專利名稱：一種乙型腦炎疫苗制劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型腦炎疫苗制劑的生產(chǎn)方法，具體涉及一種利用鋁佐劑原位吸附技術(shù)生產(chǎn)滅活病毒乙型腦炎疫苗制劑的方法。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)滅活病毒乙型腦炎疫苗制劑的生產(chǎn)工藝多采用凍干制劑或鋁佐劑表面吸附，國外也有關(guān)于鋁佐劑表面吸附的報(bào)道。但是，這些方法制備出的乙型腦炎疫苗產(chǎn)品的免疫效果均還有待提高，同時(shí)還存在陽轉(zhuǎn)率提高的情況下，發(fā)熱率也同時(shí)提高的缺陷，嚴(yán)重地影響了滅活病毒乙型腦炎疫苗產(chǎn)品的推廣和使用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用鋁佐劑原位吸附技術(shù)生產(chǎn)乙型腦炎疫苗制劑的方法。與無佐劑制品和表面吸附制品相比，該方法生產(chǎn)的乙型腦炎疫苗制劑成功地解決了陽轉(zhuǎn)率和發(fā)熱率之間的矛盾；同時(shí)疫苗的免疫持久性明顯延長。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種乙型腦炎疫苗制劑的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括以下步驟向滅活和純化的乙型腦炎病毒培養(yǎng)液中加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度達(dá)到0. 05mol/L,然后在攪拌下加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3 溶液進(jìn)行反應(yīng)并保持體系的PH為7. 0，直至反應(yīng)產(chǎn)物中的Al (OH) 3濃度為2. 0 2. 5mg/ml。上述生產(chǎn)方法還可以包括以lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋反應(yīng)產(chǎn)物。優(yōu)選地，反應(yīng)產(chǎn)物被稀釋至Al (OH)3濃度為0. 5 0. 75mg/ml, NaCl濃度為0. 14 0. 16mol/L。上述生產(chǎn)方法還可以包括向稀釋后的反應(yīng)產(chǎn)物加入添加劑。優(yōu)選地，添加劑包括 1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。在上述生產(chǎn)方法中，所述滅活和純化的乙型腦炎病毒培養(yǎng)液的蛋白濃度可以為 30 80 μ g/ml。在上述生產(chǎn)方法中，所述乙型腦炎疫苗制劑的抗原量可以為5 IOyg/劑，補(bǔ)結(jié)抗原量為1 4 1 8。其中，補(bǔ)結(jié)抗原即是用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)測得的抗原量，可溶性抗原， 如蛋白質(zhì)、多糖、類脂、病毒等或者顆粒性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合后，其抗原抗體復(fù)合物可以結(jié)合補(bǔ)體，但這一反應(yīng)肉眼不能覺察，如再加入紅細(xì)胞和溶血素，即可根據(jù)是否出現(xiàn)溶血反應(yīng)來判定反應(yīng)系統(tǒng)中是否存在相對(duì)應(yīng)的抗原和抗體，此反應(yīng)即為補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。本發(fā)明還提供了上述生產(chǎn)方法制備的乙型腦炎疫苗制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的生產(chǎn)方法采用鋁佐劑原位吸附技術(shù)因而具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)1、鋁佐劑原位吸附制品的中和抗體效價(jià)明顯提高。小鼠一針和二針免疫中和抗體效價(jià)的檢測結(jié)果表明，鋁佐劑原位吸附制品的中和抗體水平大大高于無佐劑制品，免疫效果持久。人體臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，與市場上的對(duì)照產(chǎn)品相比，鋁佐劑原位吸附制品能夠明顯增強(qiáng)免疫反應(yīng)，陽轉(zhuǎn)率、中和抗體滴度和免疫持久性均大大提高。2、有效地解決了陽轉(zhuǎn)率和發(fā)熱率之間的矛盾。無佐劑乙腦疫苗和鋁佐劑表面吸附乙腦疫苗都存在抗原量和發(fā)熱率之間的矛盾， 增加抗原量有利于提高陽轉(zhuǎn)率，但同樣發(fā)熱率也會(huì)有大幅度提高?，F(xiàn)有產(chǎn)品通常以降低陽轉(zhuǎn)率和中和抗體滴度為代價(jià)來控制發(fā)熱率。鋁佐劑原位吸附解決了陽轉(zhuǎn)率和發(fā)熱率之間的矛盾。表面吸附是預(yù)先生成氫氧化鋁，再用氫氧化鋁吸附抗原。吸附均發(fā)生在佐劑表面。與此不同的是，原位吸附氫氧化鋁的生成過程與吸附過程同時(shí)進(jìn)行，吸附過程中不斷生成的鋁佐劑將抗原緊緊包裹在內(nèi)部。這種疫苗經(jīng)免疫進(jìn)入人體后，鋁佐劑還具有緩釋抗原作用， 因而在保證陽轉(zhuǎn)率和中和抗體滴度大幅提高的情況下還能有效降低發(fā)熱反應(yīng)的發(fā)生率。