抑制劑。
背景技術(shù)：
(Acquired Immunodefeciency Syndrome, AIDS), 艾滋病，是一種后天獲得性人免疫缺陷疾病，給中國和全世界都帶來了嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì) 問題。從前對付艾滋病最有效的方法是被稱為“雞尾酒療法”的“高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療 法”(HAART)，而現(xiàn)在HIV病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過程成為抗擊HIV病毒戰(zhàn)勝艾滋病的熱門靶點(diǎn) (Jiang，S.，Lin, K.，Strick, N. & Neurath, A. R. HIV-Iinhibition by a peptide. Nature 365,113 (1993) ；Liu, S., Wu, S. & Jiang, S.HIV entry inhibitors targeting gp41 :from polypeptides to small-molecule compounds. Curr Pharm Des 13，143-162 (2007))。 HIV-I病毒表面的膜蛋白gp41在感染靶細(xì)胞的過程中起著介導(dǎo)膜融合的關(guān)鍵作用，而 且還介導(dǎo)了病毒和一些宿主細(xì)胞蛋白的相互作用。這些相互作用可能影響病毒感染進(jìn) 禾呈(Moore，P·L et al· Nature of nonfunctional envelope proteins on the surface of human immunodeficiency virus type LJ Virol 80，2515-2528 (2006) ；Jiang，S. et al. N-substituted pyrrole derivatives as novel human immunodeficiency virus type 1 entry inhibitors that interfere with the gp41 six-helix bundle formation and block virus fusion. Antimicrob Agents Chemother 48，4349-4359 (2004))。國內(nèi)外對于gp41的蛋白結(jié)合性質(zhì)和功能的研究一直沒有中斷過。早期的研究集 中在人工合成NHR(N末端七肽重復(fù)序列)或者CHR(C末端七肽重復(fù)序列)多肽上面。在2003 年，類似于gp41 CHR區(qū)域的DP178(T20)作為膜融合抑制劑類藥物Enfuvotide (Roche)成功 上市，標(biāo)志抗HIV的新時(shí)代的來臨。T20對HIV-I的不同毒株具有廣泛的中和活性，尤其是 那些對傳統(tǒng)治療手段具有抗藥性的突變毒株。然而，T20的抗藥突變株也不斷被發(fā)現(xiàn)(Wei， X. et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20)monotherapy. Antimicrob Agents Chemother 46， 1896-1905 (2002) ；Lu，J. et al. Rapid emergence of enfuvirtide resistance in HlV—l—infected patients :results of a clonal analysis. JAcquir Immune Defic Syndr 43，60-64(2006))，因此需要更好的新穎的膜融合抑制劑的問世。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種分離的肽，其抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合，其特征在于所述 肽包含氨基酸序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO :3)。在一個(gè)方面，所述肽包含選自如下一組中的氨基酸序列(a) SEQ ID N0:1所示的 氨基酸序列；(b) SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；(c)與(a)或(b)具有至少95%同源性 的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，所述肽(a)由SEQ ID NO 1或2所示的氨基酸序列組成；或者(b) 由(a)中的氨基酸序列經(jīng)過修飾的氨基酸序列組成且具有抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合的活性。本發(fā)明還提供了一種分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明所述分離的肽。本發(fā)明還提供了 一種表達(dá)載體，其包含本發(fā)明所述分離的核酸分子。本發(fā)明還提供了一種分離的重組細(xì)胞，其包含本發(fā)明所述的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或疫苗，其包含本發(fā)明的分離的肽、分離的核酸 分子、表達(dá)載體和/或重組細(xì)胞以及任選存在的藥物可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述分離的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載體或重組細(xì)胞在 制備用于抑制或預(yù)防HIV-I病毒感染的疫苗或藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的分離的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載體或重組細(xì)胞 作為藥物的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種抑制或預(yù)防HIV-I感染的方法，包括給予被HIV-I病毒感染 或有被HIV-I病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的對象施用本發(fā)明所述的分離的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載 體、重組細(xì)胞或藥物組合物或疫苗。本發(fā)明還提供了制備具有SEQ ID NO :1或2所示氨基酸序列的肽的方法，包括步 驟(a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求4的肽，裂解細(xì)胞，收集上清，任選將上清過濾；(b)將 上清流經(jīng)親和柱；(c)加入PreScission蛋白酶溶液，反應(yīng)一段時(shí)間；(d)用酶切緩沖液洗 脫并收集洗脫液。附圖簡述

