專利名稱：一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵技術領域，具體涉及一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法與應用。
背景技術：
目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各種物理和/或化學的方法，包括各種抗 生素的使用。物理和/或化學的方法都存在著明顯的弊端，首先，抗生素大量濫用，會導致 一些副作用的產(chǎn)生，如病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等。其次，酸堿處理的方法雖可達到 一定的滅菌/殺菌效果，但在有害菌形成生物膜后，這些方法的效果就極不理想。最后，物 理的方法對各種致病菌的消除作用只能應用于相關領域的某一環(huán)節(jié)，而難以擴展到整個領 域的所有環(huán)節(jié)。生物防治的方法則可具有強大的優(yōu)越性，極有可能使其服務于日常生活的 病害防治以及生物戰(zhàn)和恐怖襲擊中大規(guī)模的水源性、食源性污染的處理等。近年來微生物生態(tài)制劑的研究開發(fā)受到各方關注，特別是蛭弧菌的研究受到人們 的青睞。蛭弧菌自1963年被發(fā)現(xiàn)以來，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門氏菌、嗜 水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性致病菌且對人和動物無害，而備受關注。將蛭弧菌應用于防治致病菌的關鍵是獲得濃度高、裂解能力強的蛭弧菌制劑。為 此，人們對蛭弧菌制劑的制備方法進行了不懈的研究，譬如專利申請?zhí)枮?3111749. 6、名稱 為“生物制菌王及其生產(chǎn)方法”的國家發(fā)明專利申請?zhí)岢鲇酶邷?70 150°C )或化學藥物 (氯仿等)將大腸桿菌殺死，制造滅活的宿主菌，接著用其培養(yǎng)蛭弧菌，得到蛭弧菌制劑；專 利申請?zhí)?00810145709. 5、名稱為“蛭弧菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)方法”提供了蛭弧菌微生態(tài)制 劑的生產(chǎn)方法，主要和傳統(tǒng)方法不同的是將宿主大腸桿菌凍干成菌粉使用。上述兩份專利 申請都采用活的大腸桿菌作為宿主菌，最終會影響生態(tài)環(huán)境。而本發(fā)明所用的宿主菌均為 有益菌或是對環(huán)境無害的菌，不會對環(huán)境構(gòu)成威脅。專利申請?zhí)?00810202809. 7、名稱為 “雙效蛭弧菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法”的國家發(fā)明專利申請?zhí)峁┝艘环N雙效蛭弧菌的發(fā)酵生產(chǎn)方 法，即先發(fā)酵制備宿主菌的混懸液，再加入宿主菌混懸液和蛭弧菌液到配制好的培養(yǎng)液中 進行發(fā)酵。雖然該生產(chǎn)方法生產(chǎn)出的蛭弧菌含量較高(5X108pfu/mL)，但是其宿主菌選用 了致病性的嗜水氣單胞菌，而且發(fā)酵時間較長(72 120h)，會導致其生產(chǎn)成本的增加。另 外，此技術也可能存在著所得的蛭弧菌裂解活性不高的問題。而本發(fā)明采用的是革蘭氏陽 性菌為宿主，實驗證明，以此宿主發(fā)酵制得的蛭弧菌能夠維持，甚至提高對其他革蘭氏陰性 菌和陽性菌的裂解能力。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有方法所制備的蛭弧菌制劑含量低以及裂解活性低的問題，本發(fā)明的 首要目的在于提供一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述發(fā)酵方法制備得到的蛭弧菌制劑。本發(fā)明的再一目的在于提供上述蛭弧菌制劑的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，包括以下步驟(1)宿主菌懸液的制備將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，接著用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度，得到濃度 為1017 1022cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2 15°C中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鹽緩沖液中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液，調(diào)整宿主菌的濃度為 1010 1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養(yǎng)液在20 40°C培養(yǎng)20 60h，再在2 15°C，5000 8000rpm離心15 35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2 15°C， 12000 20000rpm離心15 40min，保留沉淀棄去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀 中加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為106 109pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮 液，置于2 15°C保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備將氯化鈉溶于溶劑中形成質(zhì)量體積比濃度為0 30g/L的氯化鈉溶液，滅菌，得 到發(fā)酵培養(yǎng)基；在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧 菌游泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為 1015cfu/mL，蛭弧菌游泳體起始濃度為101 103pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵溫度控制在28 30°C，pH值控制在7. 2 7. 6 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速 與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在20% 30%;發(fā)酵過程中加1 3次宿主菌懸浮液，每次加 入宿主菌懸浮液的間隔時間12 18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發(fā) 酵培養(yǎng)基中的濃度為101Q 1015cfu/mL為準；發(fā)酵培養(yǎng)36 48h即制成蛭弧菌制劑；所述 溶劑為DNB液體培養(yǎng)基、蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。步驟⑴所述宿主菌為有益的或?qū)Νh(huán)境無害的革蘭氏陽性菌，優(yōu)選為枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)、兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacterium bifidum)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、保力口禾丨J 亞乳桿菌 (Lactobacillus bulgaricus)、季L酸片王求菌(Pediococcus acidilactici) > ？LStlillif (Streptococcus lactis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) lif (Lactobacillus lactis)(Lactobacillusplantarum) gJc 戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus)；步驟(2)所述蛭弧菌為BDF01、BDF02、BDF03、BDJO 1、BDJ02、BDM01、BDS01、BDS02、 BDSM08 或 BDFM05。所述BDF01于2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208008 ；所述BDF02于2008年1月13日保藏于中 國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208009;所述 BDF03于2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO :M 208010 ；所述BDJ01于2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢大學 內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208011 ；所述BDJ02于2008年1 月14日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M208012 ；所述BDM01于2008年4月28日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208066 ；所述BDS01于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209169 ；所述BDS02 于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO =M 209170 ；所述BDSM08于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209171 Jy^iBDFMOS于2009年8月7日保 藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO :M 209172。步驟(1)所述收集菌體的方式優(yōu)選為通過離心分離得到，離心條件為2 15°C， 5000 8000rpm 離心 15 35min ；步驟⑴所述宿主菌懸浮液的濃度優(yōu)選為IO17 IO22CfuAiL ；步驟(2)所述蛭弧菌斑采用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?00910042274. 6，名稱為“一 種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請)進行分離得到。步驟(1) (3)任一項所述磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為濃度是0. 1 0. 3mol/L, pH是 7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液；步驟(2)所述蛭弧菌游泳體濃縮液的濃度優(yōu)選為IO6 109pfu/mL ；步驟(3)所述蛭弧菌來源于咸水環(huán)境時，所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基或蒸餾水，所 述氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比濃度為25 30g/L ；步驟(3)所述蛭弧菌來源于咸淡水環(huán)境時，所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基或蒸餾水， 所述氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比濃度為5 10g/L ；步驟(3)所述蛭弧菌來源于淡水環(huán)境時，不加氯化鈉；步驟(3)所述滅菌的條件優(yōu)選為121°C滅菌20min ；步驟(3)所述蛭弧菌制劑的濃度為IO8 1012pfu/mL ；步驟(3)所述DNB液體培養(yǎng)基是將營養(yǎng)肉湯0. Sg、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精 提物0. Ig溶于IOOOmL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7. 2 7. 6。一種蛭弧菌制劑，由所述的蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法制備得到；所述蛭弧菌制劑可以通過裂解其它致病菌或潛在致病菌而達到防治病菌害的目 的。所述的蛭弧菌制劑不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體 制劑、蛭質(zhì)體制劑以及它們的按比例混合的制劑。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法中采用的宿主菌均為有益的或?qū)Νh(huán)境無害的革蘭氏陽 性菌。這樣，一方面，可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革蘭氏陰性菌的能力，而且實驗證 明，用該方法制得的蛭弧菌制劑對致病菌的裂解能力有了一定的提高；另一方面，所制得的 蛭弧菌制劑可以直接使用，無需經(jīng)過更多的發(fā)酵后處理；再者，因為宿主都是有益菌或是對 環(huán)境無害的菌株，該制劑的使用范圍也大大的增加。(2)本發(fā)明在得到高濃度蛭弧菌菌液的同時，相對也縮短了發(fā)酵周期，這樣有效的 解決了發(fā)酵時間過長而導致的能源消耗過大，生產(chǎn)成本過高的問題，得到的蛭弧菌制劑不 僅成本低，而且活性高。


圖1是以兩種不同宿主(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對鼠 傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的裂解能力_時間圖。