3、原位吸附有利于提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，延長貨架期。國內(nèi)外現(xiàn)有的鋁佐劑表面吸附制品都存在容易解吸附、穩(wěn)定性差、貨架期短以及效力降低等缺點(diǎn)，而且解吸附的抗原容易成團(tuán)使發(fā)熱率升高?，F(xiàn)有制品的有效期一般為 18 M個(gè)月，而鋁佐劑原位吸附的制品穩(wěn)定性更好，貨架期延長，有效期可以穩(wěn)定保持在 36個(gè)月以上。4、免疫持久性延長有利于加強(qiáng)對(duì)免疫人群的保護(hù)作用?，F(xiàn)在的免疫程序?yàn)榛A(chǔ)免疫注射兩針，1年后加強(qiáng)免疫1次。臨床研究結(jié)果表明， 現(xiàn)有的乙腦疫苗產(chǎn)品基礎(chǔ)免疫六個(gè)月后人群中和抗體陽性率降至40%以下，本發(fā)明的方法生產(chǎn)的疫苗基礎(chǔ)免疫六個(gè)月后人群中和抗體的陽性率能維持在90%以上。證明本發(fā)明的方法生產(chǎn)的疫苗免疫持久性大大延長。按照流行病學(xué)普遍規(guī)律，人群中和抗體陽性率維持在 60%以上，才能產(chǎn)生足夠的保護(hù)屏障，完全控制疾病流行。因此，本發(fā)明的方法生產(chǎn)的疫苗有利于加強(qiáng)對(duì)免疫人群的保護(hù)作用。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1 本發(fā)明生產(chǎn)的制劑與已有制劑的抗體陽轉(zhuǎn)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較；圖2 本發(fā)明生產(chǎn)的制劑與已有制劑的中和抗體滴度比較；圖3 本發(fā)明生產(chǎn)的制劑與已有制劑的免疫持久性(6個(gè)月)比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11、VERO種子細(xì)胞的復(fù)蘇1. 1VER0細(xì)胞株的來源VERO細(xì)胞原始來源為ATCC (編號(hào)為F-12313)，經(jīng)傳代擴(kuò)增建立了主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫，并保存于液氮中。主細(xì)胞為129代；工作細(xì)胞為133代，凍存密度為4X106/ml。1. 2VERO種子細(xì)胞的復(fù)蘇取液氮罐內(nèi)保存工作庫細(xì)胞一支，39°C溫水迅速融化后，將細(xì)胞懸液按約IXlO5/cm2接種密度轉(zhuǎn)入175cm2方瓶中，逐步滴加培養(yǎng)基(含10% (體積/體積)胎牛血清的M199 培養(yǎng)基(M199干粉培養(yǎng)基組成成分見GIBCO培養(yǎng)基手冊)至60mL，37°C和5% CO2培養(yǎng)箱
中培養(yǎng)。2、在175cm2方瓶中培養(yǎng)一級(jí)種子細(xì)胞復(fù)蘇的細(xì)胞培養(yǎng)3 4天生長成致密單層，使用0.25% (g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1 4(體積/體積)的接種比例將細(xì)胞懸液分到新培養(yǎng)瓶中，加入適當(dāng)量的培養(yǎng)液(601111)，371、5(%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4天后以1 4(體積/體積)比例再放大培養(yǎng)一次。3、在2L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)二級(jí)種子細(xì)胞3. 1培養(yǎng)基M199 培養(yǎng)基 9. 55g/L,NaHCO3 1. 8g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。3. 2轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)選擇2L轉(zhuǎn)瓶和四層轉(zhuǎn)瓶機(jī)，保持接種密度為1.0 2.0X105/cm2，加入500 600ml培養(yǎng)基，設(shè)置溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為每分鐘1/8轉(zhuǎn)，培養(yǎng)3 4天。4、在14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)三級(jí)種子細(xì)胞4. 1培養(yǎng)液M199 培養(yǎng)基 9. 55g/L,NaHCO3 2. 2g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。4. 2反應(yīng)器選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，罐體積為14L，工作體積為10L。4. 3微載體選擇Cytodex 1 微載體(GE 公司)，用量為 5. Og/L。4. 4上罐接種將轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)3 4天的VERO細(xì)胞經(jīng)消化后，轉(zhuǎn)移至藍(lán)蓋瓶中，吹打分散均勻，一并接入14L生物反應(yīng)器，添加培養(yǎng)基至10L。4. 5參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。