圖1 純化后的P20蛋白，SDS-PAGE顯示其分子量、濃度和純度。圖2 利用gp41介導(dǎo)膜融合的細(xì)胞模型來檢測P20的抑制活性，GST蛋白、ADS-Jl 和C 34作為對照蛋白。圖3 檢測P20蛋白的細(xì)胞毒性，其中MT-2細(xì)胞和TZM_bl細(xì)胞是活病毒抑制實(shí)驗(yàn) 中用到的細(xì)胞。 圖4 :P20以及突變蛋白P20-A、P20-G、P20-H和P20-I抑制HIV實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株Bal
的結(jié)果。發(fā)明詳細(xì)描述除非特別指出，本文使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含 義。另外除非特別需要，則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。前述技術(shù)和方法通 常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的及在本說明書引用的參考文獻(xiàn)所述的常規(guī)方法進(jìn)行。見例如并入作參 %白勺 Sambrook et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))所述。本文弓丨用的所有參 考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請、文章、教科書等及其中引用的參考文獻(xiàn)在此均以其全部援引 加入本文。本發(fā)明人通過篩選眾多gp41結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)一種由32個(gè)氨基酸組成的肽P20 (SEQ ID NO 1)以及其氨基末端突變體P20-A(SEQ ID NO :2)可以強(qiáng)烈地和HIV-I gp41核心區(qū) 域6螺旋結(jié)構(gòu)相互作用，并且在低濃度下阻止HIV-I介導(dǎo)的膜融合細(xì)胞模型，廣泛抑制各種 類型HIV-I實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株和原代病毒株。通過對P20的氨基酸序列進(jìn)行突變，本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)P20中的氨基酸序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO 3)對于P20抑制HIV-I的活性是重要的。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合的分離的肽，其包含氨基酸序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO :3)?；蛘?，所述肽(a)由SEQ ID NO :3所示氨基 酸序列組成，或者(b)由(a)中的氨基酸序列經(jīng)過修飾例如經(jīng)過取代、缺失或添加一或多個(gè) 氨基酸的氨基酸序列組成。本文所用術(shù)語“肽”，“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物，其 包含經(jīng)肽鍵結(jié)合的9個(gè)或更多個(gè)氨基酸。聚合物可以是線性的，分枝的或環(huán)狀的，可包含天 然存在的和/或氨基酸類似物，它可被非氨基酸間斷。通常，若氨基酸聚合物是長的(例如 超過50個(gè)氨基酸殘基)，其優(yōu)選稱為多肽或蛋白質(zhì)，但是若其是50個(gè)氨基酸長或更短，優(yōu)選 稱為“肽”。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合的分離的肽，其 包含(1)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列；(3)與SEQ ID NO 1-2具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性的氨基酸序 列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合的分離的肽，所 述肽(a)由SEQ ID NO :1或2所示的氨基酸序列組成；或者(b)由(a)中的氨基酸序列經(jīng) 過修飾例如經(jīng)過取代、缺失或添加一或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列組成且具有抑制HIV-I病 毒介導(dǎo)的膜融合的活性。本文中所述肽可以由任何合適的現(xiàn)有技術(shù)方法制備，例如化學(xué)合成、重組表達(dá)等 等。對此可以參見例如 Sambrook et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001))以及 Blackwell Scientific Publications 出版、Nicholson 編輯的 “P印tide Synthesis” 中 Atherton 和 Sh印pard 的第 9 章 “P印tide Synthesis” 所述。在本文中，所述“修飾”優(yōu)選是本領(lǐng)域所熟知的保守序列修飾，包括氨基酸取代、添 加或缺失。氨基酸修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如在編碼蛋白的核酸中進(jìn) 行定點(diǎn)誘變、分子克隆、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變。保守氨基酸取代包括 其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基取代的那些。本領(lǐng)域已經(jīng)確定 了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、 精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，無電荷的極性側(cè)鏈氨基酸 (例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非極性側(cè)鏈氨基 酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分 支的側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯 丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知也可以使用除了上述之外的其他類別氨基酸家族。 相似的較小變化也包括氨基酸缺失或插入，或者這二者。使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序可 以找到關(guān)于確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不消除其免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法例如Gap或者Bestfit可用于優(yōu)化對比氨基酸序列以對 比及限定相似或相同的氨基酸殘基。例如，本文上述取代一或多個(gè)氨基酸可以是將SEQ ID NO :1、2或3中氨基酸殘基 取代為具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基，例如將SEQ ID NO :1中第5位的氨基酸殘 基Gly取代為Ala，將SEQ ID NO 2中第位5的氨基酸殘基Gly取代為Ala，或者將SEQ ID NO :3中第6位的氨基酸殘基Gly取代為Ala。