圖2是以兩種不同宿主(納豆芽孢桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對單 核增生李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖3是以兩種不同宿主(兩歧雙歧桿菌和鼠傷寒沙門氏菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制 劑對豬鏈球菌II型和乳房鏈球菌的裂解能力-時間圖。圖4是以兩種不同宿主(糞腸球菌和豬霍亂沙門氏菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對 表皮葡萄球菌和大腸桿菌的裂解能力_時間圖。圖5是以兩種不同宿主(保加利亞乳桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對 類馬鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖6是以兩種不同宿主(乳酸片球菌和嗜水氣單胞菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對 乳房鏈球菌和大腸桿菌的裂解能力_時間圖。圖7是以兩種不同宿主(乳酸鏈球菌和豬鏈球II型)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對 豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌的裂解能力_時間圖。圖8是以兩種不同宿主(屎腸球菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對鼠傷寒 沙門氏菌和單核增生李斯特菌的裂解能力_時間圖。圖9是以兩種不同宿主(地衣芽孢桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對嗜 水氣單胞菌和類馬鏈球菌的裂解能力_時間圖。圖10是以兩種不同宿主(嗜酸乳桿菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對金 黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖11是以兩種不同宿主(干酪乳桿菌和嗜水氣單胞菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑 對類馬鏈球菌和大腸桿菌的裂解能力_時間圖。圖12是以兩種不同宿主(乳酸乳桿菌和豬鏈球II型)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對 表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的裂解能力_時間圖。圖13是以兩種不同宿主(植物乳桿菌和豬霍亂沙門氏菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制 劑對無乳鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解能力_時間圖。圖14是以兩種不同宿主(戊糖片球菌和大腸桿菌)發(fā)酵制得的蛭弧菌制劑對乳 房鏈球菌和鏈球菌II型的裂解能力-時間圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。實施例1分別以枯草芽孢桿菌(菌種編號GIM 1. 136，來源于廣東省微生物菌種保藏中 心)和大腸桿菌(Escherichia coli，菌種編號GIM 1. 137，來源于廣東省微生物菌種保藏 中心)為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)枯草芽孢桿菌懸液的制備將枯草芽孢桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉 5g，pH 7. 4士0. 2)，置于33°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件 下，5000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為 0. 2mol/L,pH 7. 6)，得到濃度為1019cfu/mL的枯草芽孢桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫煌戏椒?，制備濃度為IO19CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH 7.6)中加入步驟(1)制備的大 腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(于 2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCCNO :M 208012)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)48h，再在4°C，5000rpm離心35min，保 留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，13000rpm離心30min，保留沉淀棄去上清液，沉淀 為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 6的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，置于2°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的 2.5%，裝入發(fā)酵罐，1211滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟
(1)制備的枯草芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基 中的枯草芽孢桿菌的起始濃度為1012cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā) 酵各參數(shù)條件如下溫度控制在28°C ；加入枯草芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的 發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 6 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制 在28% ；培養(yǎng)過程中加兩次枯草芽孢桿菌懸浮液，每次加入枯草芽孢桿菌懸浮液的間隔時 間15h，每次加入枯草芽孢桿菌懸浮液的量以新加入的枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為IO12CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟
(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，制得濃度為1X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等 致病菌均有很好的裂解效果。分別以對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，菌株編號GIM1. 237，來源于廣東省微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陽 性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，菌株編號GIM1. 142，來源于廣東省微生物 菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，分別加入常規(guī)培 養(yǎng)方法得到鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌體沉淀，每種菌各有兩瓶。調(diào)節(jié)4瓶緩 沖液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)。在兩瓶含有鼠傷寒沙門氏菌的緩沖體系中，分別各加入 蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶含有金黃色葡萄球菌的緩沖體系中， 分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B lmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在Oh、 6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個時刻分別取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數(shù)進行稀 釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，與用大腸桿菌發(fā)酵得到的蛭弧菌制劑B相比，用枯草芽孢桿 菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對 革蘭氏為陽性的金黃色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B好。另外，由枯草芽孢桿菌 制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、 蛭質(zhì)體制劑。實施例2以納豆芽孢桿菌(菌種編號CGMCC 1. 1086，來源于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如 下(1)納豆芽孢桿菌懸液的制備將納豆芽孢桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于35°C搖床中培養(yǎng)15h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 6000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. Imol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為IO18CfuAiL的納豆芽孢桿菌懸浮液，然后置于2°C冰箱中保存?zhèn)溆?；同上方法，制備濃度為IO18CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于2°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. lmol/L, pH 7.4)中加入步驟(1)制備的大腸 桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1013cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自淡水的蛭弧菌BDF02(于 2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M208009)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)45h，再在4°C，6000rpm離心25min，保 留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，HOOOrpm離心28min，保留沉淀棄去上清液，沉淀 為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體 的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備將DNB液體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā) 酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的納豆芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF02游 泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的納豆芽孢桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為 102pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在29°C;加入納豆芽孢桿菌懸浮液和 蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 4;設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧 聯(lián)動，使溶氧水平控制在28% ；培養(yǎng)過程中加兩次納豆芽孢桿菌懸浮液，每次加入納豆芽孢 桿菌懸浮液的間隔時間16h，每次加入納豆芽孢桿菌懸浮液的量為以新加入的納豆芽孢桿 菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為IO13CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)45h即制成濃度為lXliTpfu/mL的 蛭弧菌制劑A。
