專利名稱：鴨源性冠狀病毒n蛋白基因及其克隆方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種鴨源性冠狀病毒ZZ2004的N蛋白基因及 其克隆方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1937年，冠狀病毒(Coronaviruses)首先從雞身上分離出來(lái)。1965年，分離出第 一株人的冠狀病毒。由于在電子顯微鏡下可觀察到其外膜上有明顯的棒狀粒子突起，使其 形態(tài)看上去像中世紀(jì)歐洲帝王的皇冠，因此命名為“冠狀病毒”。根據(jù)病毒的血清學(xué)特點(diǎn)和 核苷酸序列的差異，目前冠狀病毒科分為冠狀病毒和環(huán)曲病毒兩個(gè)屬。冠狀病毒科的代表 株為禽傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。該病毒為有囊 膜、呈中等多形性球狀或橢圓形的病毒粒子，表面有桿狀突起。禽傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒科的禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的 一種常見多發(fā)的急性高度接觸性傳染病，表現(xiàn)為呼吸型、腎型、腸型、腺胃型等多種病型。該 病可感染所有日齡的雞，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、死亡、增重和飼料報(bào)酬降低。IBV往往引起復(fù)合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可繼發(fā)細(xì)菌性疾病，如 大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重了對(duì)雞群的危害。據(jù)《世界家禽》1999年資料，全世界 的禽病中，以呼吸系統(tǒng)疾病最為嚴(yán)重，其中IB是世界大多數(shù)地區(qū)危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病。 1988年以來(lái)，IB在我國(guó)大部分地區(qū)相繼流行，疫區(qū)的發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)10 30%。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的IBV有26種以上血清型，因血清型及新變型眾多，不同血清型之間 缺乏交叉保護(hù)，新的變異株不斷出現(xiàn)和流行，是造成雞群免疫失敗的原因。這使得IB對(duì)養(yǎng) 雞業(yè)造成的威脅持續(xù)存在。而掌握流行毒株的生物學(xué)特性和流行特點(diǎn)是正確使用疫苗的前 提。2004年5月，河南省鄭州某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了以腹瀉和生長(zhǎng)遲緩為主要癥狀的疑似IB 疾病，感染雞主要表現(xiàn)精神沉郁，下痢，生長(zhǎng)緩慢及抵抗力下降，發(fā)病率為100%，死亡率達(dá) 20%以上，感染雞群的生產(chǎn)性能顯著降低。調(diào)查中顯示，與雞舍相距僅150米左右處有一個(gè) 1700只的肉鴨群，在第一批雞發(fā)病前約10天左右鴨群發(fā)生過(guò)類似癥狀的疾病，但沒有造成 大量死亡。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落，腺胃乳頭腫 大、粘膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈“花斑腎”， 肺臟無(wú)明顯變化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌 及肝臟出血為主要特征。在同地區(qū)的其他雞場(chǎng)也發(fā)生了同樣癥狀的疾病，雖然經(jīng)過(guò)多種IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院開展了對(duì)該疫病的研究工 作，結(jié)果從發(fā)病鴨體內(nèi)分離到一株病毒，鑒定為IBV，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，保 藏編號(hào)為CGMCC NO. 3842，其專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010225577. 4，此為第一次有關(guān)家鴨感染IBV 的報(bào)道。IBV粒子含有3種特異性蛋白，即核衣殼蛋白(N)，膜蛋白(M)和纖突蛋白(S)。N 蛋白全長(zhǎng)約409個(gè)氨基酸，分子量約51kDa，占病毒總蛋白量的40%，是IBV病毒內(nèi)部核衣殼的組成蛋白，它與病毒RNA結(jié)合，為螺旋形的核衣殼提供基礎(chǔ)。核蛋白在組內(nèi)高度保守， 但近年的研究表明，在不同毒株間N基因存在變異，并且這些差異存在于推測(cè)的抗原表位 和功能相關(guān)區(qū)域，提示不同IBV毒株N基因之間的變異可能影響到病毒的某些生物特性發(fā) 生改變。N蛋白具有較好的免疫原性，在細(xì)胞免疫和體液免疫中起重要作用，在局部免疫方 面也具有重要作用，因此深入研究N蛋白基因的結(jié)構(gòu)及其變異規(guī)律，對(duì)于揭示IBV的變異機(jī) 制，研制高效的IBV疫苗，為有效防控IB的發(fā)生將具有起到重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是對(duì)鴨源性冠狀病毒ZZ2004的N蛋白基因進(jìn)行了分析 測(cè)序，并給出了克隆該N蛋白基因的方法及其應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種鴨源性冠狀病毒(ZZ2004，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 3842)的N蛋白基因，該基 因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。一種鴨源性冠狀病毒的(ZZ2004，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 3842) N蛋白基因，該基 因的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。一種鴨源性冠狀病毒(ZZ2004，其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 3842)的N蛋白基因的克 隆方法，包括以下步驟 1)選取鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，以5 ‘ -AGTCAGTAGACAGCGGAGAG-3 ‘為上游引 物，以 5 ‘ -TTCGTTTCCAGGCTACTAAG-3 ‘為下游引物；2)通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增出鴨源性冠狀病毒ZZ2004株N蛋白基因全長(zhǎng)片段， PCR 的擴(kuò)增條件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C Imin，共 35 個(gè)循環(huán)，最后于 72 °C 延 伸10min，4°C結(jié)束反應(yīng)；3)然后將N蛋白基因片段分別與pMDIS-T載體連接。所述鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因在制備IBV基因工程亞單位蛋白疫苗中的應(yīng) 用，該N蛋白基因片段可被克隆到質(zhì)粒載體或真核表達(dá)載體上進(jìn)一步研制出IBV核酸疫苗 及活載體疫苗對(duì)預(yù)防IBV將具有重要意義。