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或者，本文上述缺失一或多個(gè)氨基酸可以是缺失SEQ ID NO :1中第1位的氨基酸 殘基，SEQ ID NO 2中第1位的氨基酸殘基，或者SEQ ID NO 3中第9位的氨基酸殘基。或者，本文上述添加一或多個(gè)氨基酸可以是在SEQ ID NO :1中第1位添加氨基酸 殘基Ala，在SEQ ID NO :2中第1位添加氨基酸殘基Ala，或者在SEQ ID NO :3中第9位添 加氨基酸殘基Ala。本文所用術(shù)語“抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合”是指抑制HIV-I病毒與靶細(xì)胞融 合的活性。本文所用術(shù)語“同源性”是指對應(yīng)于兩個(gè)蛋白質(zhì)鏈中位于相同或類似位置的相同 氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62陣列計(jì)算同源性百分比，該算法可在NCBI 網(wǎng)站(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)獲得。優(yōu)選所述同源物是功能性同源物，即其顯示 顯著的相似性(例如在氨基酸水平大約50%序列相同性)并且如其相應(yīng)蛋白質(zhì)一樣執(zhí)行相 同功能。至少大約60 %，至少大約70 %，至少大約80 %、至少大約90 %、至少大約95 %、至 少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%或更高的序列相同性的功能性 同源物是優(yōu)選的功能性同源物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明所述分離的 肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子具有SEQ ID NO :4或5所示序列或其簡并序列。在本文中，術(shù)語“核酸”，“核酸分子”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互換使用，定 義任何長度的多聚物，如聚脫氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA，基因組DNA，質(zhì)粒，載體，分離 的DNA和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA)或混合的聚核糖-聚脫 氧核糖核苷酸。它們包含單鏈或雙鏈，線性或圓形，天然或合成的多核苷酸。對于指定的核酸而言，“編碼”或者“被編碼的”是指包含用于翻譯為指定蛋白的信 息。編碼蛋白質(zhì)的核酸在核酸的翻譯區(qū)內(nèi)可包含非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或者可以缺少 這種插入的非翻譯序列(例如在cDNA中)。編碼蛋白的信息由使用密碼子而指定。本文所用術(shù)語“分離的”是指如核酸或者蛋白質(zhì)等材料，其與其天然存在的環(huán)境相 分離。所述分離的材料任選包含在其天然環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)的材料。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其包含本發(fā)明的分離的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子也可以包含在載體或者其它克隆載體如質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、 粘粒或人工染色體中。如本文所用，“表達(dá)載體”是重組或者合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有 一系列指定核酸元件，所述核酸元件允許特定核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，例如表達(dá)載體除了 編碼要表達(dá)的核酸序列以外還可包括衍生自與用于表達(dá)的宿主相容的復(fù)制和控制序列以 及賦予轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可選擇表型的選擇標(biāo)記。所述核酸構(gòu)建體可以被摻入質(zhì)粒、染色體、線粒 體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或者核酸片段中。本領(lǐng)域已知且可商購許多合適的表達(dá)載體，例如原 核表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體、植物細(xì)胞表達(dá)載體。在 一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述表達(dá)載體是pGEX-6p-2 (Amersham Biosciences)?！八拗骷?xì)胞”是指含有載體且支持該載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是 原核細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞，或者真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞或者哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種分離的重組細(xì)胞，其包含本發(fā)明所述表達(dá)載 體。