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同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，制得濃度為1 X 1010pfu/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌等 致病菌都有很好的裂解效果。分別以對革蘭氏為陽性的單核增生李斯特菌(Listeria monocytohenes，菌株編號GIM1. 228，來源于廣東省微生物菌種保藏中心)的裂解和對革 蘭氏為陰性的豬霍亂沙門氏菌(Salmonella enterica，菌株編號GIM1. 244，來源于廣東省 微生物菌種保藏中心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別 加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到單核增生李斯特菌和豬霍亂沙門氏菌的菌體沉淀，每種菌各兩瓶， 調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(lCTcfu/mL)。在兩瓶含有單核增生李斯特菌的緩沖體系 中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶含有豬霍亂沙門氏菌 的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B Im,于30°C，200rpm的搖床上 培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這八個時刻分別取樣，按10-1 10,的稀釋倍 數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落 數(shù)。實驗結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用納豆芽 孢桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬霍亂沙門氏菌有更強的裂解效果，而 且對革蘭氏為陽性的單核增生李斯特菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由納豆 芽孢桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純 的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例3分別以兩歧雙歧桿菌(菌種編號GIM 1. 169，來源于廣東省微生物菌種保藏中 心)和鼠傷寒沙門氏菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)兩歧雙歧桿菌懸液的制備將兩歧雙歧桿菌接種于PTYG培養(yǎng)基中，置于37°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對數(shù) 生長期，培養(yǎng)液在8°C條件下，7000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷 酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 3mol/L,pH 7. 5)，得到濃度為1022cfu/mL的兩歧雙歧桿菌懸浮液， 然后置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫煌戏椒?，用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制備濃度為IO22CfuAiL的鼠傷寒沙門氏菌懸液，置 于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 3mol/L, pH 7. 5)中加入步驟(1)制備的鼠傷寒沙 門氏菌懸浮液，調(diào)整鼠傷寒沙門氏菌的濃度為101(lCfU/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)?為200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具 體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸 桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2， 瓊脂粉3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母 精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7.2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自土壤的蛭弧菌 BDS02 (于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO =M 209170)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)50h，再在8°C，7000rpm離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在8°C，16000rpm離心20min，保留沉淀棄去上 清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 3mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧 菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，置于15°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在DNB液體培養(yǎng)基加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的 0.7%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟 (1)制備的兩歧雙歧桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基 中的兩歧雙歧桿菌的起始濃度為1015cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā) 酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入兩歧雙歧桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的 發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制 在22% ；培養(yǎng)過程中加一次兩歧雙歧桿菌懸浮液，每次加入兩歧雙歧桿菌懸浮液的間隔時 間12h，每次加入兩歧雙歧桿菌懸浮液的量以新加入的兩歧雙歧桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為1015Cfu/mL為準，發(fā)酵培養(yǎng)36h即制成濃度為5X IO11PfuAiL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的鼠傷寒沙門氏菌懸浮液和 步驟(2)制備的蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，制得濃度為5 X IO11PfuAiL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對乳房鏈球菌、沙門氏菌、豬鏈球菌等致病菌 均有裂解效果。分別以對革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型(Str印tococcus suis，菌株編 號CVCC 3306，來源于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌 (Streptococcus uberis，菌株編號700407，來源于上海三踏科技有限公司)的裂解為例。 配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到豬鏈球菌II型 和乳房鏈球菌的菌體沉淀，每種菌各兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)。 在兩瓶含有豬鏈球菌II型的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌 制劑 B ImL,于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 這九 個時刻分別取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平 板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，與用鼠 傷寒沙門氏菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用兩歧雙歧桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭 氏為陰性的豬鏈球菌II型有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌的裂解 效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由兩歧雙歧桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制 成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例4分別以糞腸球菌(Enterococcus faecal is，菌種編號CGMCC 1.131，來源于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)和豬霍亂沙門氏菌為宿主菌制備蛭弧菌制 劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)糞腸球菌懸液的制備將糞腸球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0. 2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 6000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為102°cfu/mL的糞腸球菌懸浮液，然后置于2 4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br> 11
同上方法，制備濃度為102°cfu/mL的豬霍亂沙門氏菌懸液，置于2 4°C冰箱中保 存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙 門氏菌懸浮液，調(diào)整豬霍亂沙門氏菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)?為200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具 體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸 桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2， 瓊脂粉3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵 母精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自土壤的蛭弧 菌BDFM05(于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO =M 209172)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)38h，再在4°C，6000rpm 離心20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，15000rpm離心22min，保留沉淀棄 去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整 蛭弧菌游泳體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDFM05游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)?用；(3)蛭弧菌制劑的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/L,pH 7. 6)，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得 到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的糞腸球菌懸浮液和步驟(2)制 備的蛭弧菌BDFM05游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的糞腸球菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭 弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C;加入糞腸球 菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌 轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在30% ；培養(yǎng)過程中加兩次糞腸球菌懸浮液，每次加入糞 腸球菌懸浮液的間隔時間18h，每次加入糞腸球菌懸浮液的量以新加入的糞腸球菌在發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度為IO14CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為5 X 1010pfu/mL的蛭弧菌制 劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙門氏菌懸浮液和 步驟(2)制備的蛭弧菌BDFM05游泳體濃縮液，制得濃度為5X liTpfu/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分別以對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus印idermidis，菌株 編號GIM1. 143，來源于廣東省微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陰性的大腸桿菌的裂 解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到表皮 葡萄球菌和大腸桿菌的菌體沉淀，每種菌兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO12Cfu/ mL)。在兩瓶含有表皮葡萄球菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL，于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 Oh、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h 這九個時刻 分別取樣，按10—1 10_12的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布， 30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，與用豬霍亂沙門氏菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用糞腸球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的大 腸桿菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制 劑B更好。