4. 6灌流控制接種12小時(shí)后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。5、在75L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)四級(jí)種子細(xì)胞5. 1 培養(yǎng)基同 4. 1.5. 2反應(yīng)器的選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，罐體積為75L，工作體積為50L。5. 3微載體使用方法及用量同4. 35. 4轉(zhuǎn)罐接種將14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5 6天的細(xì)胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應(yīng)后，通過管道將細(xì)胞連同微載體一并轉(zhuǎn)入75L生物反應(yīng)器，定容至50L。5. 5參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。5. 6灌流控制接種12小時(shí)后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。6、在300L生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)VERO細(xì)胞和制備病毒液6. 1培養(yǎng)基和維持液配方培養(yǎng)基同4. 1.維持液:M199培養(yǎng)基 9. 55g/L，NaHCO3 2. 2g/L，蔗糖 1. Og/L，人血白蛋白 0. lg/L。6. 2反應(yīng)器的選擇選擇比歐或Sartorius哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，罐體積為300L，工作體積為210L。6. 3微載體用量同4. 36. 4 轉(zhuǎn)罐將75L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5 6天的細(xì)胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應(yīng)后，通過管道將細(xì)胞連同微載體一并轉(zhuǎn)入300L生物反應(yīng)器，定容至210L。6. 5培養(yǎng)參數(shù)同4. 5。6. 6灌流控制接種M小時(shí)后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。7、接種乙腦P3株病毒培養(yǎng)7. 1接毒方法暫?？刂茀?shù)，沉降微載體和細(xì)胞，抽掉上清培養(yǎng)液，更換為維持液，待參數(shù)穩(wěn)定后按照MOI為0.01接種病毒。7. 2參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40轉(zhuǎn)/分(RPM) ；pH -J. 5 7. 6 ；DO 40 50%飽和度；溫度 33. 5 34. 5°C。7. 3以連續(xù)灌流方式收獲病毒培養(yǎng)液接毒12小時(shí)后開始灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，從接毒48小時(shí)起開始收獲病毒液，連續(xù)收獲8天。8、病毒收獲液的澄清過濾和超濾濃縮8. 1澄清過濾選擇膜面積為1平方米(20英寸)的Iym和0.5μπι的聚醚砜濾芯串聯(lián)，先經(jīng)Ιμπι 濾膜再經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾。8. 2超濾濃縮8. 2. 1緩沖液選擇選擇pH7. 2-8. 0無菌磷酸緩沖液沖洗平衡好超濾系統(tǒng)。8. 2. 2設(shè)備選擇使用Millipore公司的0. 5平方米PELLIC0N 2超濾系統(tǒng)，安裝2塊PELLIC0N 2超濾膜包，截留分子量為300KD的濾膜。8. 2. 3操作參數(shù)設(shè)定進(jìn)液口壓力為10 20psi，回流口壓力為5 10psi，2 4小時(shí)內(nèi)完成80 120L病毒液的收獲；樣品濃縮20 40倍，得到2 6L濃縮液。9、病毒滅活9. 1滅活試劑的準(zhǔn)備先將β -丙內(nèi)酯用注射用水稀釋成40倍的母液，經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌。9. 2滅活操作將預(yù)稀釋的β-丙內(nèi)酯母液加入濃縮液中至終濃度為1/4000，2 8°C下放置滅活，24小時(shí)后在37°C下水解2小時(shí)。10、分子篩層析10. 1緩沖液選擇pH7. 5 8. 5的磷酸緩沖液。10. 2填料選擇GE公司的kphacryl S-300層析填料，裝柱高度為20 60cm。10. 3層析操作首先使用2倍柱體積的緩沖液平衡層析柱，流速為20 50cm/小時(shí)，上樣樣品體積為8% 12%的柱體積，收獲第一峰(波長^Onm，紫外檢測器)。11、離子交換膜層析11. 1緩沖液的選擇緩沖液A :pH7. 5 8. 5磷酸緩沖液，緩沖液B :pH7. 5 8. O磷酸緩沖液加 500mmol/L 氯化鈉。11. 2離子交換膜的選擇Sartorius公司的Sartobind Q離子交換層析膜11. 