如本文所用，“重組細(xì)胞”是指通過導(dǎo)入異源核酸而修飾的細(xì)胞，或者所述細(xì)胞源 于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的該細(xì)胞內(nèi)未以相同 形式發(fā)現(xiàn)的基因，或者由于有意的人為干預(yù)而表達(dá)天然基因，否則該天然基因會(huì)異常表達(dá)、 低表達(dá)或者根本不表達(dá)的。如本文所用的術(shù)語“重組”不涵蓋細(xì)胞通過天然發(fā)生的事件(例 如自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)位)所產(chǎn)生的改變，例如那些沒有有意的人為干預(yù)而發(fā)生 的改變。本文所述重組蛋白表達(dá)宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域使用的任何真核細(xì)胞或原核細(xì)胞， 例如HEK293，HEK293T，CHO, S2，大腸桿菌細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主是表達(dá)P20 或P20A基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組蛋白表達(dá)細(xì)菌如R0SSETA菌株。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或疫苗，其包含本發(fā)明所述分離 的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載體和/或重組細(xì)胞以及任選存在的藥物可接受的載體或賦 形劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述分離的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載體 或重組細(xì)胞在制備用于抑制或預(yù)防HIV-I病毒感染的疫苗或藥物組合物中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述分離的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載體 或重組細(xì)胞作為藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的藥物組合物或藥物包括例如適于口服、直腸、鼻、局部、腹膜和胃腸外 (包括肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi))給予的那些組合物?；蛘咄ㄟ^吸入或吹入給予的那些組合物。 可以局部或全身性給予。優(yōu)選通過口服或靜脈內(nèi)途徑給予。本發(fā)明的藥物組合物包括本領(lǐng) 域確定的任何藥物劑量形式，例如膠囊、微囊、扁囊劑、丸劑、片劑、粉末、小丸劑(pellet)、 多顆粒制劑(例如珠、顆粒或晶體)、氣霧劑、噴霧劑、泡沫、溶液、分散劑、酊劑、糖漿、酏劑、 懸浮液、油包水乳狀液如軟膏，及水包油乳狀液如乳劑、洗劑和香脂。本發(fā)明的所述藥物組合物或藥物可以包含藥物可接受的載體、賦形劑和/或稀釋 劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、刺槐橡膠、 藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥基苯 甲酸甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油、甘油、海藻酸鈉、鹽水和水，也可以包含添加 劑如充填劑、結(jié)合劑、增濕劑、助流劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、乳化劑及另外的溶劑或者增溶劑或 者實(shí)現(xiàn)儲存效應(yīng)的物質(zhì)。對于口服施用，藥學(xué)上可接受的載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩解 劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑以及芳香劑。對于注射制劑，藥學(xué)上可 接受的載體可包括緩沖劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對于局部施用制劑， 藥學(xué)上可接受的載體可包括基質(zhì)、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。將肽或核酸分子配制為藥物組合物可參見Gennaro，A. L. and Gennaro， A. R. (2000)Remington :The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed. , Lippincott Williams & Wilkins， Philadelphia， PA ;Crowder， Τ· Μ· et al. (2003)A Guide to Pharmaceutical Particulate Science. Interpharm/CRC, Boca Raton, FL ；禾口 Niazi, S. K. (2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,CRC Press,Boca Raton, FL0在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種抑制或預(yù)防HIV-I感染的方法，包括給予被 HIV-I病毒感染或有被HIV-I病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的對象施用本發(fā)明的分離的肽、分離的核酸分 子、表達(dá)載體、重組細(xì)胞、藥物組合物或疫苗。
本發(fā)明使用的術(shù)語“施用”表示通過合適的方法將預(yù)定量的物質(zhì)導(dǎo)入病人。本發(fā) 明的分離的肽、分離的核酸分子、表達(dá)載體、重組細(xì)胞、藥物組合物或疫苗可以通過任何通 常途徑施用，只要其能到達(dá)所希望的組織?？梢钥紤]多種施用方式，包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌 內(nèi)、皮下、透皮、口服、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)，但是本發(fā)明不限于這些舉例說明的施用方 式。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明所述肽例如具有SEQ ID NO :1或2所 示氨基酸序列的肽的方法，包括步驟(a)在宿主細(xì)胞例如R0SSETA菌株中表達(dá)所述肽，裂 解細(xì)胞，收集上清，任選將上清過濾，例如使用0. 