另外，由糞腸球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步 的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例5分別以保加利亞乳桿菌(菌種編號GIM 1. 80，來源于廣東省微生物菌種保藏中 心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)保加利亞乳桿菌懸液的制備將保加利亞乳桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7.4 士 0.2)中，置于37°C搖床中培養(yǎng)20h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在10°C條件下， 6000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 3mol/ L，pH 7. 3)，得到濃度為IO17CfuAiL的保加利亞乳桿菌懸浮液，然后置于2 4°C冰箱中保 存?zhèn)溆?；同上的方法，制備濃度為IO17CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于2 4°C冰箱中保存?zhèn)?用；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.3mol/L，pH 7.3)中加入步驟⑴制備的大腸 桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1013cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(于 2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208012)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)40h，再在10°C，6000rpm離心25min， 保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在15°C，15000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液， 沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 3mol/L、pH 7. 3的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游 泳體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，置于2°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在蒸餾水中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為蒸餾水體積的2.8%，裝入發(fā)酵罐， 121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的保加利亞 乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的保加利亞乳 桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfU/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如 下溫度控制在28°C ；加入保加利亞乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在 發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 6 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在21% ；培養(yǎng) 過程中加2次保加利亞乳桿菌懸浮液，每次加入保加利亞乳桿菌懸浮液的間隔時間18h，每 次加入保加利亞乳桿菌懸浮液的量以新加入的保加利亞乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 1013Cfu/mL為準，發(fā)酵培養(yǎng)40h即制成濃度為1 X IO11PfuAiL的蛭弧菌制劑A。
同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，制得濃度為1 X IOllPfuAiL的蛭弧菌制劑B。本制劑對氣單胞菌、沙門氏菌、類馬鏈球菌等致病菌都有很好的裂解效果。分別以 對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌(Str印tococcus equinus，菌株編號cvcc 1925，來源于國 家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)和對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶 各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到類馬鏈球菌和鼠傷寒 沙門氏菌的菌體沉淀，每種菌兩瓶，調(diào)節(jié)兩瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)t5在兩瓶 含有類馬鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣， 在兩瓶含有鼠傷寒沙門氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL菌，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個時刻分 別取樣，按10—1 10,的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布， 30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，與用大腸桿菌發(fā) 酵的蛭弧菌制劑B相比，用保加利亞乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的鼠 傷寒沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌類馬鏈球菌裂解效果 也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由保加利亞乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成 制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例6分別以乳酸片球菌(菌種編號GIM 1. 263，來源于廣東省微生物菌種保藏中心) 和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，菌種編號GIM 1. 172，來源于廣東省微生物菌種 保藏中心)為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)乳酸片球菌懸液的制備將乳酸片球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在5°C條件下， 7000rpm離心15min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. Imol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為IO22CfuAiL的乳酸片球菌懸浮液，然后置于15°C冰箱中保存?zhèn)溆茫煌戏椒?，制備濃度為IO22CfuAiL的嗜水氣單胞菌懸液，置于15°C冰箱中保存?zhèn)?用；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. lmol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)制備的嗜水氣單 胞菌懸浮液，調(diào)整嗜水氣單胞菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000!^4!17.2，瓊脂粉170中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自淡水的蛭弧菌BDF03(于 2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208010)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)54h，再在5°C，7000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在5°C，15000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，沉
14淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDF03游泳體濃縮液，置于10°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備將蒸餾水裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入步驟(1)制備的乳酸片球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDF03游泳體濃縮液， 發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳酸片球菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為10pfU/mL，進行 發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入乳酸片球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃 縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 4 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水 平控制在24% ；培養(yǎng)過程中加兩次乳酸片球菌懸浮液，每次加入乳酸片球菌懸浮液的間隔 時間15h，每次加入乳酸片球菌懸浮液的量以新加入的乳酸片球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為1014cfu/mL，發(fā)酵培養(yǎng)45h即制成濃度為5 X IO8的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液和步 驟(2)制備的蛭弧菌BDF03游泳體濃縮液，制得濃度為5 X IO8的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、乳房鏈球菌等致病菌都有 很好的裂解效果。分別以對乳房鏈球菌和大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的 磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到乳房鏈球菌和大腸桿菌的菌體沉淀， 每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(lCTcfu/mL)。在兩瓶含有乳房鏈球菌的緩沖 體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶含有大腸桿菌的 緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL,于30°C，200rpm的搖床上 培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211、4811這九個時刻分別取樣，按10-1 10,的稀 釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算 菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，與用嗜水氣單胞菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比， 用乳酸片球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強的裂解效果，而 且對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由乳酸片球菌 制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、 蛭質(zhì)體制劑。實施例7分別以乳酸鏈球菌(菌種編號GIM 1. 156，來源于廣東省微生物菌種保藏中心) 和豬鏈球菌II型為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)乳酸鏈球菌懸液的制備將乳酸鏈球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于37°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 6000rpm離心27min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為102°cfu/mL的乳酸鏈球菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；同上方法，制備濃度?02°cfu/mL的豬鏈球菌II型懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)?