3層析操作先用10倍體積的緩沖液A平衡層析膜，上樣經(jīng)分子篩層析純化后的抗原樣品，用緩沖液A(體積比為100^-0%)和緩沖液B(體積比0% 100% )形成線性梯度洗脫， 收集NaCl濃度為70mM至250mM之間的洗脫液為純化后原液；12、鋁佐劑原位吸附抗原方法12. 1試劑準(zhǔn)備lmol/L 的 NaOH 溶液，lmol/L ρΗ8· 5 的磷酸鹽緩沖溶液，0. 2mol/L 的 AlCl3 溶液， lmol/L的NaCl溶液，過濾除菌。12. 2吸附方法將純化后的抗原過濾除菌后，加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度為0. 05mol/L,然后攪拌加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液，反應(yīng)過程中保持體系PH為7. 0左右，反應(yīng)體系中的Al (OH)3量為2. 0 2. 5mg/ml時(shí)為止。12. 3 稀釋用lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋至抗原量為5 10 μ g/劑，補(bǔ)結(jié)抗原為 1 4 1 8，八1(0!1)3含量為0.5 0.7511^/1111，妝(1濃度為0.14 0.1611101/1。
12. 4加入添加劑1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。12. 5半成品檢測無菌試驗(yàn)。實(shí)施例21、鋁佐劑原位吸附制劑的中和抗體效價(jià)1. 1小鼠一針免疫中和抗體的效價(jià)結(jié)果比較比較無佐劑制品和鋁佐劑原位吸附制品一針免疫小鼠后的中和抗體效價(jià)，免疫2 周、4周和6周后的血清中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果表明鋁佐劑制品和無佐劑制品的免疫原性存在很大差異，無佐劑制品免疫后中和抗體的高峰水平出現(xiàn)在注射后2周，4周開始下降。 鋁佐劑原位吸附制品的中和抗體高峰水平出現(xiàn)在注射后6周，且鋁佐劑制品的平均中和抗體水大大高于無佐劑制品(見表3)。表3小鼠一針免疫中和抗體效價(jià)的比較
權(quán)利要求
1.一種乙型腦炎疫苗制劑的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括以下步驟向滅活和純化的乙型腦炎病毒培養(yǎng)液中加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度達(dá)到0. 05mol/L,然后在攪拌下加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液進(jìn)行反應(yīng)并保持體系的PH為7. 0，直至反應(yīng)產(chǎn)物中的Al (OH)3濃度為2. 0 2. 5mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生產(chǎn)方法還包括以lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋反應(yīng)產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述反應(yīng)產(chǎn)物被稀釋至Al(OH) 3濃度為 0. 5 0. 75mg/ml, NaCl 濃度為 0. 14 0. 16mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述生產(chǎn)方法還包括向稀釋后的反應(yīng)產(chǎn)物加入添加劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述添加劑包括(g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述滅活和純化的乙型腦炎病毒培養(yǎng)液的蛋白濃度為30 80 μ g/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述乙型腦炎疫苗制劑的抗原量為5 IOyg/劑，補(bǔ)結(jié)抗原量為1 4 1 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法制備的乙型腦炎疫苗制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乙型腦炎疫苗制劑的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括以下步驟向滅活和純化的乙型腦炎病毒培養(yǎng)液中加入1mol/L pH8.5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度達(dá)到0.05mol/L，然后在攪拌下加入1mol/L的NaOH溶液和0.2mol/L的AlCl3溶液進(jìn)行反應(yīng)并保持體系的pH為7.0，直至反應(yīng)產(chǎn)物中的Al(OH)3濃度為2.0～2.5mg/ml。與無佐劑制品和表面吸附制品相比，該方法生產(chǎn)的乙型腦炎疫苗免疫持久性明顯延長，同時(shí)解決了陽轉(zhuǎn)率和發(fā)熱率之間的矛盾。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102327607SQ201010264210
公開日2012年1月25日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者劉鈿蓮, 艾文, 馬書智 申請人:麗珠集團(tuán)疫苗工程股份有限公司