45 μ m濾膜過濾上清；(b)將上清流經(jīng)親和 柱，例如谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione-S印harose)4B親和柱；(c)加入PreScission 蛋白酶(PP)酶溶液，反應(yīng)一段時(shí)間(例如在1. 5ml PP酶切緩沖液中加入10 μ g PP酶配制 PP酶溶液(濃度為6. 67 μ g/ml)，在室溫反應(yīng)2h或在4°C反應(yīng)過夜)；(d)用酶切緩沖液洗 脫并收集洗脫液。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種細(xì)胞培養(yǎng)以及表達(dá)、收集、純化以及檢測重組蛋白的技 術(shù)，其均可以用于本發(fā)明。對此可參見例如J. Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)和 F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988), Ed Harlow andDavid Lane(editors)。
實(shí)施例本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā) 明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng) 域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本 發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改 變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1、P20和P20-A的制備1. 1 材料PCR擴(kuò)增的酶及dNTP 購自Takarra公司；PCR擴(kuò)增引物由上海生工公司合成，經(jīng)HAP方法純化；Takara限制性內(nèi)切酶(BamH I、Xho I)購自大連寶生物公司；TakaraT4連接酶購自大連寶生物公司；18% Tris-glycine 凝膠購自 Invitrogen 公司(Carlsbad，CA)；谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B親和柱購自Amersham公司(Sweden)；原核表達(dá)載體pGEX-6p-2，PreScission 蛋白酶(PP 酶)購自 Amersham Biosciences (瑞典)。大腸桿菌DH5和BL21購自Invitrogen。其余常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，除非 另外指明。1. 2實(shí)驗(yàn)步驟1. 2. 1質(zhì)粒構(gòu)建
為獲得重組蛋白P20(HPSSGINAEWPLWPGEAGWGRLEGRRTYEAEI(SEQ ID N0:1))禾口 P 20-A (AAASGINAEffPLffPGEAGffGRLEGRRTYEAEI (SEQ ID NO 2)),我們構(gòu)建了 pGEX_6p_P20 和 pGEX-6p-P20-A重組質(zhì)粒，它們均為將PCR擴(kuò)增的P20和P20-A的DNA序列經(jīng)BamH I和Xho I酶切后連接入用相同酶切的pGEX-6p-2載體后獲得。合成P20和P20-A的DNA序列，分別如下所示P20 DNA cacccaagcagtggtatcaacgcagagtggccattatggccgggggaagccgggtggggcaggctggaa ggaagacgaacctacgaagcagagatc(SEQ ID NO 4)P20-A DNA gcagcagcaagtggtatcaacgcagagtggccattatggccgggggaagccgggtggggcaggctggaa ggaagacgaacctacgaagcagag(SEQ ID NO 5)用于P20DNA的PCR引物為P20-P1 :aga ggatcc cacccaagcagtggtatc(SEQ ID NO 6)P20-P2 :aga ctcgag gatctctgcttcgtaggt(SEQ ID NO 7)用于P20-A DNA的PCR引物為P20-A-P1 :aga ggatcc gcagcagcaagtggtatc(SEQ ID NO 8)P20-A-P2 :aga ctcgag gatctctgcttcgtaggt(SEQ ID NO 9)使用P20或P20-A的DNA序列為模板，分別以引物對P20-P1和P20-P2、或 P20-A-P1 和 P20-A-P2 通過常規(guī) PCR (PCR 條件-MV IOmin, 30 個(gè)循環(huán) 94°C、30s，55°C、30s， 72°C、30s，最后72°C 5min)擴(kuò)增基因片段，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離并回收PCR擴(kuò)增 片段，所述片段的上游帶BamHI酶切位點(diǎn)，下游帶有XhoI酶切位點(diǎn)。PCR得到的P20或P20-A 片段通過BamH I+Xho I雙酶切，然后連接到同樣利用BamH I+Xho I雙酶切的pGEM_6p-2 載體，獲得pGEM-6p-P20或pGEM-6p-P20_A重組表達(dá)質(zhì)粒。 3.2.2重組蛋白的表達(dá)提純將重組質(zhì)粒pGEM-6p_P20或pGEM-6p-P20_A加入感染態(tài)Rosseta菌株 (Invitrogen)中，冰水浴30min后放入42°C水浴熱激1. 5min，然后直接涂布在LB培養(yǎng)基 平板中37°C培養(yǎng)過夜。然后挑取單斑，在LB培養(yǎng)基中37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，第二天 以1 50轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)條件為在細(xì)菌生長到0D600約 0. 6，加入IPTG至終濃度為0. ImM, 30°C誘導(dǎo)6h，10，OOOrpm離心收獲細(xì)菌，用PBS洗滌一次， 菌沉淀于-20°C凍存(冰凍有利于細(xì)菌的裂解)。GST融合蛋白純化步驟如下1). 500ml LB培養(yǎng)基中的細(xì)菌沉淀可以在20ml冰冷的PBS(pH7. 2)中重懸，加入 溶菌酶粉末 20mg，加入 2ml 10% Triton X-100 PBS 溶液，力口入 100 μ 1 5mg/ml DNase 和 RNase，冰浴，快速攪拌30min至溶液不再粘稠。2).冰浴超聲裂解，超30s，停30s，共十次。20，OOOrpm離心20min，收集上清。3). 0. 45 μ m濾膜(江晨生物)過濾上清，濾液用于親和純化重組蛋白。4).準(zhǔn)備谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B親和柱，用Triton X-100 PBS (pH7. 