用；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 5)中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌 II型懸浮液，調(diào)整豬鏈球菌II型的濃度為1015cfU/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?br> 15200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離土壤的蛭弧菌BDSM08(于 2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 209171)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在4°C，6000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，16000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，沉 淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDSM08游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在pH值為7. 2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培 養(yǎng)基體積的1.5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入步驟(1)制備的乳酸鏈球菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDSM08游泳體濃縮液， 發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳酸鏈球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行 發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入乳酸鏈球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃 縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 5 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水 平控制在27% ；培養(yǎng)過程中加2次乳酸鏈球菌懸浮液，每次加入乳酸鏈球菌懸浮液的間隔 時間14h，每次加入乳酸鏈球菌懸浮液的量以新加入的乳酸鏈球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為1013Cfu/mL為準，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為5 X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌II型懸浮液和步 驟(2)制備的蛭弧菌BDSM08游泳體濃縮液，制得濃度為5 X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分別以對豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL 的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到豬霍亂沙門氏菌和表皮葡萄球菌的 菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IOltlCfuAiL)。在兩瓶含有豬霍 亂沙門氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩 瓶含有表皮葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B lmL，于 30°C,200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個時刻分別取 樣，按10—1 IO-"1的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C 條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖7所示。從圖7可知，與用豬鏈球菌II型 發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用乳酸鏈球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬霍 亂沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧 菌制劑B更好。另外，由乳酸鏈球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過 進一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例8分別以屎腸球菌(菌種編號CGMCC 1. 2136，來源于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)屎腸球菌懸液的制備將屎腸球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，pH 7. 4士0. 2)中，置于32°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 5000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為IO18CfuAiL的屎腸球菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；同上方法，制備濃度為IO18CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH 7.5)中加入步驟⑴制備的大腸 桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自海水的蛭弧菌BDJ02(于 2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208012)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在4°C，6000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，16000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，沉 淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為106pfu/mL，得到蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在pH值為7. 2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培 養(yǎng)基體積的2. 7%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入步驟⑴制備的屎腸球菌懸浮液和步驟⑵制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，發(fā) 酵培養(yǎng)基中的屎腸球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行發(fā)酵； 發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入屎腸球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā) 酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 3 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在 26% ；培養(yǎng)過程中加兩次屎腸球菌懸浮液，每次加入屎腸球菌懸浮液的間隔時間14h，每次 加入屎腸球菌懸浮液的量以新加入的屎腸球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為IO13CfuAiL為準， 發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)制備的蛭弧菌BDJ02游泳體濃縮液，制得濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌等致病 菌均有裂解效果。分別以對單核增生李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶各 裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到單核增生李斯特菌和鼠 傷寒沙門氏菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)t5在 兩瓶含有單核增生李斯特菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙門氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭
17弧菌制劑 B ImL,于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h 這八 個時刻分別取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平 板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖8所示。從圖8可知，與用大 腸桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比，用屎腸球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的 鼠傷寒沙門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的單核增生李斯特菌的裂解效果 也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由屎腸球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也 可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例9分別以地衣芽孢桿菌(菌種編號GIM1. 182，來源于廣東省微生物菌種保藏中心) 和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)地衣芽孢桿菌懸液的制備將地衣芽孢桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉 5g，pH 7. 4士0. 2)，置于33°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件 下，5000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為 0. 2mol/L,pH 7. 6)，得到濃度為1019cfu/mL的地衣芽孢桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保 存?zhèn)溆?；同上方法，制備濃度為IO19CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH 7.6)中加入步驟⑴制備的大 腸桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自海水的蛭弧菌BDMOl (于 2008年4月28日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCCNO :M 208066)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)48h，再在4°C，5000rpm離心30min，保 留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，13000rpm離心30min，保留沉淀棄去上清液，沉淀 為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 6的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDMOl游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培養(yǎng)基體積的 3.0%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟 (1)制備的地衣芽孢桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌BDMOl游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基 中的地衣芽孢桿菌的起始濃度為1012cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā) 酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入地衣芽孢桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的 發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制 在28% ；培養(yǎng)過程中加兩次地衣芽孢桿菌懸浮液，每次加入地衣芽孢桿菌懸浮液的間隔時