所述鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因在制備防治雞傳染性支氣管炎藥物中的應(yīng)用， 該N蛋白基因一旦被導(dǎo)入植物，并在植物中表達(dá)出活性蛋白，有望研制出轉(zhuǎn)基因植物可食 疫苗，作為禽類飼料添加劑，家禽食用含有該種抗原的轉(zhuǎn)基因植物，將激發(fā)腸道免疫系統(tǒng)， 從而產(chǎn)生對(duì)IBV的免疫能力。上述鴨源性冠狀病毒(Avianinfectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已 于2010年4月29日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為 CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該鴨源性冠狀病 毒的保藏編號(hào)為CGMCC N0. 3842，其中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010225577. 4。本發(fā)明具有積極有益的效果此前尚無(wú)有關(guān)家鴨感染IBV的報(bào)道，本病毒分離株ZZ2004來(lái)自雞鴨混養(yǎng)的養(yǎng)殖 場(chǎng)，本病毒不僅可以引起雞的大批發(fā)病及死亡，還可嚴(yán)重影響家鴨的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)引起鴨 的感染和死亡。與其它禽類的冠狀病毒相比，ZZ2004變異的程度較大，對(duì)動(dòng)物的感染譜更 廣；近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)N基因是重要的免疫基因，在細(xì)胞免疫及體液免疫方面均具有重要作用，在局部免疫方面也具有重要作用，本發(fā)明對(duì)N基因的研究，對(duì)于揭示IBV變異規(guī)律，區(qū) 分不同的血清型，進(jìn)而制備出新型高效的基因工程疫苗，為有效防制IBV將起到重要作用。


圖1為鴨源性冠狀病毒ZZ2004的N基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比對(duì)圖譜；圖2為鴨源性冠狀病毒ZZ2004分離株與參考毒株N蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖3為鴨源性冠狀病毒ZZ2004的N基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容并不局限于下述具 體實(shí)施例。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的 試驗(yàn)材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常規(guī)生化試劑商店。實(shí)施例1 一種鴨源性冠狀病毒ZZ2004的N基因的克隆方法，包括如下步驟(I)PCR引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下上游引物5' -AGTCAGTAGACAGCGGAGAG-3‘；下游引物5' -TTCGTTTCCAGGCTACTAAG-3‘。(2) ZZ2004株的濃縮方法取ZZ2004株感染的尿囊液用滅菌PBS作1 10稀釋，取0. 2ml接種于9日齡的 SPF雞胚絨毛尿囊腔內(nèi)，37°C孵化36 48h，置4°C 12h后收獲雞胚尿囊液。分別取50ml ZZ2004株感染的SPF雞胚尿囊液于滅菌的離心管3管，5000rpm離 心20min ；分別棄沉淀，取上清于另一滅菌的離心管中，12000rpm離心20min ；分別棄沉淀， 取上清加入50ml的超速離心管，不足的以滅菌PBS補(bǔ)足，40000rpm離心4小時(shí)；棄上清，取 沉淀用Iml滅菌PBS懸浮后_20°C保存?zhèn)溆谩?3) ZZ2004 株總 RNA 的提取用DNA/RNA 提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)提 取RNA，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。(4) ZZ2004株基因片段的RT-PCR擴(kuò)增①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在0. 2ml Microtube管中配制下列混合液(表1)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。表1模板RNA/弓丨物反應(yīng)混合液
dNTP Mixture (IOmM each)1 μ L
random 6 mersIuL
上述提取的Template RNA8uL
Total Volume10 μ L在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)65°C 5min，4°C保存。離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(表2)。
表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
權(quán)利要求
一種鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一種鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因，其特征在于，該基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
3.一種鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因的克隆方法，包括如下步驟1)選取鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，以5‘ -AGTCAGTAGACAGCGGAGAG-3 ‘為上游引物，以 5 ‘ -TTCGTTTCCAGGCTACTAAG-3 ‘為下游引物；2)通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增出鴨源性冠狀病毒ZZ2004株N蛋白基因全長(zhǎng)片段，PCR的擴(kuò) 增條件 94°C，5min ;94°C lmin,53°C lmin，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)，最后于 72°C延伸 IOmin, 4°C結(jié)束反應(yīng)；3)然后將N蛋白基因片段分別與pMDlS-Τ載體連接。
4.權(quán)利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因在制備IBV基因工程亞單位蛋白 疫苗中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的N蛋白基因在制備防治雞傳染性支氣管炎藥 物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨源性冠狀病毒ZZ2004的N蛋白基因及其克隆方法與應(yīng)用。該N蛋白基因序列全長(zhǎng)1230bp，編碼409個(gè)氨基酸殘基的N蛋白；通過(guò)隨機(jī)PCR找到與其同源性較高的病毒序列，以該序列為模版設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的片段，再將其分別與pMD18-T載體連接即克隆出該病毒N蛋白基因。鑒于N基因是重要的免疫基因，在細(xì)胞免疫及體液免疫方面均具有重要作用，在局部免疫方面也具有重要作用，本發(fā)明對(duì)N基因的研究，有助于揭示IBV變異規(guī)律，區(qū)分不同的血清型，進(jìn)而研制備出新型高效的基因工程疫苗，為有效防制IBV將起到重要作用。
文檔編號(hào)A61P11/00GK101948851SQ201010264748
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者劉興友, 劉金華, 姚四新, 王三虎, 王麗榮, 王憲文, 王自良, 王青, 趙坤, 趙淑秋 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院