2)溶液 洗滌1. 5ml柱材后，將步驟3中過濾的上清流過親和柱，流速為30ml/h。重復(fù)上樣一次。5). 50ml 0. 8M NaCl PBS(pH7. 2)溶液洗柱，去除大部分非特異性吸附的蛋白，最后用1倍柱床體積的PBS除去高鹽溶液。6).換用 PreScission 蛋白酶(PP)酶切緩沖液(50mM Tris HCl, 150mMNaCl, ImM DTT, ImM EDTA，pH7. 0)平衡親和柱。然后用1. 5ml該緩沖液稀釋10 μ g PP酶，加入放干溶 液且底端封閉后的親和柱中，吹打均勻，室溫反應(yīng)2h，或4°C過夜。7).打開親和柱底部端口，收集反應(yīng)液，并加入1倍柱床體積的酶切緩沖液洗柱一 次，收集洗液。反應(yīng)液和洗液中就是切下的蛋白P20或者P20-A。PP酶也是GST融合蛋白， 沒有酶切位點(diǎn)，因此它可以結(jié)合在親和住上不被洗下。8).使用18% Tris-glycine凝膠，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白(結(jié)果見圖1)， 然后可以透析到不同需求的溶液中，4°C可以長期放置。9).再生親和柱(按照產(chǎn)品說明書)。可用6M的鹽酸胍沖洗或浸泡15min。處理 后的柱材用20%乙醇保存。實(shí)施例2 :P20抑制細(xì)胞融合2. 1 材料細(xì)胞系3T3. Τ4. CXCR4細(xì)胞系可穩(wěn)定表達(dá)⑶4和CXCR(HIV包膜蛋白的受體和輔 助受體)。CHO-WT細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIV-1HXB2 Env表達(dá)質(zhì)粒ρΕΕ14，可表達(dá)HIV-1HXB2 Env gpl60o 所述細(xì)胞系購自 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。GMEM-S選擇性培養(yǎng)基的配制。1升GMEM培養(yǎng)基包含914ml去離子水，40g MEM w/o L-谷氨酰胺(Gibco)，36ml 7. 5%碳酸氫鈉(Gibco)，20ml 50倍濃縮的核苷貯液，IOml 100倍濃縮的谷氨酸+天冬酰胺 貯液，IOml IOOmM丙酮酸鈉(Gibco)，IOml非必需氨基酸(Gibco)。50倍濃縮的核苷貯液配制方法如下分別稱取35mg腺苷、35mg鳥苷、35mg胞苷、 35mg尿苷、12mg胸苷，加入IOOml去離子水，攪拌溶解，分裝凍存于_4(TC冰箱中。100倍濃縮的谷氨酸+天冬酰胺貯液配置方法如下分別稱取600mg L-谷氨酸 (Gibco), 600mg L-天冬酰胺(Gibco)，加入IOOml去離子水溶解，分裝凍存于_40°C冰箱中。GMEM培養(yǎng)基配好以后，無菌條件下過濾，避光保存于4°C冰箱中。GMEM-S培養(yǎng)基 需要在配好的GMEM培養(yǎng)基中加入400 μ M蛋氨酸亞砜酰亞胺(methionine sulfoximine, MSX)；建議預(yù)先配制18mg/ml的MSX貯液，溶于GMEM培養(yǎng)基中，過濾后保存于_20°C冰箱中。以上所用實(shí)驗(yàn)試劑除特別說明外，均為Sigma公司產(chǎn)品。CHO-WT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的GMEM-S培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫，含 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。2.2實(shí)驗(yàn)步驟3T3. T4. CXCR4細(xì)胞用EGTA消化液(0. 5mM)消化收集，并用GMEM-S培養(yǎng)基洗滌充 分分散，轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔，30分鐘后細(xì)胞貼壁鋪單層。經(jīng)丁酸鈉(ImM)刺激22小時(shí)的CHO-WT細(xì)胞用EGTA消化液(0. 5mM)消化收集，并 用GMEM-S培養(yǎng)基洗滌充分分散，計(jì)數(shù)后分裝到無菌的1. 5ml離心管中，每管3 X IO4個(gè)，加 入適當(dāng)稀釋度的重組蛋白/肽，終體積150μ 1，37°C溫育30分鐘。CHO-WT細(xì)胞與樣品(P20或其它對照抑制劑例如GST蛋白、ADS-Jl和C 34(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program))溫育后將混合物力口入已鋪滿 3T3. T4. CXCR4的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
培養(yǎng)24小時(shí)后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。每孔計(jì)數(shù)2次，取平均值。重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn) 取平均值。樣品抑制率=(1-樣品孔中合胞體的數(shù)目/陰性孔中合胞體的數(shù)目)X100%。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果P20在此方法下檢測，IC50 = 0. 108 μ Μ,具有很高的抑制率(見圖2)。IC50是指樣 品抑制率為50%時(shí)抑制劑的濃度。實(shí)施例3 :Ρ20和Ρ20-Α抑制HIV-1病毒株3. 1 材料HIV-I 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株(NL4-3、ΙΙΙΒ、Bal)及檢測用細(xì)胞(TZM-bl、MT-2)購自 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。焚光素酶檢測試齊Ll盒購自 Promega。 HIV-I 原代病毒株(94UG103 (A, X4R5)，92RW008 (A, R5)，92US657 (B, R5)，92BR014 (B, X4R5)， 93MW959(C, R5)，92IN101(C，R5)，92BR025 (C，R5)，94UG118 (D，R5)，92UG001 (D，X4R5)， 92TH009(A/E, R5)，92TH023 (E，R5)，93BR020 (F，X4R5)，RU570 (G, R5)，BCF02 (0, R5))根據(jù) Li, L. et al. , "3-hydroxyphthalic anhydride-modified chicken ovalbumin exhibits potent and broad anti—HIV—l activity :a potential microbicide for preventing sexual transmission of HIV-1，，，Antimicrob Agents Chemother 54:1700-11(2010)所 述方法分離并檢驗(yàn)。