18間15h，每次加入地衣芽孢桿菌懸浮液的量以新加入的地衣芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為IO12CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為1 X 1012pfU/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)制備的蛭弧菌BDMOl游泳體濃縮液，制得濃度為1 X 1012pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌 均有很好的裂解效果。分別以對革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌和對革蘭氏為陽性的類馬鏈 球菌(Sti^ptococcus equinus，菌株編號CVCC 1925，來源于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中 心)的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液，分別加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到 嗜水氣單胞菌和類馬鏈球菌的菌體沉淀，每種菌各有兩瓶。調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一 致(liTcfu/mL)。在兩瓶含有嗜水氣單胞菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和 蛭弧菌制劑B ImL ；同樣，在兩瓶含有類馬鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL 和蛭弧菌制劑 BlmL，于 30°C，200rpm 的搖床上培養(yǎng)。在 0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、 42h、48h這九個時刻分別取樣，按10—1 10,的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋 液分別進行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖9所示。從圖9 可知，與用大腸桿菌發(fā)酵得到的蛭弧菌制劑B相比，用地衣芽孢桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不 僅對革蘭氏為陰性的嗜水氣單胞菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌 的裂解效果也比蛭弧菌制劑B好。另外，由地衣芽孢桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直 接制成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例10分別以嗜酸乳桿菌(菌種編號GIM1. 208，來源于廣東省微生物菌種保藏中心)和 大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)嗜酸乳桿菌的制備將嗜酸乳桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于32°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 5000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為IO17CfuAiL的嗜酸乳桿菌懸浮液，然后置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫煌戏椒?，制備濃度為IO17CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH 7.5)中加入步驟⑴制備的大腸 桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿 菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊 脂粉3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. 8g，酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母 精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自土壤的蛭弧菌 BDS02 (于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO =M 209170)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在4°C，6000rpm離心 20min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在15°C，13000rpm離心20min，保留沉淀棄去上
19清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧 菌游泳體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，置于6°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備將pH值為7. 2的DNB液體培養(yǎng)基中裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng) 基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的嗜酸乳桿菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧 菌BDS02游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的嗜酸乳桿菌的起始濃度為101(lCfU/mL，蛭弧菌起始 濃度為10pfU/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入嗜酸乳桿菌懸浮 液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 5 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與 溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在20% ；培養(yǎng)過程中加兩次嗜酸乳桿菌懸浮液，每次加入嗜酸乳 桿菌懸浮液的間隔時間14h，每次加入嗜酸乳桿菌懸浮液的量以新加入的嗜酸乳桿菌在發(fā) 酵培養(yǎng)基中的濃度為IO13CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為1 X 108pfU/mL的蛭弧菌 制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)制備的蛭弧菌BDS02游泳體濃縮液，制得濃度為1 X 108pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌 均有裂解效果。分別以對金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有 50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門 氏菌的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)t5在兩瓶含有 金黃色葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣， 在兩瓶含有豬霍亂沙門氏菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B lmL，于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個時刻分別 取樣，按10—1 10—11的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，300C 條件下培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖11所示。從圖11可知，與用大腸桿菌發(fā)酵 的蛭弧菌制劑B相比，用嗜酸乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬霍亂沙 門氏菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的金黃色葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌 制劑B更好。另外，由嗜酸乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進 一步的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例11分別以干酪乳桿菌(菌種編號GIM1. 159，來源于廣東省微生物菌種保藏中心)和 嗜水氣單胞菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)干酪乳桿菌的制備將干酪乳桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在5°C條件下， SOOOrpm離心15min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. Imol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為IO22CfuAiL的干酪乳桿菌懸浮液，然后置于15°C冰箱中保存?zhèn)溆?；同上方法，制備濃度為IO22CfuAiL的嗜水氣單胞菌懸液，置于15°C冰箱中保存?zhèn)?用；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. lmol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液，調(diào)整嗜水氣單胞菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000!^4!17.2，瓊脂粉170中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自淡水的蛭弧菌BDF02(于 2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208009)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)54h，再在5°C，7000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在5°C，20000rpm離心15min，保留沉淀棄去上清液，沉 淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. lmol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為107pfu/mL，得到蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，置于2°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備將蒸餾水裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入步驟⑴制備的干酪乳桿菌懸浮液和步驟⑵制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液， 發(fā)酵培養(yǎng)基中的干酪乳桿菌的起始濃度為1014cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行 發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在29°C ；加入干酪乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃 縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 2 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水 平控制在30% ；培養(yǎng)過程中加兩次干酪乳桿菌懸浮液，每次加入干酪乳桿菌懸浮液的間隔 時間15h，每次加入干酪乳桿菌懸浮液的量以新加入的干酪乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為IO14CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)45h即制成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液和步 驟(2)制備的蛭弧菌BDF02游泳體濃縮液，制得濃度為IX 109pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、類馬鏈球菌等致病菌都有 很好的裂解效果。分別以對類馬鏈球菌和大腸桿菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的 磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到類馬鏈球菌和大腸桿菌的菌體沉淀， 每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(1012cfU/mL)。在兩瓶含有類馬鏈球菌的緩 沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶含有大腸桿菌 的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL,于30°C，200rpm的搖床 上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這八個時刻分別取樣，按10-1 10_12的稀釋 倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后，計算菌 落數(shù)。實驗結(jié)果如圖12所示。從圖12可知，與用嗜水氣單胞菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑B相比， 用干酪乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的大腸桿菌有更強的裂解效果，而 且對革蘭氏為陽性的類馬鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另外，由干酪乳桿菌 制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心，制成單純的游泳體、 蛭質(zhì)體制劑。實施例12分別以乳酸乳桿菌(菌種編號ATCC12315，來源于American Type Culture Collection)和豬鏈球菌II型為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下