3.2實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株的檢測方法取狀態(tài)良好的TZM-bl細(xì)胞100μ 1，濃度約為IX IO5個(gè)/ml，在DMEM培養(yǎng)基中 37°C,5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。將100倍TCID5tl (50%的組織感染劑量)的病毒感染細(xì)胞，同時(shí)加入指定濃度的抑 制劑(P20, P20-A或者T-20)，然后37°C,5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。在感染的第四天后收集細(xì)胞，然后用50μ 1的細(xì)胞裂解液(sigma)裂解。利用熒 光素酶檢測試劑盒檢測。用熒光計(jì)測定讀數(shù)。利用CalcuSyn 軟件(BI0S0FT)計(jì)算 IC5tl 的值。3. 3原代病毒株的檢測方法RPMI 1640培養(yǎng)基加10%血清(Sigma)來培養(yǎng)MT-2細(xì)胞。利用100倍TCID5tl (50%的組織感染劑量)的原代病毒來感染在96孔板中200 μ 1 培養(yǎng)基中密度為IX IO4個(gè)/ml的MT-2細(xì)胞。接著加入指定濃度的抑制劑(P20，P20-A或 者 T-20) ,37°C,5% CO2 培養(yǎng)過夜。去掉培養(yǎng)上清，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后的第四天，從孔中吸出100μ 1培養(yǎng)上清，加入5%體積的Triton-XlOO，然 后利用ELISA方法(威格拉斯)檢測其中的p24抗原量。利用CalcuSyn軟件計(jì)算IC5tl的值。結(jié)果見表1_3。表1 :P20和P20-A蛋白的抑制實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株的結(jié)果。對3株廣泛研究的病毒株， P20和P20-A均表現(xiàn)出了低微摩量級的抑制力。
多肽抑制HIV-I不同病毒株IC50 (μΜ)
0.68±0.37 表2 :P20和P20-A對T20抗性病毒株的抑制結(jié)果?？梢钥闯?，這2個(gè)多肽對T20 無法抑制的病毒株都表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抑制力。
HIV-I毒株
表型
HIV-1 NL4-3(36G) N42S HIV-1NL4-3(36G) V38A/N42D HIV-1 NL4-3(36G) V38E/N42S
T20 敏感株 0.02±0.01 1.32±0.80 0.81±0.08 T20 抗藥株 0.32士0.05 1.11±0.30 0.73±0.09 T20 抗藥株 9.62±2.60 2.31士0.70 0.95士0.05 表3 :P20和P20-A對不同的HIV-I病毒株抑制結(jié)果?？梢钥闯?，這2個(gè)多肽對于 不同的HIV-I亞型毒株都存在廣泛的抑制活性。
HIV-I毒株(亞型，
輔受體嗜性)
IC50 (μΜχ平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)
94UG103 (A, X4R5)5.24±0.052.19 土 0.080.027±0.00792RW008 (A, R5)9.33 士 1.514.96±0.350.021±0.0192US657 (B, R5)4.20±0.831.89 士 0.160.105±0.0192BR014 (B, X4R5)3.79±0.531.63 士 0.120.058士 0.1293MW959 (C, R5)2.99±0.071.57±0.040.009±0.00292IN101 (C, R5)4.79 士 0.192.94±0.110.022士 0.00592BR025 (C, R5)4.86±0.851.72±0.170.011±0.00794UG118(D’R5)32.9 土 17.613.1±0.520.927±0.06192UG001 (D,X4R5)10.5 土 1.734.43±0.280.123 士 0.07292TH009 (A/E, R5)4.69±0.482.79±0.090.087±0.01292TH023 (E, R5)41.5±10.923.2 士 0.330.487±0.07893BR020 (F, X4R5)13.6 士 2.347.25±1.690.093±0.025RU570 (G, R5)16.2±4.107.87±2.010.116±0.021BCF02 (0, R5)10.2±1.124.52±0.140.063±0.015
實(shí)施例4 :Ρ20的細(xì)胞毒性 4. 1材料 ΜΤ-2 細(xì)胞和 TZM-bl 細(xì)胞均購自 NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram。4. 2方法步驟細(xì)胞毒性利用經(jīng)典的XTT比色法進(jìn)行檢測(參見Jiang，S. B.，et al.， “Enhancement of human immunodeficiency virus type 1 infection by antisera to peptides from the envelope glycoproteins gpl20/gp41，，· J Exp Med 174 1557-63(1991))。簡而言之，在96孔板中將100 μ 1不同濃度的P20蛋白加入到100 μ 1靶 細(xì)胞中(IO5細(xì)胞/ml)。在37°C孵育4天之后，加入50μ 1的XTT溶液(lmg/ml的XTT和 0. 02μ M的硫酸甲酯吩嗪)。4小時(shí)之后，檢測450nm波長下的吸光度，然后計(jì)算細(xì)胞毒性。4.3 結(jié)果如圖3所示，P20沒有細(xì)胞毒性。實(shí)施例5 確定P20的核心9肽序列為了確定9個(gè)氨基酸殘基序列WGRLEGRRT(SEQ ID NO :3)是P20中發(fā)揮抑制作用 的核心序列，構(gòu)建了 3個(gè)突變蛋白P20-G、P20-H和P20-I，其序列分別是P20-G=HPS SGI NAE WPL WPG EAG AAA LEG RRT YEA EI(SEQ ID NO 10)P20-H :HPS SGI NAE WPL WPG EAG WGR AAA RRT YEA EI(SEQ ID NO 11)P20-I :HPS SGI NAE WPL WPG EAG WGR LEG AAA YEA EI(SEQ ID NO 12)然后如實(shí)施例3 "3. 2實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株的檢測方法”所述，利用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株Bal檢 測P20、P20-A、P20-G、P20-H和P20-I抑制病毒的能力。5.3 結(jié)果如圖4所示，與P20和P20-A明顯不同，在核心9肽序列WGRLEGRRT (SEQ ID NO 3) 中具有突變的P20-G、P20-H和P20-I都喪失了抑制病毒侵染的能力，即喪失了抑制活性，而 在末端具有突變的P20-A沒有喪失抑制活性，證明這9個(gè)氨基酸殘基對于蛋白抑制病毒的 能力起著至關(guān)重要的決定作用。本發(fā)明所述肽(例如P20和P20-A)具備作為新型抑制劑的優(yōu)勢。首先，其由32 個(gè)氨基酸組成，本身分子量很小，且部分和人體蛋白同源(其和人體自身蛋白TNNI3K具有 同源性)，因此在人體中的免疫原性很低，不會(huì)被人體的免疫系統(tǒng)快速清除。第二，它具有非 常好的水溶性，也極易制備和純化，利用最簡單的大腸桿菌原核表達(dá)體系就可以達(dá)到每克 菌體提取5毫克純蛋白的制備水平，極易工業(yè)化推廣應(yīng)用。第三，它穩(wěn)定性非常強(qiáng)，包括反 復(fù)凍融和室溫長期放置都不會(huì)導(dǎo)致蛋白大量降解、變性或者失活。這些性質(zhì)對P20和P20-A 在實(shí)際中的應(yīng)用提供了很大的方便。當(dāng)術(shù)語“包含”被用于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中時(shí)，其不排除其它元件或步 驟。為本發(fā)明目的，術(shù)語“由…組成”被認(rèn)為是術(shù)語“包含”的優(yōu)選實(shí)施方案。
權(quán)利要求
一種分離的肽，其抑制HIV 1病毒介導(dǎo)的膜融合，其包含氨基酸序列WGRLEGRRT(SEQ ID NO3)，優(yōu)選所述肽長度少于50個(gè)氨基酸。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽(a)由SEQID NO :3所示的氨基酸序列組成，或者(b)由(a)中的氨基酸序列經(jīng)過修飾例如經(jīng)過取代、缺失或添加一或多個(gè)氨基酸的氨 基酸序列組成。
3.權(quán)利要求1的肽，其包含(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；(b)SEQID NO 2所示的氨基酸序列；(c)與(a)或(b)具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性 的氨基酸序列。
4.一種抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合的分離的肽，其中所述肽(a)由SEQID NO :1或2所示的氨基酸序列組成；(b)由(a)中的氨基酸序列經(jīng)過修飾例如經(jīng)過取代、缺失或添加一或多個(gè)氨基酸的氨 基酸序列組成且具有抑制HIV-I病毒介導(dǎo)的膜融合的活性。
5.一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽。
6.權(quán)利要求5的核酸分子，其具有SEQID NO :4或5所示序列或其簡并序列。
7.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求5或6的核酸分子。
8.一種分離的重組細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7的表達(dá)載體。
9.一種藥物組合物或疫苗，其包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5或6的核酸分 子、權(quán)利要求7的表達(dá)載體和/或權(quán)利要求8的重組細(xì)胞以及任選存在的藥物可接受的載 體或賦形劑。
10.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5或6的核酸分子、權(quán)利要求7的表達(dá)載體或 權(quán)利要求8的重組細(xì)胞在制備用于抑制或預(yù)防HIV-I病毒感染的疫苗或藥物組合物中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5或6的核酸分子、權(quán)利要求7的表達(dá)載體或 權(quán)利要求8的重組細(xì)胞作為藥物或疫苗的應(yīng)用。
12.—種抑制或預(yù)防HIV-I感染的方法，包括給予被HIV-I病毒感染或有被HIV-I病 毒感染風(fēng)險(xiǎn)的對象施用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽、權(quán)利要求5或6的核酸分子、權(quán)利要求7 的表達(dá)載體或權(quán)利要求8的重組細(xì)胞或權(quán)利要求9的藥物組合物或疫苗。
13.制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽的方法，包括步驟(a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽，裂解細(xì)胞，收集上清；(b)將上清流經(jīng)親和柱；(c)加入PreScission蛋白酶(PP)酶溶液，反應(yīng)一段時(shí)間；(d)用酶切緩沖液洗脫并收集洗脫液。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述宿主細(xì)胞是R0SSETA菌株。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述親和柱是谷胱甘肽瓊脂糖凝膠 (Glutathione-Sepharose) 4B 親禾口柱。
16.權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中PP酶溶液濃度為6.67μ g/ml，在室溫反應(yīng)2h或在4°C反應(yīng)過夜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制HIV-1病毒介導(dǎo)的膜融合的分離的肽，其特征在于所述肽包含氨基酸序列WGRLEGRRT(SEQ ID NO3)。所述肽可以和gp41相互作用，有效阻止病毒包膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合，中和HIV-1病毒。
文檔編號A61K39/00GK101914143SQ201010261250
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者徐利玲, 朱赟, 楊恒文, 陸路, 陳應(yīng)華 申請人:清華大學(xué)