(1)乳酸乳桿菌懸液的制備將乳酸乳桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于37°C搖床中培養(yǎng)18h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 6000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為102°cfu/mL的乳酸乳桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫煌戏椒?，制備濃度?02°cfu/mL的豬鏈球菌II型懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)?用；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 5)中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌 II型懸浮液，調(diào)整豬鏈球菌II型的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑。)培養(yǎng)出來的分離土壤的蛭弧菌BDSOl (于 2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 209169)斑，然后將此培養(yǎng)液在40°C培養(yǎng)20h，再在4°C，6000rpm離心20min， 保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，12000rpm離心40min，保留沉淀棄去上清液，沉 淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳 體的濃度為108pfu/mL，得到蛭弧菌BDSOl游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在pH值為7. 2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培 養(yǎng)基體積的0. 5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入步驟⑴制備的乳酸乳桿菌懸浮液和步驟⑵制備的蛭弧菌BDSOl游泳體濃縮液， 發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳酸乳桿菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行 發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入乳酸乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃 縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 2 7. 6 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使 溶氧水平控制在23% ；培養(yǎng)過程中加1次乳酸乳桿菌懸浮液，每次加入乳酸乳桿菌懸浮液 的間隔時間18h，每次加入乳酸乳桿菌懸浮液的量以新加入的乳酸乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中 的濃度為IO13CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)42h即制成濃度為5 X 109pfu/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬鏈球菌II型懸浮液和步 驟(2)制備的蛭弧菌BDSOl游泳體濃縮液，制得濃度為5 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對氣單胞菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等致病菌均 有裂解效果。分別以對嗜水氣單胞菌和表皮葡萄球菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL 的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到嗜水氣單胞菌和表皮葡萄球菌的菌 體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IO11CfuAiL)tj在兩瓶含有嗜水氣單 胞菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶含有 表皮葡萄球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL,于30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h這九個時刻分別取樣，按 ΙΟ"1 10—11的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下 培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖13所示。從圖13可知，與用豬鏈球菌II型發(fā)酵 的蛭弧菌制劑B相比，用乳酸乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的嗜水氣單 胞菌有更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的表皮葡萄球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑 B更好。另外，由乳酸乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步 的離心，制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例13分別以植物乳桿菌(菌種編號GIM 1. 140，來源于廣東省微生物菌種保藏中心) 和豬霍亂沙門氏菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程如下(1)植物乳桿菌的制備將植物乳桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于30°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在8°C條件下， 6000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 4)，得到濃度為102°cfu/mL的植物乳桿菌懸浮液，然后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；同上方法，制備的濃度?02°cfu/mL豬霍亂沙門氏菌懸液，置于4°C冰箱中保存?zhèn)?用；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/L, pH 7. 4)中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙 門氏菌懸浮液，調(diào)整豬霍亂沙門氏菌的濃度為1012cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)?為200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具 體為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸 桿菌懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2， 瓊脂粉3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵 母精提物0. lg，蒸餾水lOOOmL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自淡水的蛭弧 菌BDF01 (于2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO =M 208008)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)20h，再在2°C，8000rpm 離心15min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，15000rpm離心22min，保留沉淀棄 去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 4的磷酸鈉鹽緩沖液，調(diào)整 蛭弧菌游泳體的濃度為106pfu/mL，得到蛭弧菌BDF01游泳體濃縮液，置于15°C冰箱保存?zhèn)?用；(3)蛭弧菌制劑的制備在磷酸鈉鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/L，pH 7. 6)，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得 到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的植物乳桿菌懸浮液和步驟(2) 制備的蛭弧菌BDF01游泳體濃縮液，發(fā)酵培養(yǎng)基中的植物乳桿菌的起始濃度為101(lCfU/mL， 蛭弧菌起始濃度為102pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C;加入植物 乳桿菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 4;設置 攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在30% ；培養(yǎng)過程中加兩次植物乳桿菌懸浮液，每次
23加入植物乳桿菌懸浮液的間隔時間18h，每次加入植物乳桿菌懸浮液的量以新加入的植物 乳桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為101QCfU/mL為準，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為5 X101Qpfu/ mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的豬霍亂沙門氏菌懸浮液和 步驟(2)制備的蛭弧菌BDFOl游泳體濃縮液，制得濃度為5 X IOuiPfuAiL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對大腸桿菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌等致病菌均有 裂解效果。分別以對無乳鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的裂解為例。配備4瓶各裝有50mL的磷 酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到無乳鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌的菌體沉 淀，每種菌兩瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(liTcfu/mL)。在兩瓶含有無乳鏈球菌的 緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶含有鼠傷寒沙 門氏菌的緩沖體系中，分別加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL,于30°C，200rpm的 搖床上培養(yǎng)。在011、611、1211、1811、2411、3011、3611、4211這九八個時刻分別取樣，按10-1 IO-10 的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下培養(yǎng)24h后， 計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖14所示。從圖14可知，與用豬霍亂沙門氏菌發(fā)酵的蛭弧菌制 劑B相比，用植物乳桿菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的鼠傷寒沙門氏菌有更 強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的無乳鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。另 外，由植物乳桿菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心，制 成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。實施例14分別以戊糖片球菌(菌種編號CGMCC 1. 2695，來源于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心)和大腸桿菌為宿主菌制備蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B，具體過程 如下(1)戊糖片球菌的制備將戊糖片球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g， PH 7. 4士0.2)中，置于32°C搖床中培養(yǎng)24h，使其處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在4°C條件下， 5000rpm離心20min，保留沉淀棄去上清液，往沉淀中加入磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0. 2mol/ L，pH 7. 5)，得到濃度為IO18CfuAiL的戊糖片球菌懸浮液，然后置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆?；同上方法，制備濃度為IO18CfuAiL的大腸桿菌懸液，置于8°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鉀鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH 7.5)中加入步驟⑴制備的大腸 桿菌懸浮液，調(diào)整大腸桿菌的濃度為1015cfu/mL，再接入用常規(guī)方法(根據(jù)申請?zhí)枮?200910042274. 6，名稱為“一種防治奶牛乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應用”的專利申請，具體 為采用Stolp和Petzhold的雙層平板法取0. 5mL蛭弧菌游泳體濃縮液和0. 5mL大腸桿菌 懸浮液混合，此混合液再與3-3. 5mL 50°C的DNB上層培養(yǎng)基(蒸餾水500mL，pH7. 2，瓊脂粉 3. 5g)混合均勻，傾注于DNB下層平板(營養(yǎng)肉湯0. Sg,酪氨酸酸水解物0. 5g，酵母精提物 0. lg，蒸餾水1000mL，pH7. 2，瓊脂粉17g)中并鋪平。將雙層平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，待含宿主菌的雙層瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑)培養(yǎng)出來的分離自海水的蛭弧菌BDJOl (于 2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M208011)斑，然后將此培養(yǎng)液在30°C培養(yǎng)60h，再在8°C，5000rpm離心30min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在4°C，16000rpm離心25min，保留沉淀棄去上清液，沉淀 為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入0. 2mol/L、pH 7. 5的磷酸鉀鹽緩沖液，調(diào)整蛭弧菌游泳體 的濃度為109pfu/mL，得到蛭弧菌BDJOl游泳體濃縮液，置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備在pH值為7. 2的DNB液體培養(yǎng)基中加入氯化鈉，氯化鈉的加入質(zhì)量為DNB液體培 養(yǎng)基體積的2. 5%，裝入發(fā)酵罐，121°C滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基 中加入步驟⑴制備的戊糖片球菌懸浮液和步驟⑵制備的蛭弧菌BDJOl游泳體濃縮液， 發(fā)酵培養(yǎng)基中的戊糖片球菌的起始濃度為1013cfu/mL，蛭弧菌起始濃度為103pfu/mL，進行 發(fā)酵；發(fā)酵各參數(shù)條件如下溫度控制在30°C ；加入戊糖片球菌懸浮液和蛭弧菌游泳體濃 縮液的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的PH值控制在7. 6 ；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水 平控制在25% ；培養(yǎng)過程中加3次戊糖片球菌懸浮液，每次加入戊糖片球菌懸浮液的間隔 時間12h，每次加入戊糖片球菌懸浮液的量以新加入的戊糖片球菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為IO13CfuAiL為準，發(fā)酵培養(yǎng)48h即制成濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑A。同樣方法，在30°C的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的大腸桿菌懸浮液和步驟 (2)制備的蛭弧菌BDJOl游泳體濃縮液，制得濃度為1 X 109pfU/mL的蛭弧菌制劑B。本蛭弧菌制劑A和蛭弧菌制劑B對乳房鏈球菌、沙門氏菌、豬鏈球菌II型等致病 菌均有裂解效果。分別以對乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型的裂解為例。配備4瓶各裝有 50mL的磷酸鈉鉀鹽緩沖液中，分別各加入常規(guī)培養(yǎng)方法得到乳房鏈球菌和豬鏈球菌II型 的菌體沉淀，每種菌2瓶，調(diào)節(jié)4瓶緩沖液的菌體濃度一致(IOltlCfuAiL)。在兩瓶含有乳 房鏈球菌的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL;同樣，在兩瓶 含有豬鏈球菌II型的緩沖體系中，分別各加入蛭弧菌制劑A ImL和蛭弧菌制劑B ImL，于 30°C，200rpm的搖床上培養(yǎng)。在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h這八個時刻分別取樣，按 ΙΟ"1 10,的稀釋倍數(shù)進行稀釋，再各取100 μ L的稀釋液分別進行平板涂布，30°C條件下 培養(yǎng)24h后，計算菌落數(shù)。實驗結(jié)果如圖15所示。從圖15可知，與用大腸桿菌發(fā)酵的蛭弧 菌制劑B相比，用戊糖片球菌發(fā)酵的蛭弧菌制劑A不僅對革蘭氏為陰性的豬鏈球菌II型有 更強的裂解效果，而且對革蘭氏為陽性的乳房鏈球菌的裂解效果也比蛭弧菌制劑B更好。 另外，由戊糖片球菌制得的蛭弧菌制劑A不僅可以直接制成制劑，也可通過進一步的離心， 制成單純的游泳體、蛭質(zhì)體制劑。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于包括以下步驟(1)宿主菌懸液的制備將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度，得到濃度為1017～1022cfu/mL的宿主菌懸浮液，然后置于2～15℃中保存?zhèn)溆茫?2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備在磷酸鹽緩沖液中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液，調(diào)整宿主菌的濃度為1010～1015cfu/mL，再接入蛭弧菌斑，然后將此培養(yǎng)液在20～40℃培養(yǎng)20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm離心15～35min，保留上清液棄去沉淀，然后將上清液在2～15℃，12000～20000rpm離心15～40min，保留沉淀棄去上清液，沉淀為蛭弧菌游泳體，在沉淀中加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛭弧菌游泳體的濃度為106～109pfu/mL，得到蛭弧菌游泳體濃縮液，置于2～15℃保存?zhèn)溆茫?3)蛭弧菌制劑的制備將氯化鈉溶于溶劑中形成質(zhì)量體積比濃度為0～30g/L的氯化鈉溶液，滅菌，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入步驟(1)制備的宿主菌懸浮液和步驟(2)制備的蛭弧菌游泳體濃縮液，使宿主菌起始濃度為1010～1015cfu/mL，蛭弧菌游泳體起始濃度為101～103pfu/mL，進行發(fā)酵；發(fā)酵溫度控制在28～30℃，pH值控制在7.2～7.6；設置攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，使溶氧水平控制在20％～30％；發(fā)酵過程中加1～3次宿主菌懸浮液，每次加入宿主菌懸浮液的間隔時間12～18h，每次加入宿主菌懸浮液的量以新加入的宿主菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1010～1015cfu/mL為準；發(fā)酵培養(yǎng)36～48h即制成蛭弧菌制劑；所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基、蒸餾水或磷酸鹽緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于步驟(1)所述宿 主菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)、兩歧雙歧 桿菌(Bifidobacterium bifidum)、獎腸球菌(Enterococcus faecalis)、{呆;!j口禾亞桿 菌(Lactobacillus bulgaricus)、季L酸片王求菌(Pediococcusacidilactici) >lif (Streptococcus lactis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum)或 戊糖片球菌(Pediococcus pentasaceus)；步驟(2)所述蛭弧菌為 BDF01、BDF02、BDF03、BDJ01、BDJ02、BDM01、BDS01、BDS02、 BDSM08 或 BDFM05。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于所述BDF01于 2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :M 208008 ；所述BDF02于2008年1月13日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208009 ；所述BDF03于2008年1月13日保 藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208010 ； 所述BDJ01于2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO :M 208011 ；所述BDJ02于2008年1月14日保藏于中國武漢市武漢 大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 208012 ；所述BDM01于2008 年4月28日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO :M 208066 ；所述BDS01于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209169 ；所述BDS02于2009年8月7日保藏于中 國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209170;所述 BDSM08于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC NO :M 209171 ；所述BDFM05于2009年8月7日保藏于中國武漢市武漢大學 內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 209172。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于步驟(1)所述 收集菌體的方式為通過離心分離得到，離心條件為2 15°C，5000 8000rpm離心15 35min ；所述宿主菌懸浮液的濃度為1017 1022cfu/mL ；步驟(1) (3)任一項所述磷酸鹽 緩沖液的濃度為0. 1 0. 3mol/L, pH為7. 2 7. 6 ；步驟(2)所述蛭弧菌游泳體濃縮液的 濃度為 108 1012pfu/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于步驟(3)所述蛭 弧菌來源于咸水環(huán)境時，所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基或蒸餾水，所述氯化鈉溶液的質(zhì)量體 積比濃度為25 30g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于步驟(3)所述蛭 弧菌來源于咸淡水環(huán)境時，所述溶劑為DNB液體培養(yǎng)基或蒸餾水，所述氯化鈉溶液的質(zhì)量 體積比濃度為5 10g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于步驟(3)所述蛭 弧菌來源于淡水環(huán)境時，不加氯化鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛭弧菌制劑的發(fā)酵方法，其特征在于步驟(3)所述滅 菌的條件為121°C滅菌20min ；所述蛭弧菌制劑的濃度為108 1012pfu/mL ；所述DNB液體培 養(yǎng)基是將營養(yǎng)肉湯0. 8g、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精提物0. lg溶于1000mL蒸餾水中， 調(diào)節(jié)pH值至7. 2 7.6。
9.一種蛭弧菌制劑，由權(quán)利要求1 8任一項所述方法制備得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛭弧菌制劑應用于制備防治病菌害藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛭弧菌制劑及其發(fā)酵方法和應用。發(fā)酵方法包括以下步驟(1)宿主菌懸液的制備；(2)蛭弧菌游泳體濃縮液的制備；(3)蛭弧菌制劑的制備。本發(fā)明所述的發(fā)酵方法中采用的宿主菌均為有益的或?qū)Νh(huán)境無害的革蘭氏陽性菌，既可以保持、甚至提高蛭弧菌裂解一些革蘭氏陰性菌的能力，用該方法制得的蛭弧菌制劑對致病菌的裂解能力有了一定的提高；所制得的蛭弧菌制劑又可以直接使用，無需經(jīng)過更多的發(fā)酵后處理，該制劑的使用范圍也大大的增加。本發(fā)明在得到高濃度蛭弧菌菌液的同時，相對也縮短了發(fā)酵周期，這樣有效的解決了發(fā)酵時間過長而導致的能源消耗過大，生產(chǎn)成本過高的問題，得到的蛭弧菌制劑不僅成本低，而且活性高。
文檔編號A61K35/74GK101948784SQ20101027077
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者蔡俊鵬, 陳小紅 申請人:華南理工大學